CC BY
64
УДК 579.66:547.94
Е. В. Комлева (асп.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), С. С. Вершинин (к.х.н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Биомасса продуцента продигиозина — новый инструмент
для органического синтеза
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: bio@rusoil.net
E. V. Komleva, N. I. Petukhova, S. S. Vershinin, V. V. Zorin
The prodigiosin producer's biomass is a new tool for organic synthesis
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; рh. (347) 2431935; е-mail: bio@rusoil.net
Исследована возможность использования в органическом синтезе отработанной биомассы Serratia sp. НС-Р1М — продуцента продигиозина, полученной после экстракции метаболитов ацетоном. Показано, что отработанная биомасса проявляет высокую каталитическую активность в процессах гидролиза сложных эфиров (этилацетата, винилацетата, бутилацетата, бу-тил-2-феноксипропионата) и ацилирования спиртов (бетулина). Установлено, что найденный биокатализатор устойчив к органическим растворителям (ацетону, хлороформу, изоокта-ну) и способен осуществлять региоселективное ацилирование бетулина с образованием 3-О-аце-тилбетулина в качестве единственного продукта.
Ключевые слова: биокатализатор; биотрансформация; продигиозин.
The possibility of use of the waste prodigiosin's producer Serratia sp. HC-P1M biomass obtained from acetone extraction of metabolites was searched. It is shown that waste biomass shows high catalytic activity in the esters (ethyl acetate, vinyl acetate, butyl acetate, butyl-2-pheno-xypropionate) hydrolysis and alcohol (betulin) acylation processes. It is shown, that found biocatalyst is resistant to organic solvents (acetone, chloroform, isooctane) and is able to provide the regioselective acylation of betulin with the formation of 3-O-acetylbetulin as the single product.
Key words: biocatalyst; biotransformation; prodigiosin.
Для эффективной химиотерапии раковых заболеваний необходимы высокоактивные препараты, обладающие избирательным действием в отношении опухолевых клеток, не влияющие на развитие нормальных клеток организма. В этом аспекте значительный интерес вызывает продигиозин, проявляющий противораковую активность в отношении клеточных линий рака печени, груди, ободочной кишки
Дата поступления 29.10.10
Продигиозин синтезируется бактериями рода Serratia, однако его получение путем микробного синтеза ограничивается недостаточно высоким выходом Наряду с оптимизацией условий синтеза продигиозина и созданием продуцентов сверхсинтетиков, актуальным является поиск новых практически важных продуктов, позволяющих осуществлять более полную переработку культуральной жидкости. В настоящей работе была исследована возможность использования отработанной биомассы продуцента, образующейся после экстракции продигиозина ацетоном.
Ранее на примере бактерий родов Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus нами было показано, что клетки, обработанные ацетоном, проявляют эстеразную активность и могут быть использованы в качестве биокатализаторов
процессов кинетического разделения рацемических смесей различных спиртов, кислот и сложных эфиров 2.
Известно, что бактерии рода Serratia способны продуцировать энантиоселективные липазы, использующиеся в органическом синтезе. В частности, внеклеточные энантиоселективные липазы Serratia marcescens используются в хемо-энзиматическом синтезе сердечнососудистого препарата дилтиазема , а также нестероидного противовоспалительного средства флюрбипрофена 4. Однако сведения о применении ферментов (липаз/эстераз), связанных с клетками, в литературе отсутствуют.
При исследовании эстеразной активности отработанной биомассы бактерий Serratia sp. НС-Р1М с повышенной способностью к синтезу продигиозина 5, было обнаружено, что она способна катализировать гидролиз ряда модельных сложных эфиров (этилацетата, бути-лацетата, винилацетата) в 0.1 М фосфатном буфере, в том числе, содержащем 20% ацетона (табл. 1).
Таблица 1
Гидролиз сложных эфиров в присутствии отработанной биомассы Serratia sp. НС-Р1М
Субстрат Растворитель Конверсия, %
этилацетат буфер 100
винилацетат буфер 100
бутилацетат буфер-ацетон (20%) 95
рий Serratia sp. НС-Р1М для катализа процессов кинетического разделения рацемического бутил-2-феноксипропионата.
Было установлено, что данный катализатор способен осуществлять гидролиз бутил-2-феноксипропионата в 0.1 М фосфатном буфере, содержащем 20—50 % ацетона.
