CC BY
45
УДК 544.473:577.15
А. Н. Шакиров (асп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.),
Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), С. С. Вершинин (к.х.н., доц.),
А. А. Шараева (асп.), Р. Р. Дельмухаметов (студ.)
Поиск биокатализаторов для кинетического разделения рацемического 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
A. N. Shakirov, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, S. S. Vershinin,
A. A. Sharaeva, R. R. Delmukhametov
Search of biocatalysts for the kinematic resolution of racemic 2-brom-1-(4-nitrophenyl)ethanol
Ufa State Petrolium Technical Univercity
1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Изучено парциальное ацетилирование 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола винилацетатом при 30 °С в присутствии липазы Novozyme 435 и обезвоженных ацетоном клеток бактерий (9 культур) в различных органических растворителях (толуоле, тетрагидрофуране, изооктане), а также в бинарных смесях изооктана с тетрагидрофураном или ацетоном. Обнаружено, что при 30 оС наиболее эффективно трансформация протекает в системе изооктан-ацетон в присутствии липазы Novozyme 435 и клеток Bacillus sp. 77-34. Показано, что увеличение температуры до 45 оС приводит к существенному ускорению процесса в присутствии Novozyme 435 и позволяет достичь 95% энантиомерного избытка превалирующего энантиомера 2-бром-1-(4-нитрофенил)эта-нола через 80 ч трансформации.
Ключевые слова: 2-бром-1-(4-нитрофенил)-этанол; липазы; микроорганизмы; энантиосе-лективный биокатализ; (^)-нифеналол; (5)-со-талол.
The partial acetylation of 2-brom-1-(4-nitro-phenyl)ethanol by vinyl acetate at 30 oC in presence of Novozyme 435 lipase and bacterial cells (9 cultures) dried by acetone in different organic solvents (toluene, tetrahydrofuran, isooctane) and in binary systems of isooctane with acetone or tetrahydrofuran was studied. It has been found that at 30 oC the most effective transformation occurs in presence of Novozyme 435 lipase and allows to obtain prevalent enantiomer of 2-brom-1-(4-nitrophenyl)ethanol in 95% enantiomeric excess after 80 hours of transformation.
Key words: enantioselective biocatalysis; lipase; microorganisms; 2-brom-1-(4-nitrophenyl)etha-nol; (5)-sotalol; (R)-nifenalol.
В терапии сердечно-сосудистых заболеваний широко используются соединения, блокирующие ^-адренергические рецепторы, более известные как ^-блокаторы. Они применяются для снижения высокого кровяного давления, терапии сердечной недостаточности и ишемии миокарда .
Производство в~блокаторов началось в 1960-х гг., но до сих пор большинство из них продаются в виде рацематов. Вместе с тем, R- и S-энантиомеры в-блокаторов отличаются друг от друга своими фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами и долж-
Дата поступления 15.09.11
ны применяться отдельно. Эутомеры (более активные энантиомеры) в-блокаторов проявляют активность, в 10—500 раз большую, нежели их дистомеры (менее активные энантиомеры) 1. При этом дистомеры могут снижать избирательность действия эутомеров, а также вызывать нежелательные побочные эффекты.
Важнейшими в~ адренергическими блока-торами являются нифеналол и соталол, в структуру которых входит 2-амино-1-арилэта-нол. При этом только ^)-(—)-нифеналол 2,3 и (5)-(+)-соталол 4, обладают способностью блокировать в-адренергические рецепторы и могут использоваться для лечения сердечно-сосу-
дистых заболеваний. Кроме того, эти соединения могут применяться для лечения астмы, бронхитов 5. Перспективным подходом к получению ^-нифеналола и 5-соталола является синтез на основе оптически чистых энантиоме-ров 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола, которые
могут быть получены кинетическим разделени-
2
ем рацемического спирта с использованием биокатализаторов 6-8 и конвертированы в це-2
левые аминоспирты .
В настоящей работе в качестве подобных биокатализаторов были испытаны 9 бактериальных культур, способных осуществлять гидролиз винилацетата (донора ацетильных групп в процессах ацетилирования) в 0.1М фосфатном буфере, а также коммерческий ферментный препарат Novozyme 435.
В результате систематического исследования процесса ацетилирования рацемического 2-бром-1-(4-нитрофенил)-этанола (3 г/л) ви-нилацетатом (20 г/л) при 30 °С в различных органических растворителях (толуоле, тетра-гидрофуране, изооктане), а также в бинарных смесях изооктана с тетрагидрофураном (26%) или ацетоном (5%) в присутствии биокатализаторов было обнаружено, что наиболее быстро процесс протекает в системе изооктан-ацетон. В остальных растворителях биокатализаторы не работали или проявляли лишь небольшую активность (выход продукта не превышал 1—2 %).
