CC BY
30
УДК 544.473:577.15
А. Н. Шакиров (асп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.),
Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), С. С. Вершинин (к.х.н., доц.),
А.М. Гильванова (студ.)
Поиск биокатализаторов для кинетического разделения рацемических лактонов
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 431935, e-mail: bio@rusoil.net
A. N. Shakirov, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, S. S. Vershinin, A. M. Gilvanova
Search for the kinetic resolution of racemic lactons biocatalysts
Ufa State Petrolium
1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia;
Исследована способность 63 изолятов почвенных грибов гиролизовать Д-пантолактон низкой оптической чистоты (82% ее) в пантоевую кислоту при 30 оС в фосфатном буфере. Изучено влияние буферной емкости и pH среды на величину конверсии пантолактона. Показано, что увеличение молярности буфера в 4 раза и повышение рН с 7 до 7.4 приводит к увеличению конверсии с 10 до 75 %. Найден новый продуцент энантиоселективной лактоназы (гриб АС-1) осуществляющей преимущественно гидролиз Д-энантиомера пантолактона.
Ключевые слова: лактоназа; пантолактон; энантиоселективный биокатализ.
Хиральные бутиролактоны, как и их производные (соответствующие оксикислоты), входят в состав разнообразных природных соединений и используются в качестве предшественников в синтезе различных фармацевтических препаратов, в частности, ингибитора про-теазы вируса иммунодефицита человека 1-3. Известны различные биокаталитические методы получения оптически чистых соединений 4-6. В случае лактонов наиболее перспективными являются методы кинетического разделения их рацемических смесей с помощью грибных лактонгидролаз (лактоназ), отличающихся высокой энантиоселективностью и активностью, а также способностью работать в условиях высоких концентраций субстрата и продукта 1.
С целью поиска высокоактивного продуцента лактоназы нами была исследована способность 63 изолятов почвенных грибов к гидролизу Д-пантолактона низкой оптической чи-
Technical Univercity
ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
The ability of 63 soil fungi isolates to hydrolyze D-pantolacton of low optical purity (82% ee) inti pantoic acid at 30 oC in phosphate buffer was searched. The influence of butter capacity and medium pH on pantolacton conversion rate was studied. It has been shown, that increase of buffer molarity in 4 times and rising of pH from 7 to 7.4 result in enhancement conversion rate from 10 to 75 %. The new producer of enantioselective lactonase (fungus AC-1) performing prevalent D-enantiomer of pantolacton hydrolysis was found.
Key words: enantioselective biocatalysis;
lactonase; pantolacton.
стоты (82% ее) в присутствии кислотно-основного индикатора. В результате тестирования микроорганизмов была выявлена культура почвенного гриба АС-1, в присутствии которого наиболее быстро (в течение 15—30 мин) повышалась кислотность среды в результате образования пантоевой кислоты. При этом было также установлено, что наибольшую активность проявляла трехсуточная биомасса гриба АС-1, полученная на среде Чапека.
При исследовании трансформации используемого препарата В-пантолактона (20 г/л) в 0.1М фосфатном буфере (рН 7) при 30 оС в течение 4 ч было обнаружено, что конверсия субстрата не превышает 10% (рис. 1). При этом скорость реакции значительно падает после 2 ч реакции, что, вероятно, связано со снижением рН реакционной смеси ниже допустимого уровня.
Дата поступления 22.09.11
H COOH
'OH
D-пангоевая кислота
Это свидетельствут об энантиоселектив-ных свойствах лактоназы гриба АС-1, осуществляющей преимущественно гидролиз Д-энантиомера пантолактона.
О4-Ч
В & и к
о
И
Рис. 1. Трансформация О-пантолактона (82% ее, 20 г/л) при 30 °С в 0.1М фосфатном буфере (pH 7) в присутствии мицелия гриба АС-1 (300 г/л)
Известно, что лактоназы грибов значительно теряют свою активность при рН менее 6 7-9. Наиболее активно протекает ферментативный гидролиз пантолактона в нейтральных и слабощелочных условиях 7-9, однако при рН свыше 7.0 начинает усиливаться процесс щелочного гидролиза субстрата 8.
Действительно, использование для трансформации пантолактона фосфатного буфера большей емкости и щелочности (0.4М, рН 7.4) в присутствии мицелия гриба АС-1 приводит к увеличению конверсии субстрата до 75% (рис. 2). Однако, исследование оптических свойств остаточного лактона, выделенного из реакционной массы в конце трансформации, показало, что он представляет собой смесь Д- и Ь -изомеров с незначительным преобладанием Д-энантиомера ([«]в продукта составляет —3.5о (с=1%, Н2О), в то время как стандартная величина удельного вращения Д-панто-лактона составляет —50о (с=2, Н20)10).
