CC BY
62
ОСОБЕННОСТИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА МИКРОИЗОБРАЖЕНИЙ КЛЕТОК
Ирина Георгиевна Пальчикова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Конструкторско-технологический институт научного приборостроения СО РАН, 630058, г. Новосибирск, ул. Русская, 41, доктор технических наук, профессор, заведующая лабораторией лазерных прецизионных систем, тел. 8 (383) 306-58-74, e-mail: palchikova@tdisie.nsc.ru
Евгений Сергеевич Смирнов
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2, аспирант кафедры квантовой оптики, тел. (901) 45-212-41, e-mail: the-first-person@yandex.ru
Использование микроизображений, полученных с помощью светового микроскопа, для количественного анализа биологических образцов требует понимания следующего: особенностей источников света, взаимодействия света с изучаемым образцом, характеристик современной микроскопной оптики, характеристик современных электрооптических сенсоров (в частности. ПЗС и КМОП камер), а так же надлежащего использования алгоритмов для восстановления, сегментации и анализа цифровых изображений. Все эти составляющие являются обязательными, если необходимо корректно выполнить измерение «аналоговых» величин, представленных в формате цифрового изображения. В докладе рассматриваются некоторые из указанных вопросов в деталях, поскольку они существенно влияют на процесс в целом и позволяют понять его ограничения.
Ключевые слова: цитофотометрия, цифровые микроизображения, калибровка. FEATURES OF THE QUANTITATIVE ANALYSIS OF MICRO-IMAGES OF CELLS
Irina G. Palchikova
Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering, Siberian Branch RAS,
41, Russkaya str., Novosibirsk 630058, Head of Laboratory for precision laser systems, Ph.D., tel. 8 (383) 306-58-74, e-mail: palchikova@tdisie.nsc.ru
Eugene S. Smirnov
Novosibirsk State University, 2, Pirogova str., Novosibirsk 630090, graduate student, Department of quantum optics, tel. (901) 45-212-41, e-mail: the-first-person@yandex.ru
The use of micro-images for the quantitative analysis of specimens requires an understanding of the following: light sources peculiarities, the interaction of light with the studied specimen, the characteristics of modern microscope optics, the characteristics of modem electro-optical sensors (in particular, CCD and CMOS cameras), and the proper use of algorithms for the restoration, segmentation, and analysis of digital images. All of these components are necessary if one is to achieve the accurate measurement of “analog” quantities given a digital representation of an image. In this report several of these issues in detail as they provide important insights into the process in general are considered.
Key words: micro-image, microscope optics, the algorithm, measurement algorithm.
Цитофотометрическое определение количества ДНК в клетке, окрашенной по Фельгену, является одним из фундаментальных методов цитохимии и широко используется в биологии и медицине. В основе этого метода лежит стехиометрическое связывание фуксинсернистой кислоты с альдегидными группами, возникающими в результате кислотного гидролиза оснований ДНК. Дальнейшая оценка света, поглощенного окрашенными структурами, позволяет судить о содержании в них ДНК. Очевидным достоинством этого метода является возможность анализа малых групп клеток, детектируемых на препаратах in situ. Мы модифицировали [1] известный денситометрический метод [2], заменив фотоэмульсионное детектирование света (или фотокатодное в интегральном методе) регистрацией изображения с помощью цифровой фотоматрицы с повышенной дигитализацией.
Процедура подготовки препаратов для цитофотометрии в видимой области спектра достаточно подробно описана [2] и стандартизована. Цитофотометрическое устройство должно включать в себя: 1. обычный микроскоп, 2. цифровую камеру (со встроенным АЦП), фотоматрица которой помещается в плоскость промежуточного изображения или изображение строится на ней с помощью дополнительного объектива, 3. компьютер для накопления и обработки данных и 4. соответствующее программное обеспечение. На рис. 1 приведена фотография разработанного цитофотометрического устройства на основе микроскопа DIALUX 20 EB. Микроскоп оснащен галогенным осветителем (лампа 12В, 50 Вт) и лазерной приставкой. Для получения качественного изображения в задачах цитофотометрии достаточно использовать безиммерсионный микрообъектив-планапохромат 40х, NA 0,5. Измерения проводились при максимально закрытых полевой и апертурной диафрагмах с использованием интерференционного светофильтра, пропускающего свет с длиной волны 551 ± 10 нм.
