CC BY
158
УДК 681.17.18
И.Г. Пальчикова, Е.С. Смирнов
КТИ НП СО РАН, Новосибирск
Н.П. Боев
НГУ, Новосибирск
Л.В. Омельянчук
ИХБФМ СО РАН, Новосибирск
Б.М. Аюпов
ИНХ им. А.В. Николаева СО РАН, Новосибирск
H.В. Каманина
ФГУП «НПК "ГОИ им. СИ. Вавилова"», Санкт-Петербург
ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК СОВРЕМЕННЫХ ПОЛЯРИЗАЦИОННЫХ ПЛЕНОК ДЛЯ ЦЕЛЕЙ МИКРОСКОПИИ
Приводятся результаты экспериментального определения зависимости остаточного пропускания поляризационных светофильтров от угла падения поляризованного света.
I.G. Palchikova, Ye.S. Smirnov
Design and Technology Institute of Scientific Instrument-engineering, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences N.P. Boyev
Novosibirsk State University L.V. Omelyanchuk
The Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences B.M. Ayupov
A.V. Nikolayev Institute of Inorganic Chemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of
Sciences
N. V. Kamanina
Federal State unitary enterprise “Scientiflc-and-production enterprise “Vavilov State Optical Institute”, St. Petersburg
EXPLORING THE CHARACTERISTICS OF MODERN POLARIZING FILMS FOR MICROSCOPY
Experimental results of studying the residual transmittance for polarizing filters depending on the polarizing light incidence angle are presented.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время активно развиваются новые микроскопические методики, такие как дифференциально-интерференционный контраст (ДИК), ДИК с круговой поляризацией, PlasDIC и люминесценция, TIRF 3 (флюоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением). Современная микроскопия позволяет получать не только высококачественные изображения, но и производить количественные обсчеты изображений образцов с высокой точностью. В поляризационных микроскопических методиках биологический образец помещается между стеклами и наблюдение ведется в скрещенных поляроидах, причем анализатор помещается после микрообъектива
(в ходе лучей от источника). Однако хорошо известно [1], что на каждой границе раздела стекло - воздух или стекло - иммерсия происходит деполяризация света. Показано [2], что в фокальной области даже одиночной линзы поляризационная структура падающего излучения претерпевает изменения. То есть в стандартных поляризационных методиках наблюдения имеется систематическая ошибка, возникающая вследствие деполяризации рассеянного образцом света на оптических компонентах микроскопа. Если микроскопическое изображение наблюдается визуально, то эта ошибка не оказывает существенного влияния на результирующую интерпретацию данных, но незначительно снижает контраст изображения. Вместе с тем в биологических экспериментах [3] требуются высокоточные количественные обсчеты микроизображений, зарегистрированных в цифровом виде. И в этом случае обсуждаемая ошибка может существенно исказить результаты и ее необходимо исключать. Один из способов уменьшения этой ошибки заключается в изменении расположения поляризующих элементов в микроскопе. Модернизация оптической схемы возможна лишь с применением современных поляризаторов.
Целью настоящей работы является экспериментальное изучение характеристик пленочных поляризационных светофильтров (поляроидов) и анализ возможностей применения их в поляризационных методиках микроскопии.
ОСОБЕННОСТИ ПОЛЯРИЗАЦИОННЫХ ПЛЕНОК
Использующиеся в микроскопии поляризационные призмы, например, Николя из исландского шпата, в ряде случаем заменяются поляроидами, которые практически не уступают по степени поляризации кристаллам. Основным элементом поляроидов является поляризационная пленка, получаемая путем йодирования и растягивания поливиниловой пластмассы. Сильный дихроизм такой пленки обусловлен одинаковой ориентацией молекул Ь среди вытянутых в одном направлении цепочек молекул пластмассы. ФГУП «НПК «ГОИ им. С.И.Вавилова» разработал и использует для изготовления малых партий образцов технологию получения высокоэффективных пленочных поляризаторов, обладающих высоким пропусканием в видимой области спектра и достаточно близкими значениями коэффициентов пропускания в диапазоне 400 - 800 нм при высокой степени поляризации (Р>99%) и однородности положения плоскости поляризации по сечению пленки.
Поляроиды позволяют получить поляризованный световой пучок большого диаметра. Толщина поляроидов по сравнению с поляризационными призмами мала и они практически не изменяют хода лучей в оптической системе, пропускание таких фильтров не изменяется в широком диапазоне длин волн, что облегчает конструирование поляризационных приборов. Поляроиды широко применяются в жидкокристаллических устройствах отображения информации (мониторах), микроэлектронике, поляризационных измерительных методиках и приборах, таких как фотокамеры, специализированные микроскопы и телескопы и т.д.
