CC BY
8
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVIII, № 2, 2022
Д.В. Карпенко1, А.Е. Бигильдеев! А.С. Артюхов2
ВЫЖИВАНИЕ НЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК СТРОМЫ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ КРОВЕТВОРНОЙ ТЕРРИТОРИИ IN VIVO У МЫШЕЙ
гФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
2РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Москва
Введение. Основными моделями для изучения мезенхим-ных стволовых клеток (МСК) костного мозга (КМ) являются длительные культуры костного мозга (ДККМ) декстеровского типа, метод формирования очагов эктопического кроветворения (ОЭК) и колониеобразующие единицы фибробластные (КОЕф) - ближайшие из известных потомков МСК. Считается, что после имплантации стромального подслоя ДККМ под капсулу почки исключительно МСК формируют строму ОЭК de novo, дифференцированные стромальные клетки нетранспланта-бельны, а кроветворные клетки ОЭК принадлежат только реципиенту. Комбинация классических и современных методов позволяют получить новые данные о функциях МСК.
Цель. Оценить количество индивидуальных МСК и их про-лиферативную активность, а также их потомков, при построении кроветворной территории ОЭК.
Материалы и методы. ДККМ (n = 10) из КМ бедра мыши F1^BA х C57B1/6) трансдуцировали самоинактивирующим-ся лентивирусным вектором системы LeGO на основе HIV-1. Случайные сайты интеграции (СИ) провирусов являются уникальными для клетки генетически наследуемыми маркерами. Трансдуцированные стромальные подслои ДККМ имплантировали под капсулу почки сингенным реципиентам. Из фрагментов ОЭК, полученных спустя 42 дня, сажали КОЕф, оценивали эффективность маркирования исходных ДККМ и КОЕф с помощью ПЦР. Из ДНК ОЭК таргетно, с использованием ПЦР готовили библиотеки для секвенирования СИ на Illumina MiSeq (NGS). Биоинформатической анализ проводили с помощью оригинального алгоритма на языке Python, картирование СИ было выполнено с применением инструмента NCBI BLAST.
Результаты. Среднее количество провирусов на клетку в ДККМ составило 1,6 ± 0,2. Однако ни одна из 309 КОЕф из 10 ОЭК не была маркирована согласно данным цифровой ПЦР. Это подтверждается NGS-анализом, который показал, что наиболее крупных маркированных клонов, соответствующих 40-100 клеткам, было 10 из 2165 во всех исследованных образцах. Это означает, что активно делящиеся клетки, а значит и их предшественники, не были эффективно заражены. Кроме того, ретроспективный анализ показал схожую картину эффективной трансдукции стромального подслоя ДККМ и КОЕф из него, но низкую долю зараженных КОЕф, следовательно, и МСК в ОЭК, сформированных из таких ДККМ. Таким образом, применение
лентивирусных векторов системы LeGO является неэффективным для маркирования МСК. Регистрируемые маркированные клетки соответствуют не стволовым стромальным клеткам, которые переживают процедуру имплантации. Доля таких клеток от всех стромальных клеток ОЭК оценивается в среднем как 30% (диапазон значений 5% - 72%). Картирование прочтений NGS показало, что СИ распределены по всему геному мыши, с небольшими преференциями к областям генов. Задача анализа индивидуально меченных клеточных клонов на уровне отдельных клеток подразумевает строгий контроль маркирования индивидуальных молекул, поступающих в анализ, и их кластеризации. Это осложняется наличием стадий ПЦР в самой платформе Illumina и при пробоподготовке. Так анализ данных показал значительное содержание ошибок копирования и химерных прочтений (index hopping), возникновение которых неизбежно при ПЦР. Их наличие заметно запутывает данные, а их эффективное отсеивание требует предусмотрения их идентификации и введения соответствующих меток в библиотеку на стадии дизайна эксперимента. В процессе работы разработана оригинальная методика (пайплайн) для анализа СИ и сформулированы ключевые замечания по улучшению протоколов исследований индивидуально маркированных клеток. Использование цифровой ПЦР при анализе эффективности маркирования имеет значительное преимущество над ПЦР в реальном времени и тем более традиционной гнездовой ПЦР, а в случае применения последних необходимо учитывать возможность поднятия сигнала с индивидуальных молекул.
