CC BY
33
УДК 579.66:547.94
Л. Я. Василова (к.т.н., доц.), А. Н. Шакиров (асп.), А. А. Шараева (студ.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Парциальное ацилирование 1-фенилэтанола винилацетатом с помощью клеточных биокатализаторов
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
L. Ya. Vasilova, A. N. Shakirov, A. A. Sharaeva, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Partial acylation of 1-phenylethanol with vinyl acetate by cell biocatalysts
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (3472) 431935, e-mail:_bio@rusoil.net
В результате тестирования 25 бактериальных культур, продуцирующих липазы/эстеразы, найден штамм Bacillus sp. К-3-2, на основе которого получен энантиоселективный клеточный биокатализатор для кинетического разделения рацемического 1-фенилэтанола. В процессе парциального ацилирования винилацетатом (R,S)-1-фенилэтанола в присутствии обезвоженных ацетоном клеток бактерий Bacillus sp. К-3-2 синтезирован (SM—M-фенилэтанол (95.3 % ее) с выходом, близким к теоретическому (48%).
Ключевые слова: микроорганизмы; 1-фенил-этанол; энантиоселективный биокатализ.
An enantioselective cell biocatalyst for kinetic resolution of racemic 1-phenylethanol based on strain Bacillus sp. K-3-2 obtained during the screening of 25 bacterial cultures was found. During the process of partial acylation of (R,S)-1-phenylethanol with vinyl acetate in presense of cells of strain Bacillus sp. K-3-2, dehydrated with acetone, (S)-(—)-1-phenylethanol (95.3% ee) with yield close to theoretical (48%) was synthesized.
Key words: microorganisms; 1-phenylethanol; enantioselective biocatalysts.
Оптически чистые энантиомеры ароматических вторичных спиртов широко используются в современном стереонаправленном синтезе. В частности, R- и 5-энантиомеры 1-фенил-этанола, а также их производные являются синтонами лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным
и антирабическим действием а также приме-
2
няются при создании жидких кристаллов и получении оптически активных полимеров, используемых для разделения рацемических смесей органических энантиомеров 2-4.
Перспективными подходом для получения оптически чистых энантиомеров ароматических вторичных спиртов является парциальное ацилирование их рацемической смеси различными ацильными донорами в присутствии липаз микроорганизмов 5-8.
С целью разработки эффективных клеточных катализаторов для получения оптически чистых энантиомеров ароматических вторичных спиртов нами исследован процесс парциального ацилирования рацемического 1-фенил-этанола винилацетатом в изооктане в присутствии биокатализаторов, полученных на основе клеток различных культур микроорганизмов.
В результате тестирования 25 бактериальных культур, продуцирующих липазы/эстера-зы, были выявлены 6 штаммов, частично обезвоженные клетки которых в выбранных условиях катализировали реакцию ацилирования рацемического 1-фенилэтанола, снижая его концентрацию в реакционной смеси более, чем на 20% (рис. 1).
Дата поступления 21.10.10
Время, ч
—#— Bacillus sp. К-1-1 —*— Bacillus sp. К-3-2
—•— Rhodococcus sp. 77-32R —ш— Bacillus sp. 77-1 —o— Rhodococcus sp. 78-5 — x- Micrococcus sp. 77-9-1
Время, ч
♦ Bacillus sp. К-1-1 a Baciilus sp. К-3-2
—ш— Rhodococcus sp. 77-32R ■ Baciilus sp. 77-1 —o— Rhodococcus sp. 78-5 —x - Micrococcus sp. 77-9-1
Рис. 1. Кинетика убыли рацемического 1-фенилэта-нола при его ацилировании винилацетатом в присутствии обезвоженных ацетоном клеток микроорганизмов в изооктане при 30 °С (1 -фенилэтанол — 5 г/л; биокатализатор — 30 мг/мл; винилацетат — 20 г/л)
При исследовании кинетики накопления 1-фенилэтилацетата, образующегося в процессе трансформации 1-фенилэтанол а в присутствии клеток Bacillus sp. 77-1, наиболее активно снижающих концентрацию субстрата, было обнаружено, что выход продукта через 24 ч не превышал 4% (рис. 2). При этом побочные продукты при трансформации 1-фенилэтано-ла в изученных условиях не были обнаружены в реакционной смеси. Это позволяет предположить, что субстрат или продукт реакции могут сорбироваться клетками данного микроорганизма.
