CC BY
66
УДК 535.65.088.3
СЕГМЕНТАЦИЯ В КОМПЬЮТЕРНОЙ ЦИТОФОТОМЕТРИИ
Ирина Георгиевна Пальчикова
Конструкторско-технологический институт научного приборостроения СО РАН, 630058, Россия, г. Новосибирск, ул. Русская, 41, доктор технических наук, зав. лабораторией; Новосибирский государственный университет, 630090, Россия, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2, тел. (383)306-58-74, e-mail: palchikova@gmail.com
Александр Александрович Конев
Конструкторско-технологический институт научного приборостроения СО РАН, 630058, Россия, г. Новосибирск, ул. Русская, 41, ведущий программист, тел. (383)306-62-20, e-mail: lexykonev@yandex.ru
Евгений Сергеевич Смирнов
Конструкторско-технологический институт научного приборостроения СО РАН, 630058, Россия, г. Новосибирск, ул. Русская, 41, младший научный сотрудник, тел. (965)823-23-75, e-mail: the-first-person@yandex. ru
Рассмотрены особенности работы двух алгоритмов сегментации применительно к цифровым изображениям, моделирующим пропускание препаратов клеточных ядер с дифракционным размытием, окрашенных по Фёльгену. Методом вычислительного эксперимента найдено, что количественные показатели морфометрического анализа микроизображений, определённые различными алгоритмами сегментации, могут варьироваться в пределах 5 %.
Ключевые слова: цифровое изображение, микроскоп, сегментация, пиксель.
IMAGE SEGMENTATION IN THE COMPUTER CYTOPHOTOMETRY
Irina G. Palchikova
Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 630058, Russia, Novosibirsk, 41 Russkaya St., Sc. D., Laboratory Head; Novosibirsk State University, 630090, Russia, Novosibirsk, 2 Pirogova St., Physical Department, tel. (383)306-58-74, e-mail: palchikova@gmail.com
Alexander A. Konev
Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences 630058, Russia, Novosibirsk, 41 Russkaya St., Leading Programmer, tel. (383)306-62-20, e-mail: lexykonev@yandex.ru
Evgenii S. Smirnov
Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences 630058, Russia, Novosibirsk, 41 Russkaya St., Junior Researcher, tel. (965)823-23-75, e-mail: the-first-person@yandex.ru
Features of action of two image segmentation procedures are considered by applying to digital images, which simulate the transmission of the cells nuclei, dyed by Felgen, with the diffraction bluring. It is found by computing experiment that the quantitative indices of the morphometric analysis of microimages defined by the various image segmentation procedures can vary in the range of 5 %.
Key words: the digital image, microscope, segmentation, pixel.
Цитологическая диагностика [1] является основным средством раннего распознавания организменных изменений на клеточном уровне. Она решает задачи оценки структурных и функциональных признаков клеток и ядер, в частности, - задачу регистрации распределения хроматиновых субстанций интерфазного ядра. На ранней стадии развития цитофотометрические методы включали: метод сканирования, двух и много волновой методы, фотоэмульсионный и интегральный методы. Альтернативным и более перспективным подходом в этой области может оказаться аппаратура, использующая цифровую технику [2, 3]. Развивая этот подход, мы стали использовать современные камеры с повышенной дигитализацией, разработали способы калибровки цитофо-тометрической установки и учёта блика оптики, что позволило по точностным характеристикам метода определения содержания ДНК в ядрах приблизиться к лучшим мировым показателям [3, 4].
Объективизация заключения по цитологической картине возможна путём отображения описания на количественные показатели, которые подразделяются на два типа: оптические (коэффициенты пропускания, фон препарата, окраши-ваемость, чёткость границ) и геометрические (размеры и формы клеток и ядер). Такого рода обработка и анализ цифрового микроизображения предполагают определение геометрических областей, отличающихся средней яркостью, отнесение каждой из них к определённому виду и количественный подсчёт её геометрических характеристик. То есть сегментация цифрового микроизображения является необходимой процедурой при выполнении количественного описания цитологических препаратов. Одной из особенностей изображений, получаемых в микроскопе, является сильное дифракционное размытие границ. Анализу дифракции в микроскопе посвящён целый ряд работ [5, 6, 7]. В компьютерной ци-тофотометрии особый интерес приобретает рассмотрение вклада дифракционного размытия в погрешности вычисления интегральной оптической плотности ядра [7] и его геометрических характеристик, которые в свою очередь, определяются алгоритмами обработки цифровых микроизображений. Цель настоящей работы состоит в выявлении и рассмотрении особенностей работы двух алгоритмов сегментации применительно к цифровым изображениям с дифракционным размытием границ, моделирующим пропускание препаратов клеточных ядер, окрашенных по Фёльгену.