К основным характерным параметрам поляроидов относятся следующие: 1. Пропускание, которое характеризуется коэффициентом пропускания т, а именно отношением интенсивностей пучка света до и после его прохождения через фильтр. Различают интегральный и спектральный коэффициенты пропускания. Категории по пропусканию поляроидов устанавливаются для пропускания двух поляроидов в параллельном положении плоскостей поляризации и для остаточного пропускания поляроидов в скрещенном положении (главные коэффициенты пропускания ттах и Tmin). 2. Главные оптические плотности (логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания). 3. Степень поляризации излучения - отношение разности квадратов большой и малой полуосей эллипса, описываемого вектором напряженности электрического поля к их сумме. 4. Дихроичное отношение (отношение оптических плотностей). 5. Поляризационный дефект - отношение
Tmin/( Tmin+ Tmax)-
Перечисленные характеристики не описывают и не дают никакого представления об изменении поляризационных свойств фильтров в зависимости от угла падения света. А именно эта зависимость является основной и существенной при рассмотрении действия поляроидов в микроскопах с высокоапертурными микрообъективами. Не менее важна так же степень однородности коэффициента пропускания по поверхности поляроида.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК
ПОЛЯРОИДОВ
Следующие образцы поляризационных фильтров выбраны для экспериментов: образец 1 - стандартный поляроид микроскопа Carl Zeiss диаметром 15 мм, толщиной 1,5 мм; образец 2 - поляризационная пленка (ГОИ) размером 25x25 мм, толщиной 80 мкм; образец 3 - стандартное покровное стекло покрытое поляризационной пленкой ГОИ; образец 4 - призма Николя из металлографического микроскопа в оправе - 11х11х33 мм.
Экспериментально определялись однородность коэффициента пропускания по поверхности и зависимость поляризационных характеристик образцов от угла падения света.
Однородность коэффициента пропускания по поверхности образца проверялась на монохроматическом лазерном нулевом эллипсометре ЛЭФ-3М, а именно измерялись вариации остаточного пропускания на выбранной площадке поверхности образца. Принципиальная схема измерений представлена на рис. 1.
Рис. 1. Принципиальная оптическая схема измерений однородности т
Экспериментальная установка (рисунок 1) состоит из: источника света Ь, включающего в себя лазер ЛГН-208Б (X = 6328 А) и механический модулятор с оптопарой, поляризатора Рі, компенсатора Р2, диафрагмы Б, образца Р3, анализатора А и приёмника света (ФЭУ) РИ. Плечи эллипсометра устанавливаются «на просвет», исследуемые образцы вначале юстируются перпендикулярно пучку света диаметром 1 мм путем вращения вокруг оси ії' (рис. 1). Поляризатор, компенсатор и анализатор могут плавно вращаться относительно оптической оси на произвольный угол ф, их азимутальные шкалы устанавливаются с погрешностью ± 0°01'. Введение в схему модулятора с оптопарой позволяет усиливать сигнал от фотоумножителя на частоте вращения модулятора и устранять таким образом шумы. Образец Р3 закрепляется в специальной оправе на столике эллипсометра. Поляризационные оси образцов не контролируются. Оправа с образцом может перемещаться с помощью микрометрического винта поперек оптической оси (направление й на рис. 1). В экспериментах поляризатор Р1 с компенсатором Р2 обеспечивают круговую поляризацию излучения, падающего на образец. Вращая азимутальную шкалу анализатора А, находим угол гашения (минимум интенсивности света на фотоприемнике). Измеряем остаточное пропускание образца в выбранной области диаметром 1 мм, затем перемещаем образец с шагом 2 мм и повторяем измерение. Разброс углов гашения анализатора характеризует однородность поляризационных свойств образца. Чем разброс меньше, тем более качественный образец.
На рис. 2 приведены графики зависимости изменения угла гашения анализатора от координаты точки падения пучка на образец, полученные экспериментально. Графики на рис. 2 а) построены для случая, когда плоскость образца перпендикулярна оптической оси, на рис. 2 б) - плоскость образца повернута относительно оптической оси на угол 45°. Полученные данные позволяет сравнить разработанные нами образцы с призмой Николя. Однородность поляризационных характеристик пленок и поляризационных покровных стекол, разработанных ГОИ, практически такая же, как и у призмы Николя.
