CC BY
46
СПЕКТРАЛЬНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ ПОКАЗАТЕЛЯ ПОГЛОЩЕНИЯ В ЯДРАХ КЛЕТОК, ОКРАШЕННЫХ ПО ФЁЛЬГЕНУ
Ирина Георгиевна Пальчикова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Конструкторско-технологический институт научного приборостроения» Сибирского отделения Российской академии наук, 630058, Россия, г. Новосибирск, ул. Русская, 41, доктор технических наук, профессор кафедры «Общая физика» НГУ, зав. лабораторией, тел. 8 (383) 3065874, e-mail: palchikova@gmail.com
Евгений Сергеевич Смирнов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Конструкторско-технологический институт научного приборостроения» Сибирского отделения Российской академии наук, 630058, Россия, г. Новосибирск, ул. Русская, 41, младший научный сотрудник, тел.: 89658232375, e-mail: the-first-person@yandex. ru
Наталья Тихоновна Ясакова
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцраз-вития России, 630091, Россия, г. Новосибирск, Красный просп., 52, доктор биологических наук, профессор кафедры «Медицинская генетика и биология», тел.: 8 (383)2265510, e-mail: jasakova@inbox.ru
Леонид Владимирович Омельянчук
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт молекулярной и клеточной биологии» СО РАН, 630090, Россия, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10, доктор биологических наук, зав. лабораторией, тел.: 8 (383) 3305315, e-mail: ome@mcb.nsc.ru
Валерий Фёдорович Семешин
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт молекулярной и клеточной биологии» СО РАН, 630090, Россия, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10, доктор биологических наук, главный научный сотрудник, тел.: 8 (383) 3305315
В статье рассматриваются оптические свойства препаратов клеток, окрашенных строго по методу Фёльгена. Применение интерференционных спектральных фильтров с шириной полосы пропускания 10 нм в осветителе позволило выявить наличие спектральной зависимости показателя поглощения в пределах ядра. На микроизображениях ядер, полученных в различных узких спектральных диапазонах, выявляются различия в соотношении компактного и диффузного хроматина, что может служить дополнительным маркёром при проведении анализа морфологии ядерных структур клеток крови.
Ключевые слова: компьютерная цитофотометрия, многоволновой метод, хроматин,
ДНК.
THE ABSORPTION COEFFICIENT SPECTRUM OF FELGEN-STAINED CELLS NUCLEI
Irina G. Palchikova
Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering SB RAS, 630058, Russia, Novosibirsk, Russkaya str.,41, Sc.D., professor, Ph. 8 (383) 3065874, e-mail: palchikova@gmail.com Eugeny S. Smirnov
Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering SB RAS, 630058, Russia, Novosibirsk, Russkaya str., 41, Phone: 89658232375, e-mail: the-first-person@yandex.ru
Natalya T. Yasakova
Novosibirsk Medical University, 630091, Russia, Novosibirsk, Krasny prospect st., 52, Sc.D., professor, Phone: 8 (383)2265510, e-mail: jasakova@inbox.ru
Leonid V. Omelyanchuk
Institute of molecular and cellular biology SB RAS, 630090 Russia, Novosibirsk, Ac. Lavrentev prospect, 10, Sc.D., professor, phone: 8 (383) 3305315, e-mail: ome@mcb.nsc.ru
Valery F. Semeshin
Institute of molecular and cellular biology SB RAS, 630090 Russia, Novosibirsk, Ac. Lavrentev prospect, 10, Sc.D., professor, phone: 8 (383) 3305315
The optical properties of the Felgen-stained cells preparation are studied in the article. The absorption coefficient spectrum is revealed with help of the interference spectral filters with the transmission bandwidth equal to 10 nm placed in light. The different relations between compact and diffuse chromatin was found in respectively different shot spectral ranges for images of the same nuclei. These relations can be used as additional marker in morphology analysis for the nuclear structures of blood cells.
Key words: image cytometry, multiwave method, chromatin, DNA.