COOBu OPh
Н2О
BuOH
СООН
OPh
биомасса
микроорганизмов буфер-ацетон
При этом наиболее активно процесс протекает в системах, содержащих 30—40 % органического растворителя (рис. 1).
2,5
1,5
0,5
20
30 40
Ацетон, %
50
Гидролиз сложных эфиров осуществляли в 0.1 М буфере, содержащем 0—20 % ацетона, 5 г/л субстрата и 30 г/л биокатализатора, при температуре 30 °С и перемешивании на качалке (120 об/мин) в течение 2 ч.
Это указывает на наличие в отработанной биомассе активной эстеразы, устойчивой к действию органического растворителя, что важно для трансформации плохо растворимых в воде органических соединений в водных рас-творах.
Важнейшими из таких соединений, имеющих практическое значение, являются 2-фе-ноксипропионовая кислота и ее эфиры — син-тоны ряда системных селективных регуляторов роста растений, в частности, гербицидов 6. Однако гербицидную активность проявляют в основном (^)-энантиомеры этих соединений, в то время как (5)-антиподы малоактивны и их использование приводит только к загрязнению окружающей среды. Для производства ^-энантиомеров гербицидов требуются соответствующие предшественники. В этом аспекте целесообразно было исследовать возможность использования отработанной биомассы бакте-
Рис. 1. Влияние концентрации ацетона на начальную скорость гидролиза бутил-2-феноксипропиона-та в присутствии отработанной биомассы Serratia sp. НС-Р1М в 0.1М фосфатном буфере (рН 7; t =
30 °С; субстрат — 5 г/л; биокатализатор — 30 г/ л; перемешивание — 120 об./мин).
Однако исследование динамики конверсии рацемического бутил-2-феноксипропиона-та в ходе реакции показало, что катализатор не проявляет энантиоселективных свойств и конвертирует субстрат более, чем на 50%.
100 80 --
s
о а и ш я о И
60 --
40 --
20 0
Время, ч
Рис. 2. Конверсия бутил-2-феноксипропионата в процессе гидролиза в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 40% ацетона, в присутствии отработанной биомассы Serratia sp. НС-Р1М (t = 30 °С;
субстрат — 5 г/л; биокатализатор — 30 г/л; перемешивание — 120 об./мин).
2
0
Альтернативным процессом получения оптически чистых энантиомеров хиральных кислот является алкоголиз рацемических эфи-ров этих кислот в органических растворителях. В связи с этим был изучен процесс алко-голиза бутил-2-феноксипропионата изопропа-нолом в изооктане в присутствии исследуемого биокатализатора. Однако, было обнаружено, что в этих условиях реакция не протекает.
Вместе с тем, было установлено, что отработанная биомасса способна катализировать ацилирование бетулина винилацетатом в хлороформе или его смеси с изооктаном (1:1). Примечательно, что в качестве единственного продукта в этом процессе образуется 3-О-аце-тилбетулин, что свидетельствует о наличии хе-моселективной (региоселективной) специфичности у данного биокатализатора.
HO
CH2OH
OAc
CH2OH
Известно, что бетулин является сырьем для получения бетулиновой кислоты — перспективного противоракового средства, проявляющего высокую цитотоксическую активность, связанную с индукцией апоптоза (программированной гибели клеток) в злокачественных меланомах, опухолях мозга и ряда
7 8
других видов рака .
Благодаря устойчивости к хлороформу и наличию хемоселективных свойств исследуемый биокатализатор может быть использован в тандеме с окислительным биокатализатором в одно-реакторном биокаталитическом методе получения бетулиновой кислоты из бетулина, включающем стадии ацетилирования бетулина винила-цетатом в хлороформе (ацетильная защита 3-ОН-группы), окисления ацилированного продукта по СН2ОН-группе в положении 28 и гид-
ролиза ацилированного предшественника бетулиновой кислоты (снятие ацетильной защиты) 9.
Таким образом, полученные данные позволяют рассматривать биомассу Serratia sp. HC-P1M, обработанную ацетоном, как перспективный клеточный биокатализатор для органического синтеза.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР 1Н и С записывали в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — остаточный сигнал CHCl3.