Для реализации компьютерной цитофотометрии нами разработан специализированный программный пакет ImgCyto для математической обработки берутся сырые файлы, полученные непосредственно с камеры цитофотометриче-ской установки. Программа ImgCyto выполняет оптико-структурный анализ микроизображений клеточных ядер на препаратах, окрашенных по Фёльгену, и организует базу данных характеристик изображений клеточных ядер в виде Excel таблицы. За один сеанс программой ImgCyto обрабатывается серия снимков. Каждый снимок может содержать как одно ядро, так и несколько ядер. Результаты обработок всех ядер со всех снимков из серии записываются в одну результирующую Excel таблицу. Главное окно программы ImgCyto показано на рис. 1. Рассчитываются следующие характеристики ядер: периметр и площадь;
интегральная оптическая плотность; площадь, занимаемая диффузным хроматином; площадь, занимаемая компактным хроматином; количество диффузного хроматина; количество компактного хроматина; суммарный периметр гетерохроматиновых структур; коэффициент округлости ядра; средняя оптическая плотность диффузного хроматина; средняя оптическая плотность компактного хроматина. Программа предназначена для использования в клинических и биологических лабораториях в процессе проведения цитофотометрических анализов. В ходе вычислительных экспериментов сравнивались результаты пороговой сегментации, выполняемой, во-первых, с помощью алгоритма кластеризации Оцу [8] и, во-вторых, локального алгоритма путём вычисления первой и второй производных [9] в пикселях изображения.
В /-алгоритме Оцу [8] порог сегментации выбирается путем анализа гистограммы распределения значений яркости в пикселях цифрового полутонового изображения. Если на гистограмме выделить две области так, что каждая из этих областей была наиболее компактна, то граница между этими областями на гистограмме будет наилучшим порогом между фоном и объектом на изображении. /-алгоритм ищет порог так, чтобы взвешенная сумма дисперсий двух областей была минимальной. Алгоритм Оцу чувствителен к однородности фона.
Рис. 1. Главное окно программы /ш^Су^в
Во //-алгоритме определение порога на основе градиента яркости [9] осуществляется путём пространственной фильтрации изображения с помощью соответствующих пространственных масок. По сути дела измеряется взвешенная сумма разностей значений центрального пикселя маски и его 8-ми соседей. Граница ядра устанавливается линиями, в пикселях которых обнаруживается максимальный градиент яркости.
В вычислительных экспериментах использовались два типа тестовых объектов: I тип - это разработанные нами ранее [7] тестовые объекты для цитофо-тометрии, показанные на рис.2, II тип - изображения с перепадами яркости, моделирующими дифракционное размытие, и построенные с помощью среды программирования MathCad. Объект I типа представляет собой стеклянную пластинку, покрытую слоем хрома. Пропускание подложек варьируется в пределах 0,1 - 0,9. На поверхности хрома нанесены тестовые фигуры в виде наборов кружков и квадратов, с одинаковыми размерами в каждом наборе (например, в области {7,2}). Характерные размеры фигур в областях: 3, 5, 7, 9, 11, 22 мкм. Цифровые изображения в виде RAW-файлов получали на установке компьютерной ци-тофотометрии [3] с микрообъективами план-ахромат 40х, NA 0,65 и 10х, NA 0,25.
Проводилась обработка изображений тестовых объектов с помощью программы ImgCyto с использованием I-алгоритма. Геометрические характеристики более чем 300 фигур, полученные в ходе обработки, были сравнены с их характеристиками (размер, периметр и площадь фигуры), найденными с помощью II-алгоритма. Оба алгоритма дают близкие значения для оценки периметра и площади (выборочные данные см. в табл. 1). Размеры фигур, найденные с использованием I-алгоритма, на ~ 3 - 5% отличаются от найденных с использованием II-алгоритма. Проведённые расчёты выявили существенное влияние размера пикселя в цифровом изображении на результаты. Граничные пиксели учитываются при расчёте площади фигуры с весовым коэффициентом 0,5. Размер стороны квадрата оценивается из рассчитанного периметра и площади фигуры по классическим формулам, в то время как в изображении на контурах все углы сглажены, что вносит определённую ошибку. Численные данные для набора квадратов (области {7,2} на рис. 2) приведены в табл.
