CC BY
30
УДК 579.66:547.94
А. А. Шараева (асп.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), И. Г. Шакиров (студ.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Парциальное ацетилирование рацемического 1-гептен-3-ола винилацетатом в присутствии клеток морфологических диссоциантов актинебактерий Rhodococcus sp. USPTU-21
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: biocatnp@yandex.ru
A. A. Sharaeva, N. I. Petukhova, I. G. Shakirov, V. V. Zorin
Partial acetylation of racemic 1-hepten-3-ol by vinyl acetate in presense of morphologically dissotiated cultures of actinobacteria Rhodococcus sp. USPTU-21
Ufa State Petroleum Techniologcal University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: biocatnp@yandex.ru
Исследован биокаталитический метод получения (5)-1-гептенил-3-ацетата с помощью морфологических Л- и 5-диссоциантов культуры Якойососст sp. иБРТи-21. Показано, что парциальное ацилирование рацемического 1-геп-тен-3-ола винилацетатом в изооктане, содержащем 5% ацетона, в присутствии 5-диссоцианта, образующего слизистые колонии при росте на агаризованной среде за счет образования внеклеточного полимера, протекает более быстро и с большим выходом продукта — (5)-1-гептенил-3-ацетата, чем в присутствии клеток И-диссо-цианта. В то же время в присутствии клеток Л-диссоцианта, формирующего морщинистые колонии и неспособного синтезировать внеклеточный полимер, ацилирование протекает более селективно и позволяет получать более энантио-мерно чистый (5)-1-гептенил-3-ацетат.
Ключевые слова: актинебактерии; диссоциация культур микроорганизмов; парциальное ацилирование; КЬойососсш; энантиоселектив-ный биокатализ.
The biocatalytic method of (S)-1-heptenyl-3-acetate by morphologically dissotiated R- and S-cultures of Rhodococcus sp. USPTU-21 was studied. It is shown that partial acylation of racemic 1-hepten-3-ol by vinyl acetate in isooctane containing 5% acetone in presense of S-dissotiant forming mucous colonies on agar medium due exopolymer synthesis occurs more rapidly and leads to higher yield of product — (S)-1-heptenyl-3-acetate compare to R-dissotiant cells. However in presense of R-dissotiant cells forming rugous colonies and unable to produce extracellular polymer, the acylation occurs more selectively and allows to obtain more enantio-merically pure (S)-1-heptenyl-3-acetate.
Key words: enantioselective biocatalyse; partial acetylation; actinobacterteria; Rhodococcus; dissotiation.
Актинобактерии рода Якойососсш обладают широким спектром ферментативной активности (оксидоредуктазной, эстеразной, эпок-сидгидролазной, амидазной, нитрилазной и др.) 1-4, благодаря чему они широко используются в процессах биотрансформации органических соединений для получения лекарственных препаратов и других практически важных соединений)5-8.
Ранее на основе актинобактерий ЯНоёососсш $р. 77-32 был разработан клеточный биоката-
лизатор, способный осуществлять энантиосе-лективную биотрансформацию рацемического 6-бензилокси-2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8-тетра-метилхромана в 8-(—)-6-бензилокси-2(2-гидро-ксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхроман 9, являющийся ключевым синтоном при получении природных цитопротекторов, таких как -токоферол и а-токотриенол, а также их аналога МЮЬ-73404, обладающего антиоксидантной активностью 10. Штамм Якойососсш $р. 77-32 депонирован в коллекции культур микроорга-
Дата поступления 30.10.13
низмов Уфимского государственного нефтяного технического университета под номером USPTU-21.
Вместе с тем было обнаружено, что данная культура подвержена диссоциации: на плотных питательных средах обнаруживаются одновременно блестящие, гладкие из-за наличия внеклеточного полимера колонии ^-формы), а также морщинистые, матовые колонии (^-формы) 11.