Щ Ш 1 /V
А —-Wr -ЯК ш ll ш. 1 - 1 ^ ’ ^ ~—
Рис. 1. Фотография разработанного цитофотометрического устройства
Цитофотометрия ядер клеток осуществляется по следующему алгоритму [1]. Регистрируются два изображения с одинаковыми параметрами камеры, соответствующем линейному участку передаточной характеристики устройства. Для устранения «блика оптики» в микроскопе разработан контрольный объект, состоящий из микрокусочков китайской туши, заключенной в канадский
бальзам. Изображение 1 - это изображение кусочка китайской туши, размеры которого превышают размеры фотометрируемых ядер. Ядра клеток помещаются в ту же самую часть поля зрения микроскопа, в котором ранее был снят контрольный объект, и регистрируется изображение 2. На рис. 2 показаны изображения 1 и 2 и результат их совмещения.
а) б) в)
Рис. 2. Изображения китайской туши (а), клеток (б) и результат их совмещения
(в).
Обработку изображений осуществляли последовательно следующим образом. Этап 1: уровни серого в изображении 1 попиксельно вычитали из уровней серого в изображении 2 фотометрируемого ядра, получая изображение 3. Этап 2: на цифровых изображениях 3 ядер с вычтенным бликом выделяли субимидж собственно ядра и субимидж прозрачного участка (изображение 4), расположенного рядом с ним. Изображение 4 использовали для определения усредненной интенсивности I0 света, прошедшего через образец без поглощения в красителе. Интенсивность каждого пикселя субимиджа собственно ядра нормировали на интенсивность I0 прошедшего непоглощенного света. Полученная таким образом цифровая матрица состоит из чисел, пропорциональных коэффициенту пропускания (т) света участками ядра. Этап 3: оптическую плотность для каждого пикселя вычисляли по формуле D = -log т (согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра). Этап 4: в качестве меры содержания ДНК в ядре использовали сумму логарифмов матрицы коэффициентов пропускания, взятую с обратным знаком.
Регистрация высококачественных изображений для последующего количественного обсчёта изображений с высокой точностью возможна лишь с применением соответствующих цифровых камер. Точность цитофотометрических измерений зависит, в частности, от линейности передаточной характеристики установки в целом. Мы разработали и провели многоступенчатую процедуру калибровки устройства. В качестве первого тестового объекта использовался аттестованный 9-ти ступенчатый ослабитель к спектрографу ИСП-51. Вторым тестовым объектом служил фотометрический клин, изготовленный из ахроматического нейтрально-серого в массе стекла. Размеры клина - 70х15 мм. Производилась последовательная регистрация цифровых изображений различных областей тестового объекта со значением
КО равным 100, значение установки выбора баланса белого - вручную. На каждом изображении выделяется один и то же сегмент, по которому проводится усреднение значений уровней серого по всем пикселям. Строится передаточная характеристика, отражающая соотношение между значением пропускания, полученным с помощью цитометрической установки и соответствующим значением пропускания тестового объекта.
Производилось тестирование трех камер различных производителей. На рис. 3 представлена зависимость пропускания ступеней ослабителя Т1, найденная в результате эксперимента, от величины значений пропускания Т2, указанных в паспорте ослабителя. Точками различной формы обозначено среднее значение пропускания тестовой полоски; вертикальные отрезки отмечают среднеквадратичное отклонение. Проведенная гамма-коррекция позволила линеаризовать зависимость.
ті
0.7?
0,?
0.2 ?
0
0 0.2? 0.? 0.7? Тт
• Leica * Axio Cam * Canon
Рис. 3. Передаточные характеристики установки с тестируемыми камерами
Для построения цитометрических калибровочных зависимостей на цитофотометрической установке проведены измерения биологических тестовых препаратов. При изготовлении тестовых препаратов использовались неделящиеся ядра клеток крови нескольких видов, что позволило избежать естественного разброса содержания ДНК, связанного с фазой синтеза ДНК. Для измерения количества ДНК выбраны клетки крови четырёх видов позвоночных (Gallus domesticus, Danio rerio, Homo sapiens, Rana arvalis). Точность полученных измерений сравнима с точностью данных, полученных ранее с помощью других методов цитометрии [3].