Тестовые объекты II типа строились средствами MathCad как монохромные цифровые изображения квадратов формата TIFF 16 бит. Перепад яркости на границах квадрата от 128 до 255 градаций (что соответствует 50% пропускания света биологическими препаратами) моделировал дифракционное размытие края изображения квадратного объекта, получаемого в микроскопе с объективом 10х, NA 0,25 (или 40х, NA 0,65). Размытие рассчитывалось численно в дифракционном приближении Френеля [7] в некогерентном случае, исходя из заданных значений размера объекта в пространстве предметов, увеличения и апертуры объектива, длины световой волны. Расчёты показали, что точка перегиба находится на уровне интенсивности 0,495 от максимальной, в то время как граница геометрооптического изображения - на уровне 0,497. Разница составила 0,4%. Далее мы учитывали тот факт, что фото-
Рис. 2. Микрофотография фрагмента специального тестового объекта для ци-тофотометрии. Размер объекта: 2x3 мм
матрица в микроскопе регистрирует распределение световой интенсивности и на выходе камеры синтезируется цифровое изображение, сигналы в котором усреднены по поверхности каждого фотоэлемента. Цифровое изображение (тестовый объект II типа) рассчитывалось путем наложения двумерной матрицы «псевдопикселей» (с размером каждого «псевдопикселя» 5,2*5,2 мкм) на двумерную матрицу рассчитанных с шагом 0,2*0,2 мкм значений интенсивности в изображении квадратного объекта с последующим усреднением интенсивности по каждому «псевдопикселю». То есть осреднение производилось по 26*26 рассчитанным значениям интенсивности. Количество значений для осреднения (26*26) выбиралось из условия согласования с размером «псевдопикселя», который является характерным для микроскопических камер.
Таблица
Средние значения характеристик фигур и коэффициенты вариации
И-алгоритм !-алгоритм
Темные квадраты на белом фоне (области {7,2} на рис.2)
Периметр, мкм 37 33,076
Площадь, мкм2 85 77,75
Размер стороны, мкм 8,9 8,3 8,8
Коэффициент вариации, % 0,3 0,5 1,0
Внешний вид одного из объектов II типа представлен в верхней части рис. 3, распределение интенсивности в его поперечном сечении - в нижней его части. Выбор объекта основывался на опыте работы с препаратами крови различных биологических видов. На рис. 4 даны фотография ядра в препарате крови Яапа ЛтаНз и распределение интенсивности в его поперечном сечении. Перепад яркости на границе соответствует дифракционному.
Ряд объектов II типа, рассчитанных с 10 (и 40) кратным увеличением для квадратных объектов со сторонами 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 3; 5; 7; 9; 11 и 22 мкм в пространстве предметов, использовался для испытания работы алгоритмов и выявления влияния пространственной дискретизации (конечного размера элементов фотоматрицы или «псевдопикселей» цифрового изображения) на достоверность определения характеристик клеточных ядер. Качество передачи мелких деталей изображения определяется частотой Найквиста. Для цифровых микроскопных изображений частота Найквиста в координатном пространстве предмета рассчитывается как АУ(4*7У/4) и равна 0,56 мкм/пиксель (с микрообъективом 10*, ЫЛ 0,25) или 0,21 мкм/пиксель (с микрообъективом 40*, ЫЛ 0,65). Пересчёт размеров пикселей фотоматрицы в обратном ходе лучей относительно построения изображения дает величины 0,52*0,52 мкм/пиксель (с микрообъективом 10*, ЫЛ 0,25) или 0,13*0,13 мкм/пиксель (с микрообъективом 40*, ЫЛ 0,65). То есть критерий Найквиста выполняется и дискретизация не ограничивает качество визуального изображения.
Методом вычислительного эксперимента мы выявили влияние дискретизации на результаты расчёта периметра, площади и размеров тест-объектов II типа. На рис. 5 в виде графиков приведены результаты обработки ряда тест-объектов по И-алгоритму ряда тест-объектов, рассчитанных с увеличением 10*.