Новым инструментарием клеточной биологии и медицины, который в настоящее время активно развивается, является компьютерная обработка цифровых микроизображений, позволяющая выполнять как оптико-структурный анализ для сравнительной характеристики клеточных ядер, так и денситометриче-ский обсчет микроизображений для определения содержания ДНК в ядре. Цитофотометрия [1, 2] используется практически во всех ведущих клиниках Европы. Актуальность этого метода подтверждается, например, наличием в прошлом общеевропейских проектов стандартизации цитофотометрических измерений (European 1999 PRESS project (Prototype Reference Standard Slide)) содержания ДНК в опухолевых клетках. Вместе с тем современные технологии и элементная база позволяют развивать методы компьютерного зрения в приложении к задачам цитометрии. Эти возможности предоставляют лазерные (полупроводниковые и волоконные в том числе) источники света, современные фотоприемные матрицы с расширенным динамическим диапазоном [3], а так же специальные калибровочные дифракционные паттерны и тестовые нанообъекты [4]. Всё это создает хорошую основу для количественных измерений микроскопных изображений и дальнейшего развития методов цитофотометрии, одним из которых является многоволновой метод. Предложенный в [5] интегральный денситометрический метод анализа цифровых изображений позволяет более точно учесть паразитные засветки. В одноволновом методе точный выбор длины волны не обязателен, но при двух (или много) волновой цитофотометрии - это один из самых важных факторов, определяющих точность измерений. Поэтому задача изучения спектральной зависимости показателя поглощения в ядрах клеток, окрашенных по Фёльгену, представляется актуальной.
В настоящей работе экспериментально изучаются особенности микроизображений ядер клеток стандартных биологических видов в многоволновом методе компьютерной цитофотометрии.
Основу цитофотометрии составляет закон Бугера - Бэра, связывающий прямой пропорциональной зависимостью оптическую плотность В и толщину И поглощающего слоя препарата:
-5
Здесь c - концентрация вещества (г/см ), x - удельный показатель поглощения вещества (см2/г). Величина x характеризует свойства молекул вещества и существенно зависит от длины волны.
Влияние качества красителя и способа приготовления реактива Шиффа на интенсивность окрашивания и спектры поглощения ДНК-фуксина при проведении реакции Фёльгена изучены достаточно подробно [1]. Созданы методики и прописи приготовления препаратов, окрашенных по Фёльгену. Важнейшим условием нашей работы была строгая стандартизация. Для цитофотометрии использовали стекла стандартной толщины. Мазки-отпечатки готовили с образцов тканей, предварительно выдержанных в растворе трипсина (Spofa, Польша) при 370С в течение 10 минут (процедура разобщает клетки, но не влияет на структуру хроматина). Полученный препарат фиксировали в растворе этанол -уксусная кислота в соотношении 3:1 в течении 8 минут, в дальнейшем проводили реакцию Фельгена. Она основана на депуринизации ДНК в растворе кислоты с последующей окраской освободившихся альдегидных групп реактивом Шиффа. Количество альдегидных групп, выявляемых в ядрах по содержанию комплекса ДНК-фуксин, зависит от двух процессов - депуринизации и деполимеризации ДНК, выраженность которых определяется продолжительностью кислотного гидролиза. В процессе кислотного гидролиза изменяется не само содержание ДНК, а количество выявляемого комплекса ДНК-фуксин. На начальных этапах гидролиза количество комплекса ДНК-фуксин увеличивается (скорость депуринизации выше скорости деполимеризации), затем стабилизируется на максимальных значениях (скорости уравновешиваются) и, наконец, начинает снижаться (депуринизация исчерпала себя, тогда как деполимеризация продолжается). Даже небольшое различие во времени гидролиза (5% раствор соляной кислоты при 37°С) приводит к изменению абсолютных значений характеристик ядра. Нами были выбраны стандартные условия гидролиза -12 минут в 5% соляной кислоте при температуре 37°С.
Цифровые микроизображения препаратов снимались на установке компьютерной цитофотометрии, описанной в [3], с различными светофильтрами и микрообъективом Plan-Achromat 40х/0.65 (ZEISS, Германия). Мы выбрали микрообъектив, у которого отсутствует остаточная хроматическая аберрация в рабочем поле зрения, и проверили это экспериментальным путем с помощью специальных тестовых объектов [3] и набора интерференционных светофильтров с пиками пропускания для длин волн 500 нм, 600 нм и 650 нм и с узкой полосой пропускания (10 нм). Эксперименты проводили с препаратами крови курицы,
тритона, лягушки и крысы. В процессе снятия микроизображений интерференционные светофильтры или стандартные цветные стекла помещались в осветитель. Соответствующие фотографии даны на рис. 1.