Выводы. Результаты показывают, что при формировании кроветворной территории de novo в месте имплантации КМ выживают не стволовые клетки трансплантируемой стромы, которые составляют порядка 30% стромы ОЭК. Эффективность заражения МСК в составе подслоя ДККМ заметно ниже, чем эффективность заражения КОЕф и более дифференцированных стромальных клеток. Это может быть обусловлено совокупностью молекулярных процессов, которые определяют стволовый статус клетки. Целесообразен дальнейший поиск стратегий эффективного индивидуального маркирования МСК. NGS анализ интеграций лентивекторов третьего поколения системы LeGO не выявил наличия горячих точек интеграции в геноме.
Часть работы по биоинформатическому анализу поддержана грантом РНФ № 22-25-00459
Д. В. Карпенко, Н. М. Капранов, А. Е. Бигильдеев
МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА СОХРАНЯЮТ СВОЮ ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИММУНИТЕТА В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ МЫШАХ НЕСМОТРЯ НА НАЛИЧИЕ КСЕНОГЕННОГО МАРКЕРА
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Введение. До настоящего времени не было представлено прямых доказательств того, что мезенхимные стволовые клетки (МСК) костного мозга (КМ) обладают иммунными привилегиями. Эксперименты на иммунокомпетентных мышах показали угасание сигнала генетически флуоресцентно меченных аллогенных МСК, введенных внутрибрюшинно, на 20-й день. В большинстве клинических исследований с использованием
мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) донорские аллогенные ММСК или не обнаруживаются вовсе, или обнаруживаются в течение короткого времени. В подтверждение предположения об иммунных привилегиях, присущих МСК, говорят результаты по введению аллогенных МСК в костную полость у крыс и внутрикостному введению аллогенных ММСК человеку: в этих исследованиях установлено длитель-
ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ «АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ», ПОСВЯЩЕННАЯ 90-ЛЕТИЮ РОССИЙСКОГО НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ИНСТИТУТА ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ
Санкт-Петербург 30 июня - 1 июля 2022 г.
ное присутствие аллогенных клеток в месте введения. Однако эти работы проводились на реципиентах, у которых на момент инъекции клеток иммунитет был подавлен, а функциональный анализ МСК не проводился, поэтому они не могут быть строгим доказательством. Несмотря на имеющиеся противоречия, МСК считаются иммунопривилегированными стволовыми клетками.
Цель. Получение прямых экспериментальных свидетельств того, что МСК костного мозга, маркированные ксеногенным белком, являются иммунопривилегированными in vivo и сохраняют свою функциональность после длительного воздействия иммунной системы.
Материалы и методы. КМ трансгенных мышей линии Nestin-GFP имплантировали в виде фрагмента ткани под капсулу почки изогенным иммунокомпетентным реципиентам линии C57Black/6 (n = 14) для формирования очагов эктопического кроветворения. Nestin-GFP мыши были предоставлены исследовательским фондом государственного университета Нью-Йорка. Линия Nestin-GFP характеризуется усиленным зеленым флуоресцентным белком (eGFP) под регуляторными элементами гена Nes, что обеспечивает флуоресцентный иммуногенный маркер для небольшой фракции клеток КМ, включая CD45-Nes-GFP+ МСК. Через 42 дня после имплантации трансгенного КМ у части реципиентов (n = 8) оценивали наличие первичных очагов, выделяли клетки внутренней клеточной массы очагов. Клетки окрашивали моноклональными антителами против CD45, ядерным красителем Syto41, а также интеркалирующим ДНК красителем 7-AAD для исключения клеток с нарушенной целостностью поверхностной мембраны. С помощью многоцветной цитофлуорометрии измеряли долю CD45-Nes-GFP+ и
CD45+Nes-GFP+ клеток среди ядерных живых клеток. Остальные первичные очаги (п = 6) ретрансплантировали вторичным реципиентам линии Nestm-GFP. Вторичные очаги анализировали аналогично первичным.
Результаты. Несмотря на воздействие иммунитета, первичные очаги эктопического кроветворения сформировались. В них были обнаружены как CD45-Nes-GFP+, так и CD45+Nes-GFP+ клетки. Доля CD45-Nes-GFP+ клеток составила 1,6 х 10-5 (среднее геометрическое со стандартной ошибкой в 2,4 раза). Не было установлено статистически значимых отличий от син-генного контроля трансплантации в Nestin-GFP реципиентов, где доля таких клеток составила 1,2 х 10-5 (среднее геометрическое со стандартной ошибкой в 1,9 раза). Вторичные очаги также сформировались. В них доля CD45-Nes-GFP+ клеток составила 12 х 10-5 (среднее геометрическое со стандартной ошибкой в 1,5 раза), что не имело статистически значимых отличий от интактного КМ Nestin-GFR
Выводы. Согласно современным представлениям, иммунная система реципиентов должна была элиминировать клетки eGFP+, включая все Nes-GFP+ МСК. Эти результаты показывают, что МСК, маркированные ксеногенным белком, уклоняются от иммунных реакций. Результаты демонстрируют способность МСК к самообновлению и сохранению своей функциональности после длительного воздействия иммунитета, несмотря на наличие ксеногенного маркера. Успех этого исследования, вероятно, обусловлен имплантацией цельного фрагмента КМ без предварительной диссоциации клеток и того факта, что подавляющее большинство клеток были иммунологически эквивалентны клеткам реципиента.