Рис. 3. Объект II типа, моделирующий увеличенное (40х) изображение квадрата со стороной 22 мкм
-0,9 -0,45 0 0,45 Координата, мм Рис. 4. Фотография ядра в препарате крови Rana Arvalis и распределение интенсивности в его поперечном сечении
50 45 ^.40
В
в
3 jj
я
а
а. 30
я а
и 25 в
в 20
В"
f 15
■е-
S ю ы
5
0
0,3
10,66
¿Г*
6,5 ^а
4 42^
* 2 34 & (f
1,3, ff
о < )00*00 ~ 0,78/ -ю'
0,6
9,6
19,2
- 4,8
19,2
9,6
Е а Е
2,4 q
1,2
0,6
0,
1,2 2,4 4,8 Сторона квадрата, мкм Рис. 5. Графики зависимостей вычисленных размеров В (линия -о-) и величин коэффициентов их вариации (линия -♦-) от заданных размеров
для ряда объектов II типа
По оси абсцисс отложен размер стороны тестового квадрата в предметной плоскости в логарифмическом масштабе. По правой оси ординат - вычисленный размер стороны В в логарифмическом масштабе, соответствующий график обозначен маркерами -о-, рядом с которыми надписаны значения величины. По левой оси ординат отложены величины коэффициентов вариации в линейном масштабе, соответствующий график маркирован ♦. Коэффициент вариа-
ции имеет значение 23,9% для квадратов, сторона которых менее 2 пикселей. Пик на графике для коэффициента вариации достигает 46,2% и находится в точке, где сторона квадрата увеличивается ещё на 1 пиксель. При дальнейшем увеличении размера стороны погрешность измерения стремится к нулю. Коэффициент вариации становится менее 10% для стороны 5 мкм (8 пикселей), и менее 1% - 26,7 мкм (50 пикселей). То есть, если размеры тестового квадрата близки или меньше размера кружка Эйри, то вносится дополнительная ошибка в вычисления, связанная с дискретизацией (с размером пиксела фотоматрицы). Обработка тест-объектов II типа с применением I-алгоритма дала аналогичные результаты. Мы привели и обсудили результаты для 10х объектива в виду их наглядности. Обычно применяются объективы с увеличением 40 х и более, которые демонстрируют, по крайней мере, на порядок меньшие величины коэффициентов вариации.
Тестирование II-алгоритма определения порога сегментации на основе градиента яркости с помощью объектов с дифракционным перепадом яркости показало возможность достоверной оценки размеров объектов с высокой точностью, ограниченной размером приёмного пиксела, что позволяет считать данный способ опорным.
Авторы благодарят сотрудников Медицинского университета (НГМУ, г. Новосибирск) д.м.н., проф. Н. Т. Ясакову и В. Е. Гарного за плодотворные обсуждения результатов работы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Агроскин Л. С., Папаян Г. В. Цитофотометрия. Аппаратура и методы анализа клеток по светопоглощению. Л.: Наука, 1977. 295 с.
2. Puech, M., Giroud, F. Standardisation of DNA Quantitation by Image Analysis: Quality Control of Instrumentation // Cytometry. 1999. - V.36. - P. 11 - 17.
3. Пальчикова И. Г., Омельянчук Л. В., Пальчиков Е. И., Смирнов Е. С., Семешин В. Ф. Особенности применения цифровых камер для цитофотометрического определения количества ДНК в ядрах клеток // Датчики и системы. - 2012. - № 3. - С. 2-12.
4. DNA Feulgen cytophotometry and chromatin diminution / I.G. Palchikova, E.V. Ivankina, V.F. Semeshin, L.V.Omelyanchuk, I.F. Zhimulev, E.S. Smirnov // Intern. Multidisciplinary Microscopy Congress (InterM-2013) (Antalya, Turkey, 10-13 Oct., 2013) : Springer proc. in physics. -2014. - V. 154. - Chap. 33. - P. 233 - 239.
5. Nyyssonen, D. Linewidth measurement with an optical microscope: the effect of operating conditions on the image profile // Appl. Opt. - 1977. - V.16. - N.8. - P. 2223 - 2230.
6. Haroske, G., Meyer, W. D., Theissig, F., Kunze, K. D. Increase of precision and accuracy of DNA cytometry by correcting diffraction and glare errors // Analytical cillular pathology. - 1995. - Vol.9. - Issue 1. - P. 1 - 12.
7. Пальчикова И. Г. Омельянчук Л. В., Смирнов Е. С. О влиянии дифракции на результаты количественной цитофотометрии // Автометрия. - 2012. - Т. 48. - № 6. - С. 92-101.
8. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms // IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 1979. - Vol. 9. - No. 1, - P. 62 - 66.
9. Гонсалес Р., Вудс Р. Цифровая обработка изображений. М.: Техносфера, 2012. -1104 с.
© И. Г. Пальчикова, А. А. Конев, Е. С. Смирнов, 2015