В системе изооктан—ацетон при 30 оС наиболее активно катализировал реакцию ферментный препарат Novozyme 453 (рис. 2). При использовании клеточных биокатализаторов в этих же условиях наибольший выход продукта был получен в присутствии обезвоженных ацетоном клеток культуры Bacillus sp. 77-34 и не-идентифицированных бактерий 59-3.
сЗ
н
и
:
о
а
с
:
о
й
3
И
З5
З0
25
20
15
10
Y'
У
/
✓ щ
✓ 1 1
■I а II II _ _ 1
Рис. 2. Выxoд 2-бpoм-1-(4-нитoфeнил)этилaцeтaтa 4epe3 2 суток aцeтилиpoвaния paцeмичecкoгo 2-бpoм-1-(4-нитpoфeнил)этaнoлa (3 г/л) винилaцe-тaтoм (20 г/л) ^и 30 oC в бинapнoй систємє raoo^ тaн-aцeтoн (5%) в пpиcyтcтвии paзличныx биoкaтa-лизaтopoв (Novozyme 435 — 10 г/л, клєтки микpo-opгaнизмoв — 50 г/л): 1 — Novozyme 45З; 2 — Bacillus sp. 77-1; З — Bacillus sp. K-1-1; 4 — Pseudomonas sp. 77-ЗЗ; 5 — Bacillus sp. 77-З4; б — Rhodococcus sp. 78-5; 7 — Диз 15/1; 8 - Диз V42; 9 - 59-З.
Анализ энантиомерного состава рацемического 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола в ходе трансформации в присутствии ферментного препарата Novozyme 435 в изооктане, содержащем 5% ацетона, методом энантиоселек-тивной газожидкостной хроматографии на колонке с ^-циклодекстрином в качестве хиральной фазы показал (рис. 3), что один из энантиомеров субстрата (время удерживания
— 34.6 мин) ацетилируется быстрее, чем его оптический антипод (время удерживания — 34.9 мин).
5
0
1
- ПИД-1, мВ ПИД-1 -250 -200 Время, мин I 34,950
-150 |
-100 \
- 50 .! V.
О 31 32 33 34 35 36 мин
А
ПИД-1. мВ ПИД-1 -175 -150 Время, мин f\
- 125 \
- 100
J І І
} 31 32 33 34 35 3© мин
Б
Рис. 3. Состав реакционной смеси до (А) и после (Б) трансформации рацемического 2-бром-1-(4-нитрофе-нил)этанола (3 г/л) винилацетатом (20 г/л) при 30 оС в бинарной системе изооктан-ацетон (5%) в присутствии липазы Ыоуогуше 435 (10 г/л) в течение 2 суток
Аналогичные результаты были получены при исследовании динамики энантиомерного состава субстрата в ходе трансформации рацемического 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола в присутствии клеток Bacillus sp. 77-34. В тоже время было обнаружено, что в присутствии биокатализатора 59-3 энантиомерный состав субстрата в ходе трансформации не меняется .
Следует отметить, что судить об энантио-мерном составе продуктов биотрансформации (время удерживания — 31.9 мин, рис. 3) по результатам ГЖХ-анализа оказалось невозможным, поскольку рацемический 2-бром-1-(4-нитрофенил)этил ацетат не удается разделить на энантиомеры с помощью используемой энантиоселективной колонки.
Энантиомерный избыток одного из энан-тиомеров остаточного субстрата, полученный в исследуемых условиях (при 30 оС), составил 39% при использовании ферментного препарата и 15% в случае применения клеток Bacillus sp. 77-34.
Обнаружено, что увеличение температуры до 45 оС приводит к существенному ускорению реакции в присутствии липазы Novozyme 435. Выход 2-бром-1-(4-нитофенил)этилацета-та через 80 ч трансформации при 45 оС достигает 54.2% (рис. 4). При этом энантиомерный избыток оставшегося энантиомера 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола превышает 95%.
Таким образом, в результате исследований обнаружен энантиоселективный биокатализатор Novozyme 435, перспективный для получения предшественников ^-нифеналола и 5-соталола из рацемического 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола.
cN
cd
о
р
п
ч
о
X
3
m
60
5O
4O
30
2O
l0
0
□ выход продукта
I энантиомерныи избыток остаточного субстрата
HIB
l20
l00
S0
б0
40
20
0
и
о
н
Я
ю
со
S
«
я
К
Л
30 35 45
Температура, оС
Рис. 4. Выход продукта и энантиомерный избыток превалирующего энантиомера субстрата в реакционной смеси после ацилирования рацемического 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола (3 г/л) винилацетатом (20 г/л) в бинарной системе изооктан—ацетон (5%) в присутствии Ыоиогутв 435 (10 г/л) при различных температурах в течение 80 ч
Экспериментальная часть
Спектры ЯMP 1Н и ЯMP 13С записаны на спектрометре Bruker AM-300 и AMX-300 (с рабочей частотой 300 и 75 M^ соответственно).