Известно, что в основе морфологической диссоциации бактериальных культур лежат внутригеномные перестройки с участием вне-хромосомных или мобильных генетических элементов 12,13. Биохимические свойства морфологических диссоциантов могут существенно отличаться: S-клетки Rhodococcus sp. наиболее активно продуцируют ферменты, катализирующие трансформацию стероидов; М-клетки, обладающие среди диссоциантов минимальной толщиной клеточной стенки, синтезируют наибольшее количество внеклеточных протеаз (Rhodococcus rubropertinctus) и экзополисахаридов (Rhodococcus rubroper-Нп^ш); R-клетки обладают максимальной толщиной клеточной стенки и проявляют повышенную устойчивость к токсическим веществам, например пиридину (Rhodococcus aquo-sus), в процессах их деградации 12.
Развитие гетерогенности популяции в результате диссоциации микроорганизмов является важнейшей причиной нестабильности биотехнологических процессов и может приводить к полной потере целевой ферментативной активности культуры 14. Для создания эффективных и стабильных биотехнологических процессов получения оптически активных спиртов с помощью клеток родококков необходимо учитывать возможные биохимические различия между их морфологическими диссо-циантами.
В настоящей работе с целью выявления биохимических различий между R- и S-диссо-циантами культуры Rhodococcus sp. USPTU-21 изучен процесс парциального ацилирования рацемического 1-гептен-3-ола винилацетатом в
присутствии обезвоженной ацетоном биомассы этих микроорганизмов. Процесс имеет практическое значение, поскольку оптически чистые R- и S-энантиомеры 1-гептен-3-ола и 1-гепте-нил-3-ацетата используются в синтезе веществ, широко применяемых в пищевой, фармацевтической и агрохимической промышленности. В частности, оптически чистый ^)-гепт-1-ен-3-ол и его сложные эфиры применяются в синтезе виски-лактона — вкусового компонента виски, вина, бренди, который, как известно, экстрагируется из дубовых бочек, использующихся для выдерживания этих напитков 15-18, а также бутилфталида 19, обладающего противоопухолевой, инсектицидной, нематоцидной и противогрибковой активностью 20,21 (схема 1).
Кроме того, на основе ^)-1-гептен-3-ола разработаны способы получения энантиосе-лективных фаз для разделения энантиомеров хиральных органических соединений методами капиллярной газовой и жидкостной хроматографии 22.
Биомассу микроорганизмов получали культивированием на неуглеводной среде РА (ага-ризованном панкреатическом гидролизате рыбной муки), на которой происходит постепенное развитие гетерогенности популяции S-клеток Rhodococcus sp. USPTU-21 и обогащение ее R-клетками 23,24, а также на угле-водсодержащей среде СА (сусло-агаре), способствующей образованию внеклеточных полисахаридов у микроорганизмов. Для трансформации использовали клетки микроорганизмов, промытые 0.2 М фосфатным буфером (рН 7) и обработанные ацетоном с целью их обезвоживания и пермеабилизации.
Ацетилирование рацемического 1-гептен-3-ола осуществляли в течение 24 ч при 35 оС в изооктане, содержащем 5% ацетона, в котором предварительно растворяли субстрат.
В результате исследования трансформации 1-гептен-3-ола с помощью клеток, полученных на среде РА, было обнаружено, что клетки Б-формы Rhodococcus sр. USPTU-21 значительно активнее катализируют парциальное ацилирование ^^)-1-гептен-3-ола по сравнению с клетками R-диссоцианта.
О
Ви Ви
19 (8)-17 18
Схема 1
При концентрации субстрата 5 г/л начальная скорость ацилирования при использовании слизистого S-диссоцианта в 1.6 раз выше по сравнению с неслизистым R- диссоци-антом (рис. 1). Вероятно, это связано с большим содержанием в клетках S-диссоцианта фермента (ов), участвующих в ацетилирова-нии 1-гептен-3-ола, или с более высокой проницаемостью поверхностных структур S-клеток для субстрата и продукта реакции, вследствие, например, более тонкой клеточной стенки, что
характерно для диссоциантов, синтезирующих
12
экзополимеры .
