CC BY
77
УДК 681.17.18
Е.С. Смирнов 1,2, И.Г. Пальчикова1,2 1 КТИ НП СО РАН, Новосибирск
■у
НГУ, Новосибирск
КАЛИБРОВКА ЦИФРОВЫХ КАМЕР ДЛЯ МИКРОСКОПНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
При использовании цифровой камеры для получения количественной информации в задачах цитометрии необходимо с высокой степенью точности определять распределение оптической плотности в микроскопном изображении. Предложенный способ калибровки позволяет определять степень линейности передаточной характеристики устройства, состоящего из цифровой камеры и микроскопа. Представлены экспериментальные данные и проведено сравнение нескольких камер, применяемых в микроскопах.
E.S. Smirnov 12,1.G. Palchikova1,2
1 Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering of Siberian Branch RAS
41 Russkaya Ul., Novosibirsk, Russian Federation
Л
Novosibirsk State University
2 Pirogova str, Novosibirsk, Russian Federation
СALIBRATING THE DIGITAL CAMERA FOR MICROSCOPY CYTOMETRY
In cytometry the optical density distribution has to be accurately calculated from the microscope image of specimen. The image acquisition is performed with help of digital camera. The technique for testing the linearity of the transfer characteristics of the device consisting of the microscope and a digital camera is proposed. The experimental data for several cameras are presented, the comparison the transfer characteristics are performed.
Новые направления микроскопии связаны с разработкой новых способов освещения и, соответственно, модификацией осветительной части микроскопов; с использованием новых фотоприемных систем, регистрирующих изображения; с созданием алгоритмов и программ обработки цифровых микроскопических изображений. В настоящее время количественный обсчет изображений все чаще используется в микроскопии. Получение высококачественных изображений и количественный обсчёт изображений с высокой точностью возможны лишь с применением соответствующих цифровых камер. При использовании цифровой камеры для фотограмметрических съемок основное значение имеет точность передачи геометрических размеров объектов. Калибровка камеры в этом случае подразумевает определение таких параметров как: радиальная дисторсия, фокусное расстояние, разность масштабов по осям X и Y, координаты главной
точки. В микроскопии все перечисленные параметры задаются главным образом качеством изображения, которое строится в микроскопе, то есть характеристиками микрообъектива.
Основными составляющими частями цитометрической установки являются микроскоп, цифровая камера, компьютер и программное обеспечение. Точность микроскопных цитофотометрических измерений зависит главным образом от следующих двух факторов. Во-первых, от стабильности характеристик освещения, а именно, от стабильности яркости во времени в каждой точке картины и однородности освещения поля зрения. Это достигается использованием освещения по Кёлеру и стабилизацией мощности излучения источника. Во-вторых, от выбора и оптимизации режимов работы камеры по отношению к динамическому диапазону микроскопного изображения.
В цитометрических экспериментах для получения цифровых изображений препаратов использовались инвертированный микроскоп Axiovert-200 (Carl Zeiss) в режиме проходящего света и исследовательский микроскоп DIALUX 20 EB (Leitz) с микрообъективом Achroplan 20x/0,40. Измерения проводили при максимально закрытых полевой и апертурной диафрагмах с использованием интерференционного светофильтра, пропускающего свет с длиной волны 551 ± 10 нм. Цифровое изображение получали с помощью тестируемых цифровых камер.
Точность цитофотометрических измерений зависит, в частности, от линейности передаточной характеристики установки в целом. В качестве первого тестового объекта мы предложили использовать аттестованный 9-ти ступенчатый ослабитель N 780171 к спектрографу ИСЛ-51. Пропускание 1-^9 ступеней имеет следующие значения: 100; 70,79; 50,12; 31,62; 19,95; 14,80; 8,91; 6,31; 100 % соответственно. Вторым тестовым объектом служит фотографический клин, изготовленный из серого в массе стекла. Размеры клина - 70x15 мм. Тестирование установки проводится следующим образом. Производится последовательное получение цифровых изображений различных областей тестового объекта со значением ISO равным 100, значение установки выбора баланса белого - вручную. На каждом изображении выделяется один и то же сегмент, по которому проводится усреднение значений уровней серого по всем пикселям. Значение уровня серого, соответствующее пропусканию 100%, выбирается равным среднему арифметическому значению уровней серого в изображении 1-ой или 9-ой ступени тестового объекта. Строится передаточная характеристика, отражающая соотношение между значением пропускания, полученным с помощью цитометрической установки и соответствующим значением пропускания тестового объекта.
Производилось тестирование трех камер различных производителей: AxioCam MRc, Canon EOS 500D, Leica DFC420. В таблице представлены отдельные характеристики каждой из камер.
Таблица. Характеристики камер
Характеристика Модель камеры
AxioCam MRc Leica DFC 420 Canon EOS 500 D
Датчик, тип CCD CCD CMOS
Размер матрицы, мм 8,9x6,7 8,1x6,64 22,3x14,9
Количество пикселов, пикс 1388x1040 2592x1944 4752x3168
Диапазон оцифровки изображений (дигитализация) 8 bit 12 bit 14 bit
Ручной баланс белого - Да Да
На рис. 1 представлена зависимость пропускания ступеней ослабителя Т1 найденная в результате эксперимента, от величины значений пропускания Т2, указанных в паспорте ослабителя. Точками различной формы обозначено среднее значение пропускания тестовой полоски, вычисленное путем усреднения по пикселям изображения; вертикальные отрезки, расположенные рядом, отмечают среднеквадратичное отклонение. Некоторая гамма коррекция позволила линеаризовать зависимость.