На рис. 4 представлены калибровочные зависимости, построенные с помощью различных камер с использованием биологических тестовых препаратов. Сравнивая данные на графиках 1, 2 и 3 с учетом того, что для наглядности графического представления условные единицы для значений
содержания ДНК, рассчитанные из цифровых изображений, зарегистрированных на камерах Canon EOS и Leica DFC, уменьшены в 10 раз, можно заметить, что камеры с большим динамическим диапазоном имеют более высокую чувствительность.
Рис. 4. Калибровочные зависимости, использующие содержание ДНКв ядрах клеток крови, полученные для различных камер. По оси абсцисс указано содержание ДНК в пГ по литературным данным, ордината - измеренное содержание ДНК в условных единицах
Проанализирован вклад различных эффектов в ошибку денситометрического метода измерений, предложен способ учета бликов оптики, найдены оптимальные параметры настройки микроскопа и камеры для денситометрических измерений. К новым результатам относится анализ влияния дифракции света в микроскопе, ограничивающей разрешающую способность оптического изображения, на точность цитометрических измерений. Согласно теории линейных систем, оптическое изображение в микроскопе есть свертка «идеального» изображения с функцией рассеяния точки прибора. Численный расчет ошибок, вносимых дифракцией, показал, что относительные погрешности могут составлять от 0,01 до 34 % в зависимости от размеров и пропускания ядра. То есть требуется разработка процедуры калибровки для устранения этой систематической ошибки. Для этих целей разработаны специальные тестовые микрообъекты, фотография которых дана на рис. 5.
Изготовленные дифракционные микроструктуры позволяют выполнить фотограмметрическую и дифракционную калибровки цитофотометрической установки, экспериментально определить функцию рассеянии точки и учесть
блики оптики в разработанном нами интегральном методе цитофотометрии, измерить передаточную характеристику (по оптической плотности) устройства и выбрать оптимальные параметры для работы камеры и настройки измерительного стенда. Тестовый объект представляет собой стеклянную пластинку, покрытую пленкой хрома. В пленке хрома нанесены шкалы и тестовые фигуры в виде кружков и квадратов. Микрометрическая шкала имеет
длину 1 мм с ценой деления 0,01мм число делений шкалы - 100.
Характерные размеры кружков
(квадратов) составляют следующий ряд: 3, 5, 7, 9, 11, 22 мкм. Требуемая точность исполнения размеров - не хуже, чем 0,3 мкм. Пропускание подложек варьируется в пределах 0,1 - 0,9.
Специальное программное
обеспечение разработано для отработки методики определения количественных параметров на микроскопных изображениях объектов с повышенной дигитализацией (digitization 14 bit).
Результаты, полученные с помощью разработанного цитофотометрического устройства по измерению содержания ДНК в ядрах различных организмов показали, что коэффициенты вариации данных измерений составляют от 2,5% до 7%, что находится на том же уровне, что и лучшие образцы денситометрических систем, известные из зарубежных публикаций [4].
Авторы благодарят сотрудников ИМКБ за предоставленные биологические препараты. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ, Междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН № 51 и Проекта президиума СО РАН № 41, выполняемый совместно со сторонними научными организациями.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Омельянчук В.Ф. Пальчикова И.Г., Семешин В.Ф., Алексеева А.Л., Жимулев И.Ф. Интегральный метод измерения количества ДНК в клетке с использованием цифровой микрофотографии // Цитология. - 2010. - Т. 52. - № 4. - С. 349-353.
2. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия. Аппаратура и методы анализа клеток по светопоглощению. - Л.: Наука. - 1977. - 295 с.
3. Animal Genome Size Database [Electronic resource] - Режим доступа: http://www.genomesize.com
4. Puech M., Giroud F. Standardisation of DNA quantitation by image analysis: quality control of instrumentation // Cytometry. - 1999. - Vol. 36. - P. 11-17.
© И.Г. Пальчикова, Е.С. Смирнов, 2012
Рис. 5. Изображение тестовых объектов