1,2 1 0,8 0,6 0,4
- S-клетки клетки
(табл. 1). При этом выход продукта через 48 ч трансформации приближается к уровню, достигаемому в случае использования в качестве биокатализатора клеток S-диссоцианта.
Таблица 1
Парциальное ацилирование (Я,5)-1-гептен-
3-ола (5 г/л) винилацетатом (20 г/л) в изооктане, содержащем 5% ацетона, при 35 0С с помощью биокатализаторов, полученных на среде РА
Клеточные катализаторы на основе диссоциантов №060000013 эр. иБРТи-21 Выход продукта, % Энантио-мерный избыток продукта, %
24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
Б-форма 24 66 38.6 31
Я-форма 16 60 68.4 57.3
£ 0,2
2 4 6 8 10
Концентрация субстрата, г/л
Рис. 1. Влияние концентрации субстрата на начальную скорость ацетилирования (R,S)-1-гептен-3-ола винилацетатом (20 г/л) в изооктане, содержащем 5% ацетона, с помощью биокатализаторов (50 г/л), полученных на основе клеток R- и S-диссоциантов Rhodococcus sр. USPTU-21 при 35 оС
Сравнение энантиомерной чистоты продуктов ацетилирования рацемического 1-геп-тен-3-ола винилацетатом в присутствии R- и S-клеток Rhodococcus sp. USPTU-21 и Novo-zyme 435 методом энантиоселективной газожидкостной хроматографии показало, что изученные клеточные биокатализаторы работают так же, как и ферменты в соответствии с правилом Казлаускаса 25, конвертируя преимущественно S-энантиомер ^^)-1-гептен-3-ола в ^)-1-гептенил-3-ацетат (схема 2).
При оптимальной концентрации субстрата (5 г/л) наиболее селективно протекает процесс при участии клеток неслизистого R-варианта актинебактерий, полученных на среде РА
Аналогичные результаты получены при использовании для трансформации гептен-3-ола биомассы микроорганизмов, выращенной на углеводсодержащей среде СА: клетки S-формы Rhodococcus sp. USPTU-21 были более активными, а клетки R-формы — более селективными (табл. 2). При этом клетки обоих диссоциантов, выращенные на среде СА (табл. 2), по своей эффективности превышали R- и S-клетки, полученные на среде РА (табл. 1).
Таблица 2
Парциальное ацилирование (Я,5)-1-гептен-3-ола (5 г/л) винилацетатом (20 г/л) в изооктане, содержащем 5% ацетона, при 35 0С с помощью биокатализаторов, полученных на среде СА
Клеточные катализаторы на основе диссоциантов ИЬобоооооиэ эр. иБРТи-21 Выход продукта, % Энантио-мерный избыток продукта, %
24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
Б-форма 35 73 61 12
Я-форма 20 60 87 65
Таким образом, полученные результаты показывают, что клетки морфологических дис-социантов актинебактерий Rhodococcus sp.
0
OH
rac-1-гептен-3-ол
O
биокатализатор
O
OH
а
Л
+
(Я)-1-гептен-3-ол ^)-1-гептенил-3-ацетат
Схема 2
USPTU-21 отличаются друг от друга не только активностью, но и селективностью в биокаталитическом процессе парциального ацетили-рования рацемического 1-гептен-3-ола винила-цетатом. ^иболее чистый ^)-1-гептенил-3-ацетат (87% ее) при выходе 20% получается через 24 ч трансформации с помощью клеток R-диссоцианта Rhodococcus sp. USPTU-21, выращенных на среде CA (табл. 2). Увеличение продолжительности трансформации до 48 ч приводит к увеличению выхода продукта до 60%, но существенно снижает его энантиомер-ную чистоту (до 65% ее). Использование этих биокатализаторов в препаративных целях для получения энантиомерно чистых продуктов требует разработки способа подавления активности побочного фермента (ов) с противоположной энантионаправленностью, участвующего в процессе парциального ацилирования ^^)-1-гептен-3-ола.