ті
0,75
0.5
0,25
0 0,25 0,5 0,75
* Leica • Axio Cam * Canon
Рис. 1. Передаточные характеристики установки с тестируемыми камерами линейной аппроксимации равны 0,96; 0,96 и 0,99, соответственно.
На рис. 1 график линейной зависимости T1=k*T2 построен с помощью метода наименьших квадратов по экспериментальным точкам среднего значения. Изображение тестового объекта получалось со следующими параметрами камеры: ISO - 100, экспозиция 2 сек, ручной баланс белого. На рис. 1 приведены результаты тестирования камер AxioCam MRc (количество
рабочих пикселов после бининга - 650x514), Leica DFC 420 и Canon EOS 500 D. Коэфициенты k.
Наибольшие вариации величины уровней серого по кадру демонстрирует AxioCam. Среднеквадратичное отклонение достигает ±6,2 % на второй ступени пропускания. Прямая линейной аппроксимации на всех графиках лежит в пределах среднеквадратичного отклонения экспериментальных данных. Величина доверительного интервала составляет 0,99. В процессе тестирования наилучшие результаты показала камера Canon EOS 500 D.
Более детальное тестирование передаточной характеристики устройства возможно выполнить с помощью стеклянного фотометрического клина серого путем сравнения результатов прямого фотометрирования клина с передаточной характеристикой установки, снятой с помощью этого клина. Первоначально оптическая плотность клина экспериментально определяется при помощи планшетного сканера EPSON Perfection V200 Photo (полноцветный планшетный сканер с линейным датчиком CCD). Сканирование проводится на просвет с разрешением 4800 dpi / 48 bit. После чего клин помещается на предметный столик и
1 с» и у с»
проводится серия снимков цифровой камерой. Каждый снимок в серии делается после перемещения столика на равные отрезки в одном направлении. Столик перемещается от темной части клина к светлой. Продольная координата клина задается микрометрическим винтом предметного столика микроскопа. Оптическая плотность клина в зависимости от его продольной координаты рассчитывается из цифровых изображений как логарифм пропускания. Мы применяли несколько способов получения усредненного значения уровня серого по площадкам различной формы и содержащим различное количество пикселей на изображении. Минимальная площадка, сигнал с которой не искажается шумами, имеет размер 50x50 пикселей.
В верхней части рис. 2 приведен график зависимости оптической плотности от координаты вдоль клина, построенный из экспериментальных данных сканирования клина. Величина доверительного интервала найденной линейной аппроксимации составляет R =0,9988. Таким образом, имеется клин достаточно хорошего качества.
Рис. 2. Результаты тестирования камеры Canon EOS 500 D. Тестовый объект -
клин серого
В нижней части рис. 2 представлены экспериментально полученные точки передаточной характеристики (по оптической плотности) установки (с клином в качестве тестового объекта) и прямые линейной аппроксимации с доверительным интервалом 0,94 для камеры Canon EOS 500 D.
Видно, что передаточная характеристика камеры стремится к линейной во всем диапазоне чувствительности.
Как показывают зарубежные исследования приёмных матриц камер фотоаппаратов [1], передаточная характеристика камер имеет линейные участки и характерные прогибы. Сравнивая полученные экспериментальные данные для камеры Canon EOS 500D и приведенные в [1] для иных камер, применяемых в микроскопах, можно сделать вывод о качественном совпадении вида передаточных характеристик. Однако, проведенное нами тестирование, выявило, что Canon EOS 500D имеет более линейную характеристику, нежели представленные в литературе [1].
На цитометрической установке проведены измерения на биологических тестовых препаратах. Апробирован метод оценки количества ДНК в ядрах, окрашенных по Фельгену, с помощью цифровых изображений. Методика измерений описана в [2]. Денситометрическое измерение количества ДНК в клетках крови четырёх видов позвоночных (Gallus domesticus, Danio rerio, Homo sapiens, Rana arvalis) показывают хорошее соответствие с данными литературы. В качестве меры, отражающей варьирование содержания ДНК в клетках одного вида, обычно используют стандартную ошибку среднего (SEM), отнесенную к величине содержания ДНК. В наших экспериментах достигалось
относительное значение SEM равное 2,6%. В то же время общепринятым методом определения содержания ДНК в ядрах являются денситометрические измерения, проводимые на сканирующем денситометре Vickers M8 [3], где при обмере ядер взрослых особей Mesocyclops edax, относительное значение SEM составило 3,8%. Таким образом, использование сканера Vickers M8 не дает существенных преимуществ в отношении точности измерений.
То есть, точность экспериментальных данных, полученных на цитометрической установке, сравнима с точностью данных других методов цитофотометрии (http://www.genomesize.com). Поскольку в настоящее время технические параметры цифровых камер постоянно улучшаются, то предлагаемый метод количественного определения ДНК ядер имеет перспективу для развития.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Puech, M. Standardisation of DNA quantitation by image analysis: quality control of instrumentation/ Puech, M., Giroud, F.//Cytometry.- 1999.-V.36. P. 11-17.
2. Интегральный метод измерения количества ДНК в клетке с использованием цифровой микрофотографии [Текст] / И.Г. Пальчикова, Л.В. Омельянчук, В.Ф. Семешин, А.Л. Алексеева, И.Ф. Жимулев // Цитология. -2010. - Т. 52, № 4. - С. 349 - 353.
3. Rasch, E.M. Heterochromatin Endoreduplication Prior to Gametogenesis and Chromatin Diminution During Early Embryogenesis in Mesocyclops edax (Copepoda: Crustacea)/ Rasch, E.M., Wyngaard, G.A., Connelly, B.A.//Journal of Morphology. -2008.-V269 P.387-397.
© Е.С. Смирнов, И.Г. Пальчикова, 2011