Препарат «Курица»
Препарат «Тритон»
Препарат «Крыса»
Рис. 1. Микрофотографии ядер в различных препаратах, снятые с интерференционными светофильтрами 500 нм, 600 нм и 650 нм, соответственно
К информативным морфометрическим параметрам хроматина клеточных ядер относятся интегральная оптическая плотность, доля компактного и диффузного хроматина в ядрах клеток и занимаемая ими площадь. На микроизображениях ядер рис.1, полученных в различных узких спектральных диапазонах, отчетливо видны различия в соотношении компактного и диффузного хроматина. Зависимость удельного поглощения вещества от длины волны значительно влияет на результаты вычисления оптической плотности, периметра и площади одного и того же ядра, снятого с различными светофильтрами. Ин-
тегральная оптическая плотность изображений, вычисленная по алгоритму [5], существенно варьирует с длиной волны осветителя, что, однако, не влияет на точность определения количества ДНК в ядре одноволновым методом, если проводится надлежащая калибровка устройства [3]. Применение алгоритмов двухволнового метода [1] для обработки этих изображений не дает значимого результата в части уменьшения коэффициента вариации.
На рис. 2 приведены зависимости площадей изображений ядра от уровня серого, принятого за граничную величину, для трех длин волн. Площадь рассчитана для одного ядра, за 100 единиц уровня серого принято значение яркости пикселя в точке перегиба графика распределения яркости вдоль диаметра ядра. Площадь, вычисленная по этому значению уровня серого, принята за 1. То есть хроматические зависимости выявляются не только при сравнении данных от различных ядер, но и от одного ядра. Значительная хроматическая зависимость выявляется так же и при вычислении периметров.
Уровень серого, отн ед 1 - График для длины волны 500 нм; 2 - 600 нм, 3 - 650 нм.
Рис. 2. Зависимость относительной площади ядра от величины уровня серого на границе
Одной из основных проблем в объективизации медицинского заключения по цитологической картине является отображение описания на количественные показатели. Мы считаем, что хроматическая зависимость информативных морфометрических параметров хроматина клеточных ядер предоставляет возможность введения новых маркёров, а именно хроматических, для проведения анализа морфологии ядерных структур клеток крови.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Магакян Ю.А., Каралова Е.М. Цитофотометрия ДНК/АН Арм ССР. Ин-т эксперим. биологии. - Ер.: Изд-во АН Арм ССР, 1989. - 204 с.
2. Пальчикова И. Г., Омельянчук Л. В., Пальчиков Е. И., Смирнов Е.С., Каманина Н.В. Компьютерная цитофотометрия. /Оптико-информационные измерительные и лазерные технологии и системы : юбилейный сборник избранных трудов КТИ НП СО РАН. - Новосибирск : Академическое изд-во «Гео», 2012. - С. 375 - 398.
3. Пальчикова И. Г., Омельянчук Л. В., Пальчиков Е. И., Смирнов Е.С., Семешин В.Ф. Особенности применения цифровых камер для цитофотометрического определения количества ДНК в ядрах клеток. Датчики и системы. 2012, № 3, с.2 - 12.
4. Пальчикова И. Г., Омельянчук Л. В., Смирнов Е.С. О влиянии дифракции на результаты количественной цитофотометрии. Автометрия, 2012, №6, с.92 - 101.
5. Омельянчук В.Ф., Пальчикова И.Г., Семешин В.Ф., Алексеева А.Л., Жимулев И.Ф. Интегральный метод измерения количества ДНК в клетке с использованием цифровой микрофотографии // Цитология. 2010. Т. 52. № 4. С. 349 - 353.
© И.Г. Пальчикова, Е.С. Смирнов, Н.Т. Ясакова, Л.В. Омельянчук, В.Ф. Семешин, 2013