Экспериментальная часть
Mикрооргaнизмы выращивали в чашках Петри в термостате при 28-30 °C в течение 3 сут на агаризованном панкреатическом гид-ролизате рыбной муки (среда РА), а также на агаризованном сусле (среда CA). Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 oC. Выращенную биомассу отделяли центрифугированием, трижды промывали 0.2M фосфатным буфером ^H 7). Отмытую от среды биомассу трижды обрабатывали ацетоном для обезвоживания и пермеабилизации клеток. Полученный порошок биокатализатора высушивали при комнатной температуре.
Ацетилирование ^^)-1-гептен-3-ола (110 г/л) винилацетатом (20 г/л) в присутствии обезвоженных ацетоном клеток микроорганизмов (50 г/л) осуществляли в органическом растворителе изооктане при температуре 35 oC и постоянном перемешивании в течение 24-48 ч.
Текущие концентрации и энантиомерный состав субстрата и продукта ацетилирования
Литература
1. Wang Mei-Xiang, Lu Gang, Ji Gai-Jiao, Huang Zhi-Tang, Meth-Cohnb Otto and Colbyb John. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2000.- №11.-P.1123.
2. Panda T., Gowrishankar B. S. // Appl. Microbiol Biotechnol.- 2005.- № 67. P.160.
3. Зорин В. В., Петухова H. И. / Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- M.: Химия, 2006.- C.280.
(^,5)-1-гептен-3-ола в реакционной массе определяли на хроматографе Хроматэк Кристалл с пламенно-ионизационным детектором на энантиоселективной колонке 30m х 0.25mm х х0.25мт Beta DEXTM 110. Режим анализа: температура термостата колонки — 80 0С, температура детектора — 190 оС, температура испарителя — 190 оС, скорость газа-носителя (азот) — 110.9 мл/мин.
Для определения энантионаправленности реакций, катализируемых клетками тестируемых микроорганизмов, в качестве контроля использовали реакцию, осуществляемую с помощью фермента Novozyme 435, который, как известно, в аналогичных процессах проявляет высокую стереоспецифичность (Е > 150) в отношении (5)-1-гептен-3-ола 25. В наших условиях энантиомерный избыток (5)-1-гептен-3-ола, полученного с помощью Novozyme 435 также достигал высокого значения — более 99% ее при 52%-й конверсии субстрата.
Спектры ЯМР и 13С записывали в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — остаточный сигнал CHCl3 или ТМС.
1-гептен-3-ол. Спектр ЯМР !H, 8, м. д.: 0.90 т (3Н, СН3, J 7 Гц), 1.27-1.41 м (4Н, 2СН2), 1.46-1.58 м (2Н, С4Н2), 2.25 уш.с (1Н, ОН), 4.08 к (1Н, СНОН, J 6.6 Гц), 5.09 д (1Н, =С!Нцис, J 10.4 Гц), 5.21 д (1Н, =С1НТранс, J 17.0 Гц), 5.80-5.92 м (1Н, =С2Н). Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 13.90 (C7), 22.52 (С6), 27.41 (С5), 36.62 (С4), 73.10 (С3), 114.33 (С1), 141.30 (С2).
(Б)-Гепт-1-ен-3-илацетат. Спектр ЯМР !H, 8, м. д.: 0.90 т (3Н, СН3, J 6.9 Гц), 1.181.32 м (4Н, 2СН2), 1.60 т (2Н, СН2СНО, J 7.3 Гц), 2.06 с (3Н, СН3СОО), 5.13-5.25 м (3Н, СН2=, СНО), 5.72-5.84 м (1Н, СН=). Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 13.78 (С7), 21.04 (СН3СО), 22.31 (С6), 27.08 (С5), 33.76 (С4), 74.70 (С3), 116.31 (С1), 136.55 (С2), 170.18 (СН3СО).