Низкие выходы продукта (не более 34 %) были получены при исследовании большинства биокатализаторов. В то же время, при использовании для ацилирования 1-фенилэтано-ла биокатализатора Bacillus sp. К-3-2 выход продукта был близок к 50%, при 50%-ной конверсии субстрата, что соответствует теоретически возможному уровню этих параметров для высокоселективных процессов кинетического разделения рацемических смесей органических соединений (рис. 2).
Рис. 2. Кинетика накопления 1-фенилэтилацетата при ацилировании рацемического 1-фенилэтанола в изооктане при 30 оС (1-фенилэтанол — 5 г/л; биокатализатор — 30 мг/мл; винилацетат — 20 г/л)
Исследование свойств остаточного субстрата, полученного при использовании клеток Bacillus sp. К-3-2, показало, что данный биокатализатор синтезирует фермент ^R-типа, катализирующий ацилирование преимущественно (^)-(+)-1-фенилэтанола.
ОН
ЮАс
Bacillus sp. K-3-2
R, S-1 -фенилэтанол ОН
OAc
S-(-)-1 -фенилэтанол R-(+)-1 -фенилэтилацетат
Оптическая чистота остаточного (5)-(-)-1-фенилэтанола через 24 ч трансформации составила 95%.
+
Таким образом, найден новый клеточный биокатализатор, перспективный для разработки методов получения оптически чистых энан-тиомеров ароматических вторичных спиртов.
Экспериментальная часть
Бактерии выращивали на агаризованной среде (панкреатический гидролизат рыбной муки — 35 г, вода водопроводная — 1 л) в чашках Петри при температуре 30 °С в течение 48—72 ч. Среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС.
Биомассу микроорганизмов, предварительно отмытую 0.1 М фосфатным буфером (рН=7.0), трижды обрабатывали ацетоном в течение 15 мин. Полученные обезвоженные клетки микроорганизмов высушивали при комнатной температуре.
Ацилирование 1-фенилэтанола винил ацетатом осуществляли в изооктане в присутствии клеточных биокатализаторов в реакционной смеси следующего состава: биокатализатор — 30 мг/мл; субстрат — 5 мг/мл; винилацетат — 20 мкл/мл. Ацилирование исследуемых соединений проводили в течение 24 ч при 30 оС при энергичном перемешивании на возвратно-поступательном шейкере.
Протекание реакции контролировали хро-матографически после удаления из реакционной среды биокатализатора центрифугированием в течение 10 мин при 9000 об/мин. Использовали хроматограф ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором, колонку 3000 х 3 мм с 5% БЕ- 30 на хроматоне К-А"" режим анализа: температура колонки — 100 оС,
температура испарителя — 250 0С, газ-носитель (азот) — 30—37 мл/мин, водород — 30 мл/мин, воздух — 300 мл/мин.
Выделение и разделение (^,5)-спирта и эфира 1-фенилэтанола производили из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 10000 об/мин). Целевые продукты трансформации разделяли на хрома-тографической колонке с силикагелем Merk 60 (0.063—0.200 мм), элюент — гексан:этилацетат (7:3).
Удельное вращение полученных продуктов [а] 20 измеряли на автоматическом поляриметре «Perkin Elmer» 341 при X = 589 нм, температуре 25 оС. Стандартная величина удельного вращения [а]2D для (5)-(-)-1-фенил-этанола -57 (с=5.12, CHCl3), для (R)-(+)-1-фенилэтанола + 58.7 (с=1.03, CHCl3) 9.
Литература
1. Hamada H., Miura T., Kumobayashi H., Matsuda T., Harada T., Nakamura K. // Biotechnol. Lett.- 2001.- V. 23.- P. 1603.
2. Raku T., Tokiwa Yu. // Biotechnol. Lett.-2004.- V. 26.- P. 665.
3. Krishnamurthy S., Chen S. H. // Macromolecules.-1991.- V. 24.- P. 3481.
4. Mastrangelo J.C, Chen S.H. // Macromo-lecules.- 1993.- V. 26.- P. 6132.
5. Saul S., Corr S., Micklefield J. // Angew. Chem. Int. Ed. 2004.- V. 43.- P. 5519.
6. Frings K., Koch M., Hartmeier W. // Enzym. Microb. Technol.- 1999.- V. 25.- P. 303.
7. Hult K., Norin T. // Pure Appl. Chem.- 1992.-V. 64.- P. 1129.
8. Ghanem A, Aboul-Enein H.Y. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2004.- V.15.- P. 3331.
9. Каталог продукции фирмы Aldrich [Электронный ресурс]: http://sigma-aldrich.com.