Линейная координата, мм
Образец 2,0° * * * • * Образец 3, 0° Образец 4, 0°
Линейная коорднната. мм
^^“Образец 2, 45° ....Образец 3, 45°
а б
Рис. 2. График зависимости изменения угла гашения анализатора от координаты точки падения пучка на образец: а) - плоскость образца перпендикулярна оптической оси; б) - плоскость образца повернута относительно оптической оси на угол 45°
Принципиальная оптическая схема экспериментов по изучению зависимости главных коэффициентов пропускания образцов от угла падения света дана на рис. 3. Свет гелий-неонового лазера проходит через четверть волновую фазовую пластинку Р1 и приобретает круговую поляризацию. Поляроид Р2 закреплен в лимбе и может вращаться вокруг главной оптической оси. Поляризационная ось 02-02' выставляется вертикально. Диафрагма Б ограничивает диаметр пучка, падающего на образец Р3. Образец Р3 закреплен в оправе на лимбе, который позволяет вращать образец вокруг главной оптической оси на угол + 90°. Лимб в свою очередь крепится на оптическом столике, позволяющем поворачивать его вокруг оси ії' на заданный угол а с погрешностью 0,1°. Ось вращения ії' пересекается с главной оптической осью системы. Фотоприемник Я выполнен на основе фотодиода с линейным усилителем. Все компоненты расположены строго перпендикулярно главной оптической оси.
р.
о
ї\ 9-з
А /
^Л90° ) /
1 !
Р, к
о, о, о,
О-----------г - - О ;
О; О,
II
о3 ■ о 2 о3__________________________________________о.
III IV
Рис. 3. а) Принципиальная оптическая схема экспериментов по изучению зависимости главных коэффициентов пропускания образцов от угла падения света. б) Обозначение взаимного расположения поляризационных осей поляроида Р2 и образца Р3 в экспериментах
б
а
Графики зависимости главных коэффициентов пропускания образцов от угла падения света сведены в табл. 1. Полученные экспериментальные данные выявили, что поляризационные покровные стекла, разработанные ГОИ (2-ая и 3-я строки табл. 1), демонстрируют существенно меньшую зависимость главных коэффициентов пропускания от угла падения света. Даже если угол падения не превышает 30° (что в микроскопе соответствует апертурам микрообъектива равным примерно 0,75), то изменения коэффициентов пропускания достигают 10% для всех образцов. Более существенные различия в кривых появляются при больших углах падения.
Таблица 1. Графики зависимости пропускания образцов от угла падения света
Без покровных стекол
С покровными стеклами
Образец 1
н ••
О -•••• *
....Угол... III
*Образ
..о
азец 1
■Угол. IV
—
Образец 2
■Нгол. IV
—
.Образец
и ‘ н
-6^
)азец3
Угол. III
т,
max
max
Микроскопические изображения в поляризованном свете Для исключения деполяризации, вносимой микрообъективом, и улучшения качества изображения в поляризационном микроскопе мы предлагаем использовать поляризационные пленки в качестве покровных стекол. Таким образом, покровное стекло в микроскопе будет использоваться в качестве анализатора.
Экспериментальные испытания новой схемы проводились на микроскопе Dialux 20E.B., оснащенном цифровой фотокамерой Nikon EOS 500D c повышенной дигитализацией (digitalization) - 14 bit. В качестве покровных стекол применялись образцы 3. Исследовалось изменение контраста в изображении резкого края тестового объекта - чёрно-белого
жидкокристаллического экрана, имеющего резкий край по своему периметру, который и наблюдался в поляризованном свете. На рис. 4 представлены фотографии тестового объекта, а данные их обработки - на рис. 5. В экспериментах использовались два микрообъектива: 10х и 20х П ЛОМО. Графики на рис. 5 строились в среде программирования MATHCAD путем выборки значений уровней серого вдоль однопиксельной прямой, перпендикулярной изображению резкого края границы.
Рис. 1. Фотография экрана в белом (а) и поляризованном (б, в) свете
Рис. 2. График изменения градаций уровня серого вдоль однопиксельной прямой, перпендикулярной к изображению резкого края
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Экспериментальные испытания новой поляризационной методики подтвердили эффективность использования поляризационных покровных стекол. Новая схема расположения поляроидов по сравнению со стандартной, дает увеличение контраста изображения на 5,8% для объектива 10х и на 4,4% для объектива 20 х.
Работа выполнялась в рамках проекта РФФИ №09-08-00651.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Борн М., Вольф Э. Основы оптики. - М.: Наука, 1973. - 719 с.
2. Соколов А.Л. Поляризационная структура излучения в фокальной области линзы //
Оптика и спектроскопия / - 2009/ - том 107 №2. - с.219-224.
3. Anthony Squire, Peter J. Verveer et. al. Red-edge anisotropy microscopy enables
dynamic imaging of homo-FRET between green fluorescent proteins in cells// Journal of Structural Biology. - 2004. - V. 147. - P. 62-69.
© И.Г. Пальчикова, Е.С. Смирнов, Н.П. Боев, Л.В. Омельянчук, Б.М. Аюпов, Н.В. Каманина, 2010