References
1. Wang Mei-Xiang, Lu Gang, Ji Gai-Jiao, Huang Zhi-Tang, Meth-Cohnb Otto and Colbyb John Tetrahedron: Asymmetry. 2000. no.11. P. 1123.
2. Panda T., Gowrishankar B. S. Appl. Microbiol Biotechnol. 2005. No.67. P.160.
3. Zorin V. V., Petukhova N. I. Panorama sovremennoi khimii. Yspehi organicheskogo kataliza i himii geterosziklov [Panorama of modern chemistry. Advances of Organic Catalysis and heterocyclic chemistry].— Moscow: Khimiia Publ., 2006. P.280.
4. Зорин В. В. Петухова Н. И. / Природные и синтетические биологически активные вещества.-М.: Химия, 2008.- С.77.
5. Ившина И. Б., Куюкина М. С., Костарев С. М. // Экологическая и промышленная безопасность.- 2003.- №9.- C.116.
6. Chih-Wen Liu, Hwai-Shen Liu. // Process Biochemistry.- 2011.- №46.- P.202.
7. Larkin M. J., Kulakov L. A., Allen C. CR. // Current Opinion in Biotechnology.- 2005.-№16.- P.282.
8. Kayser K. J., Bielaga-Jones B. A., Jackowski K., Odusan O., Kilbane II J.// J. of General Microbiology.- 1993.- №139.- P.3123.
9. Хабибуллина И. И., Сучкова Е. В., Петухова Н. И. и др. / Химия и медицина: материалы II Всерос. науч. конф.- Уфа, 2005.- С.166.
10. Coffen D. L., Cohen N., Pico A. M., Schmid R., Sebastian M. J., Wong F. // ChemInform.-1995.- V.26.- P.26.
11. Милько Е. С., Егоров Н. С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации.-М.: Изд-во МГУ, 1991.-144 с.
12. Плакунов В. К., Николаев Ю. А. Основы динамической биохимии.- М.:Логос.- 2010.- 216 с.
13. Iwabuchi N., Sunairi M.// Actinomycetology.-1997.- №23.- P.11.
14. Милько Е. С., Максимович М. О., Лопатина Л. И., Породенко Е. В. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2010.- №5.- C.538.
15. Tomioka K. , Ishiguro T., Iitaka Y. and Koga K. // Tetrahedron.-1984.- V.40, №8.- P.1303.
16. Tomioka K., Ishiguro T., Koga K. // Tetrahedron Letters.-1980.- V.21.- P.2973.
17. Tanaka T.and Kouno I. // J. Nat. Prod.- 1996, V.59.- P.997.
18. Otsuka K., Zenibayashi Y., Itoh M. and Totsu-ka A. // Agr. Biol. Chem.- 1974.- V.38, №3.-P.485.
19. Fujii M., Fukumura M., Hori Y., Hirai Y., Akita H., Nakamura K., Toriizukaa K. and Idaa Y. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2006.- V.17.- P.2292.
20. Li J., Li Y., Ogleb M., Zhoua X., Song M., Ping Yua Sh., Wei L. // Brain research.- 2010.-P.216.
21. Kosaka M., Sekiguchi S., Naito J., Uemura M., Kuwahara Sh., Watanabe M., Harada N., and Hiroi K. // Chirality.- 2005.- V.17.- P.218.
22. Aggarwal S. K., Bradshaw J. S. , Eguchi M., Parry S., Rossiter B. E. , Markides K. E., Lee K. L. // Tetrahedron.- 1987.- V.43, №3.- P.451.
23. Шараева А. А., Петухова Н. И., Зорин В.В. // Нефтегазовое дело.- 2012.- Т.10, №3.- C.151.