Текущие концентрации субстрата и продукта ацетилирования (R, 5)-2-бром-1-(4-нит-рофенил)этанола в реакционной массе определяли на хроматографе «Хроматэк Кристалл» с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке 25m х 0.32mm x 0.52^m HP-1. Peжим анализа: градиент температуры термостата колонки - 200-290 оС, скорость нагрева - 10 оС /мин, температура детектора
- 300 оС, температура испарителя 300 оС, скорость газа-носителя (гелий) - 31 мл/мин. Для определения энантиомерного состава субстрата использовали энантиоселективную колонку 30m х 0.25mm х 0.25^m Beta DEXTM 110. Pe-жим анализа: градиент температуры термостата колонки - 100-200 оС, скорость нагрева -5 оС /мин, температура детектора - 220 оС, температура испарителя - 220 оС, скорость газа-носителя (азот) - 10.9 мл/мин.
Ацетилирование R,5-(±)-2-бpoм-1-(4-нит-рофенил)этанола (3 г/л) винилацетатом (20 г/л) в присутствии препарата липазы Novozyme 435 (10 г/л) или обезвоженных ацетоном клеток микроорганизмов (50 г/л) осуществляли в органических растворителях (толуоле, тетрагидрофуране, изооктане) или бинарных смесях изооктана с тетрагидрофура-ном (26%) или ацетоном (5%) при температуре 30, 35 или 45 °С и постоянном перемешивании в течение 2-5 сут.
Mикpoopганизмы выращивали на агари-зованном панкреатическом гидролизате рыбной муки (35 г/л). Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 oQ Выращивание микроорганизмов проводили в чашках Петри в термостате при 30 ^ в течение 24-72 ч. Выращенную
культуру собирали с поверхности среды, трижды промывали 0.05 M фосфатным буфером (pH 7). Полученную биомассу микроорганизмов обезвоживали ацетоном (1:3 (об/об)) и высушивали при комнатной температуре.
2-бром-1-(4-нитрофенил)этанол. Спектр ЯMP 1Н (8, м.д.): 3.15 с (1Н, ОН), 3.45-3.70 м (2Н, СН^г), 4.94-5.1 м (1Н, СНОН), 7.55-8.21 м (4Н, Ar). Спектр ЯMP 13C (8с, м.д.): 39.15 (1С, СН2Вг), 72.67 (1С, СНОН), 123.81 (2C, At), 127.05 (2C, AO, 147.64 (1C, At), 147.79 (1C, At).
2-бром-1-(4-нитрофенил)этилацетат. Спектр ЯMP 1Н (8, м.д.): 2.08 с (3Н, СН3), 3.8 д (2Н, СН^г), 5.85 м (H, ОТОАс), 7.53 (2H, At), 8.35 (2H, At). Спектр ЯMP 13C (8с, м.д.): 21.1 (1С,СН3), 36.64 (1С, СН2Вг), 73.6 (1H, CHOH), 125.46 (2C, Ar), 126.35 (2C, At), 143.9 (1C, Ar), 148.1 (1C, Ar), 171.87 (1C, C=O).
Литература
1. Agustian J., Kamaruddin A.H., Bhatia S. // Process Biochemistry.- 2010.- V.45.- P.1587.
2. Murmann W., Rumor G., Gamba A. // Bull. Chim. Farm.- 1967.- V.106.- P.609.
3. Ikeo T., Nagao T., Yabana H., Nakajima H. // Jpn. J. Pharmacol.- 1985.- V.39.- P.191.
4. Baskin E., Serik C., Wallace A., Jurkiewicz N., Winquist R., Lynch J., Jr. // Drug Dev. Res.-1992.- V.26.- P.481.
5. Kapoor M., Anand N., Ahmad K., Koul S., Chimni S.S., Taneja S.C., Qazi G.N. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2005.- V.16.- 717.
6. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев P. Н. / / Poccийcкий химический журнал- 2011.-Т. 55, №1.- С.77.
7. Зорин В. В., Петухова Н. И., Халимова Л. X. / Панорама современной химии Poccии. Современный органический синтез: Сб. обзорных статей.- M.: Химия, 2003.- С.439.
8. Зорин В. В., Петухова Н. И. / Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- M.: Химия, 2006.- C. 280