Бактерии выращивали на среде, содержащей панкреатический гидролизат рыбной муки (35 г/л) и глицерин (10 г/л). Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 45 мин при температуре 120 оС. Выращивание микроорганизмов проводили в чашках Петри при 30 оС в течение 48 ч. Биомассу микроорганизмов собирали с поверхности среды и промывали 0.05 М фосфатным буфером. Промытую биомассу трижды экстрагировали ацетоном, после чего высушивали при комнатной температуре.
Гидролиз сложных эфиров осуществляли в 0.1 М буфере, содержащем 20—50 % ацетона, 5 г/л субстрата (этилацетата, винилацетата, бутилацетата или бутил-2-феноксипропионата) и 30 г/л биокатализатора, при температуре 30 оС и перемешивании на качалке (120 об/мин). Для выделения продукта гидролиза бутил-2-фенок-сипропионата реакционную смесь после удаления биокатализатора центрифугированием (8000 об/мин) обрабатывали раствором Na2CO3 и экстрагировали эфиром. К водному раствору, содержащему 2-феноксипропионат, добавляли 10% раствор HCl до рН<7, после чего смесь экстрагировали эфиром и затем эфирную часть упаривали при пониженном давлении и температуре ~50 оС.
2-Феноксипропионовая кислота, спектр ЯМР *Н (5, м.д.): 1.68 д (3Н, O^CHCOO), 4.78-4.85 к (Н, СНОРЬ), 6.9-7.33 м (5 H, Ph), 10.3 с (Н, OH). Спектр ЯМР 13C (5, м.д.): 18.45 (СН3СНСОО), 71.99 (СНОРЬ), 115.16 (2a-C, Ph), 121.93 (y-C, Ph), 129.69 (2ß-C, Ph), 157.25 (C, Ph), 178.34 (COO).
Алкоголиз бутил-2-феноксипропионата проводили в изооктане, содержащем 5 г/л субстрата и 10 г/л изопропанола, при температуре 30 оС и перемешивании на качалке (120 об/мин).
Протекание реакций гидролиза и алкого-лиза бутил-2-феноксипропионата контролировали хроматографически после удаления из реакционной среды биокатализатора центрифугированием в течение 10 мин при 9000 об/мин. Использовали хроматограф ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором, колонку 3000 х 3 мм с 5% 5Б-30 на хроматоне К-А^ режим анализа: температура колонки — 60— 140 °С, температура испарителя — 200—250 °С, газ-носитель (азот) — 30 мл/мин, водород — 30 мл/мин, воздух — 300 мл/мин.
Ацилирование бетулина проводили в хлороформе или его смеси с изооктаном (1:1), содержащем 0.75 г/л бетулина, 25 г/л винила-цетата, 30 г/л биокатализатора, при температуре 30 оС и перемешивании на качалке (120 об/мин). Ход реакции ацилирования бе-тулина контролировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках для ТСХ «БогЬЫ», в системе растворителей хлороформ—метанол— аммиак в соотношении 100:2:1, используя заведомо синтезированные образцы тритерпено-идов, предоставленные профессором Ф. 3. Га-линым. Пластинки проявляли раствором анисового альдегида с серной кислотой в ледяной уксусной кислоте (2:4:100 соответственно) при 120 оС в течение 3 мин.
Литература
1. Gerber N. N. // CRC Crit. Rev. Microbial.-1975.- V. 3.- P. 469.
2. Зорин В. В., Петухова Н. И. // Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- М.: Химия.-2006.- 280 с.
3. Gao L., Xu J-H., Liu Z-Z. // J. Ind. Microbial. Biotechnol.- 2004.- V. 31.- P. 525.
4. Bae H-A., Lee K-W. // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 2006.- V. 40.- P. 24.
5. Петухова Н. И., Хузина А. В., Файзрахмано-ва Л. C., Муслухов Р. Р., Комлева Е. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж., 2009.- Т. 16, №1.-С. 106.
6. Химическая защита растений /Под ред. Г. С. Груздева.- М.: Агропромиздат, 1987.- 415 с.
7. Galg T., Reimschneider S., Wohlarb W. // Biochemica.- 2000.- №3.- P. 22.
8. Kouz A., Chatterjee P., Pezzuto J. M., Hamann M. T. // J. Nat. Prod.- 2000.- V. 63.- P. 1653.
9. Митрофанов Д. В. Разработка биокаталитических методов получения бетулиновой кислоты из бетулина. Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. техн. наук.- Казань, 2005.- 20 с.