24. Шараева А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2012.- Т.19, №4.- С.68.
25. Chojnacka A., Obarab R. and Wawrzennczyk C. // Tetrahedron: Asymmetry.-2007.- V.18.-P.101.
4. Zorin V. V., Petukhova N. I. Prirodnye i sinteticheskie biologicheski aktivnye veshches-tva [Naturally occurring and synthetic biologically active compounds]. Moscow: Khimiia Publ., 2008. P.77.
5. Ivschina I. B., Kuyukina M. S., Kostarev S. M. Ekologicheskaia i promyshlennaia bezopasnost'. 2003. No.9. P.116.
6. Chih-Wen Liu, Hwai-Shen Liu Process Biochemistry. 2011. No.46. P.202.
7. Larkin M. J., Kulakov L. A., Allen C. CR. Current Opinion in Biotechnology. 2005. No. 16. P.282.
8. Kayser K. J., Bielaga-Jones B. A., Jackowski K., Odusan O., Kilbane II J. J. Journal of General Microbiology. 1993. No.139. P.3123.
9. Khabibullina I. I., Suchkova E. V., Petukhova N. I. Khimiya i meditsina: materiali II Vseros. nauchn. konf. Ufa, 2005. P.166.
10. Coffen D. L., Cohen N., Pico A. M., Schmid R., Sebastian M. J., Wong F. ChemInform. 1995. V.26. P. 26.
11. Mil'ko E. S., Egorov N. S. Geterogennost' populiatsii bakterii i protsess dissotsiatsii [Heterogeneity of the bacterial population and the dissociation process]. Moscow: Moscow state university Publ., 1991. 144 p.
12. Plakunov V. K., Nikolaev Yu. A. Osnovy dinamicheskoi biokhimii [Fundamentals of dynamic biochemistry]. Moscow: Logos Publ., 2010. 216 p.
13. Iwabuchi N., Sunairi M. Actinomycetology .— 1997. No. 23. P.11.
14. Mil'ko E. S., Maksimovich M. O., Lopatina L. I., Porodenko E. V. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia. 2010. No.5. P.538.
15. Tomioka K. , Ishiguro T., Iitaka Y. and Koga K. Tetrahedron. 1984. V. 40, no.8. P.1303.
16. Tomioka K., Ishiguro T., Koga K. Tetrahedron Letters. 1980. V.21. P. 2973.
17. Tanaka T.and Kouno I. J. Nat. Prod. 1996. V.59. P. 997.
18. Otsuka K., Zenibayashi Y. , Itoh M. and Tot-suka A. Agr. Biol. Chem. 1974. V.38, no.3. P.485.
19. Fujii M., Fukumura M., Hori Y., Hirai Y., Akita H., Nakamura K., Toriizukaa K., Idaa Y. Tetrahedron: Asymmetry. 2006.V.17. P.2292.
20. Li J., Li Y., Ogleb M., Zhoua X., Song M., Ping Yua Sh., Wei L. Brain research. 2010. P. 216.
21. Kosaka M., Sekiguchi S., Naito J., Uemura M., Kuwahara Sh., Watanabe M., Harada N., and Hiroi K. Chirality. 2005. V.17. P.218.
22. Aggarwal S. K., Bradshaw J. S. , Eguchi M., Parry S., Rossiter B. E., Markides K. E., Lee K. L. Tetrahedron. 1987. V.43, no.3. P.451.
23. Sharaeva A. A., Petukhova N. I., Zorin V. V. Neftegazovoe delo. 2012. V.10, no.3. P.151.
24. Sharaeva A. A., Petukhova N. I., Zorin V. V. Bash. khim. zh. 2012. V.19, no.4. P.68.
25. Chojnacka A., Obarab R. and Wawrzennczyk C. Tetrahedron: Asymmetry. 2007. V.18. P.101.