Работа поддержана грантом РНФ № 22-25-00459.
1А.Н. Кириенко, iE.B. Мотыко, 1Д.В. Кустова, iE.B. Ефремова, 3Е.В. Морозова, 2Д.И. Шихбабаева, 2О.Ю. Виноградова, iB.A. Шуваев, iC.B. Волошин, C.B. 1Сидоркевич, 1И.С. Мартынкевич
СЕКВЕНИРОВАНИЕ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ (NGS) В ДИАГНОСТИКЕ, ОПРЕДЕЛЕНИИ ПРОГНОЗА И ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ У PH-НЕГАТИВНЫХ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ МИЕЛОИДНЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ
гФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург;
2ГБУЗ Городская клиническая больница имени С.П. Боткина Департамента здравоохранения города Москвы, Москва; 3Научно-исследовательский институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии имени Р. М. Горбачевой, Санкт-Петербург
Введение. За последнее десятилетие высокопроизводительное секвенирование (NGS) расширило наши представления о геномном ландшафте гематологических злокачественных новообразований. Обнаруженные при NGS новые биомаркеры сегодня широко используются в клинической практике для улучшения диагностики, стратификации больных в прогностические группы и выборе современной, в том числе таргетной, терапии у Ph-негативных пациентов с МПН.
Цель. Оценить возможности использования NGS технологии в диагностике и определении прогностических особенностей течения заболевания у Ph-негативных пациентов с МПН.
Материалы и методы. В пилотное исследование включены 36 пациентов (17 мужчин и 19 женщин) в возрасте от 27 до 79 лет (медиана Me=55 лет). Диагноз МПН (ИП, ЭТ, ПМФ, мДс, ОМЛ), не ассоциированный с филадельфийской хромосомой (Ph- МПН), был ранее установлен у всех 36 больных. У 20 из 36 исследованных пациентов (55%), у которых при цито- и молеку-лярно-генетической диагностике определен нормальный кари-отип, не обнаруживались драйверные в генах CARL, MPL, JAK2 и другие соматические мутации, NGS исследование проводилось с целью установления клональной природы заболевания. Вместе с этим у всех больных NGS анализ позволил выявить дополнительные прогностически значимые мутации. У всех пациентов секвенирование выполнялось с использованием миелоидной панели из 116 генов со средней глубиной прочтения 200х или
1000х на приборе MiSeq (Illumina). При анализе полученных данных применялся 3% порог частоты встречаемости аллеля (VAF). Клиническая значимость мутаций устанавливалась по базам данных COSMIC и ClinVar.
Результаты. В ходе выполнения NGS анализа были выявлены генетические аномалии у всех исследуемых пациентов, в среднем определялись 10 мутаций (от 4 до 43 у одного больного). При этом мутации соматической природы выявлены в 92% случаев (33/36) в количестве от 1 до 13 (в среднем 4 мутации у одного пациента). В 70% исследуемых проб (25/36) обнаруживались от 1 до 3 мутаций с известной клинической значимостью. У всех больных из группы без драйверных и соматических мутаций, без хромосомных аберраций с использованием дополнительного метода исследования NGS были найдены соматические мутации (как клинически значимые, так и c неизвестной клинической значимостью), что позволило подтвердить клональность заболевания. Для уточнения прогноза заболевания все пациенты были разделены на две группы - с благоприятным (пациенты с драйверными мутациями (16/36), нормальным кариотипом) и неблагоприятным прогнозом течения заболевания (с тринегативным мутационным статусом (20/36), с мутациями в генах эпигенетической регуляции (4/36)). У 8/16 (50%) пациентов с драйверными мутациями в генах CALR и JAK2 наблюдались дополнительные мутации в генах эпигенетической регуляции (ASXL1, EZH2, IDH1), у 3/16