В случае нестереоселективного щелочного гидролиза остаточный лактон должен сохранить свою оптическую чистоту. Однако, в процессе трансформации в присутствии культуры АС-1 оптическая чистота остаточного Д-панто-лактона снижается с 82 до 7% ее.
HO
Время, ч
—о— конверсия —оптическая чистота
Рис. 2. Тpaнсфopмaция пантолактона (20 г/л) при 30 oC в 0.4 M фoсфaтнoм буфере (рН 7.4) в присутствии мицелия гриба AC-1 (300 г/л)
Экспериментальная часть
^е^рь! ЯMP и ^C записывали в
CDC^ на приборе Bruker AM-ЗОО (рабочая частота ЗОО и 75.47 M^ соответственно). Удельное вращение остаточного субстрата измеряли на автоматическом поляриметре «Perkin Elmer» З41 при Я = 589 нм, температура 25 oC. ^андартная величина удельного вращения D-пантолактона [a]D равна —5Оо (с=2, H2O) 10.
Mикpoopгaнизмы выращивали на агари-зованной среде Чапека11 при 25—28 oC в течение трех суток.
Экспресс-тестирование лактоназной активности микроорганизмов осуществляли при ЗО oC в О.1 M фосфатном буфере (рН=7.О), содержащем 2О г/л D-пантолактона (8О% ее) и кислотно-основной индикатор бромтимол блау.
Трансформацию D-пантолактона (82% ее) проводили при температуре ЗО oC при перемешивании в течение З ч. 1ОО мг D-пантолактона (82% ее) растворяли в 5 мл О.1 M фосфатного буфера (pH 7.О) или 0.4M фосфатного буфера (pH 7.4) и добавляли 1.5 г сырой биомассы гриба.
Протекание реакции контролировали хроматографически после удаления из реакционной
среды биокатализатора центрифугированием в течение 10 мин при 9000 об/мин. Использовали хроматограф ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором, колонку 3000 х 3 мм с 5% 5Б-30 на хроматоне К-А'^ режим анализа: температура колонки — 200 °С, температура испарителя — 250 оС, газ-носитель (азот) — 18 мл/мин, водород — 30 мл/мин, воздух — 300 мл/мин.
Выделение остаточного субстрата и продукта трансформации осуществляли из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 5000 об/мин). Пантолактон троекратно экстрагировали равным объемом этилацетата. Реакционную смесь, содержащую пантоевую кислоту, предварительно подкисляли до рН=2.0 с помощью 6М НС1, нагревали на водяной бане при 80 оС в течение 30 мин, после чего образовавшийся лактон трижды экстрагировали равным объемом этилацетата. Экстракты осушали над обезвоженным сульфатом натрия и отгоняли растворитель.
Пантолактон. Спектр 1Н ЯМР в СЭС13 (8, м.д.): 1.04 с (3Н, СН3), 1.18 с (3Н, СН3), 3.94 к (2Н, СН20), 4.16 с (Н, СНОН). Спектр 13С ЯМР в СЭС13 (8с, м.д.): 19.5 (1С,СН3), 23.4 (1С,СН3), 41.08 (1С, С(СН3)2), 75.6 (1С, СНОН), 76.4 (1С, СН20), 177.5 (1С, С=0).
Литература
1. Chen B., Fan L.-Q., Xu J.-H., Zhao J., Zhang X., Ouyang L.-M. // Appl. Biochem. Bio-technol.- 2010.- V.162.— C.744.
2. Zhang X., Xu J.-H., Liu D.-H., Pan J., Chen B. // Biochemical. Engineering J.— 2010.—V.50.— P.47.
3. Hua L., Sun Z.-H., Leng Y., Hu Z.-Q. // Process Biochemistry.— 2005.— V.40.— P.1137.
4. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // Российский химический журнал.— 2011.— V.55, №1.— С. 77.
5. Зорин В. В., Петухова Н. И., Халимова Л. X. / Панорама современной химии России. Современный органический синтез: Сб. обзорных статей.— М.: Химия, 2003.— С.439.
6. Зорин В. В., Петухова Н. И. / Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.— М.: Химия, 2006.— C. 280
7. Yu M.-R., Tan T.-W. // Process Biochemistry.-2005.— V.40.— P.2609.
8. Kataoka M., Shimizu K., Sakamoto K., Yamada H., Shimizu S. // Appl. Microbiol. Biotechnol.— 1995.— V.43.— P.974.
9. Zhang X., Xu J.-H., Xu Y., Pan J. // Appl. Microbiol. Biotechnol.— 2007.— V.75.— P.1087.
10. Каталог на продукцию фирмы Aldrich [Электронный ресурс]: http://sigma-aldrich.com.
11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии /под ред. Н.С. Егорова.— М.: Изд-во МГУ, 1983.— 215 с.
