CC BY
22
Известия ТИНРО
2007 Том 151
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 577.15:594.5
Е.В. Михеев, Н.Н. Ковалев
РОЛЬ ВИДОВЫХ РАЗЛИЧИЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ НЕРВНОЙ ТКАНИ ТИХООКЕАНСКИХ ГОЛОВОНОГИХ
МОЛЛЮСКОВ
Проведено кинетическое исследование каталитических свойств холинэстераз зрительных ганглиев головоногих моллюсков различных семейств. В зрительных ганглиях всех исследованных видов обнаружено присутствие неспецифической аце-тилхолинэстеразы. Показано, что удельная активность фермента и кинетические параметры ферментативного гидролиза являются видоспецифическими признаками. Данные позволяют предположить, что холинэстераза играет адаптивную роль в ходе эволюции головоногих моллюсков, способствуя формированию функциональной организации видов, адекватной меняющимся условиям среды.
Mikheev E.V., Kovalev N.N. Role of interspecies differences of cholinesterase from nerve tissue of pacific cephalopods // Izv. TINRO. — 2007. — Vol. 151. — P. 460-465.
Catalytic properties of cholinesterase (ChE) from optical ganglia of cephalopods belonged to different families are investigated by kinetic analysis. The non-specific ChE was presented in optical ganglia of all investigated species. Its activity was determined by Ellman colorimetric method with acetylthiocholine, propionilthiocho-line, and butyrilthiocholine as substrates. The specific activity and kinetic parameters of the enzyme hydrolysis were determined as specific species attributes. Adaptive role of the ChE in cephalopods evolution was assumed: the enzyme had promoted formation of functional species organization adequate to varying environments.
Введение
Известно, что тесное взаимодействие между организмом и средой обитания осуществляется через нервную систему (Орбели, 1979). Эволюционный прогресс в становлении более активных жизненных форм у головоногих моллюсков, несомненно, должен был сопровождаться изменением скорости синаптической передачи нервного импульса, т.е. совершенствованием их медиаторных систем. Система передачи нервного импульса в зрительных ганглиях является практически чисто холинэргической. По сравнению с мозгом других животных в них установлено большее содержание ацетилхолина (Уиттакер, 1977) и высокая активность холи-нэстеразы (ХЭ) (Бресткин и др., 1997). Это указывает на важность холинэргической системы в целом и ХЭ как отдельного ее звена, от которого зависит скорость передачи нервного импульса. Зрительные ганглии являются наиболее массивными образованиями нервной системы головоногих моллюсков, которые не только обеспечивают зрительную функцию, но и являются интегративными центрами их поведенческих реакций и локомоции (Bullock, Horridge, 1965).
Интерес представляло исследование каталитических свойств ХЭ у представителей различных отрядов и семейств, составляющих основные этапы эволюции головоногих моллюсков. Задачей исследования было определение типов субстратной специфичности ХЭ и их изменчивости в процессе эволюции.
Материалы и методы
Нами проведено исследование свойств ХЭ оптических ганглиев головоногих моллюсков, принадлежащих к различным семействам: осьминог Octopus do-fleini (сем. Octopodidae); каракатица Sepiola birostrata (сем. Sepiolidae ); кальмары семейства Ommastrephidae — Ommastrephes bartrami (род Ommastrephes) и Todarodes pacificus (род Todarodes); — кальмар-светлячок Watasenia scintillans (сем. Enoploteuthidae), командорский кальмар Berryteuthis magister (сем. Gona-tidae).
Источником фермента служили центрифугаты (800 g) водных гомогенатов (10 мг/мл) зрительных ганглиев головоногих моллюсков. В качестве субстратов были использованы ацетилтиохолин (АТХ), пропионилтиохолин (ПТХ) и бути-рилтиохолин (БТХ) (ICN, США). Диапазон использованных концентраций субстратов составлял от 2 • 10-5 до 2 • 10-2 М. Определение активности ХЭ проводили колориметрическим методом Эллмана (рН 7,4, 25 оС, 0,04 М фосфатный буфер) (Ellman et al., 1961). Определение и расчет кинетических параметров ферментативного гидролиза субстратов проводили согласно известной методике (Бре-сткин и др., 1997). Величины скорости ферментативного гидролиза (Vm) и константы Михаэлиса (KM) были рассчитаны с использованием программы Excel.
Результаты и их обсуждение
Как видно на рис. 1, наибольшей активностью ХЭ характеризуется нервная ткань кальмаров сем. Ommastrephidae (O. bartrami и T. pacificus). При этом ХЭ тихоокеанского кальмара (T. pacificus) характеризуется менее выраженной субстратной специфичностью (см. таблицу). Для этой ХЭ соотношение скоростей гидролиза имеет следующий вид — V^ : V : V^ = 100 : 102 : 96, в то время как для ХЭ кальмара Бартрама (O. bartrami) — V^ : V^ : V^ = 100 : 52 : 42. Значительно различались изученные ХЭ и по величинам значений Vm. Преимущество фермента тихоокеанского кальмара для процесса гидролиза АТХ составило 4,1 раза, для ПТХ — 7,9 раза, а для БТХ — 9,3 раза. Различий в значениях величины KM при этом не отмечалось. Выявленные различия в величинах значений максимальных скоростей гидролиза субстратов отражаются и на величине "сродства" субстратов к ферментам (V /КМ).
Рис. 1. Удельная активность ХЭ нервных ганглиев головоногих моллюсков
Fig. 1. ChE activity of cephalopods nervous ganglia
л i-o
0
1 ta
s
£
Я! К Я! I Л
ц
a>
5
1 ,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
6°
т
Ж
<у
461
/
/ f А / /
/ * /
л/ Я? /
jf
Кинетические параметры гидролиза тиосубстратов под действием холинэстераз различных видов головоногих моллюсков Kinetic parameters of substrates hydrolysis by ChE of various species of cephalopods
Субстрат pS, M Параметры V, % мМ/мин рКМ, М отн% ' г М' V /КМ, мин-1 m' М'
Осьминог Octopus dofleini
АТХ 2,6 100 4,46 ± 0,20 222,10
ПТХ 2,9 34 4,35 ± 0,20 57,90
БТХ 1,5 3 4,49 ± 0,20 7,30
Каракатица Sepiola birostrata
АТХ 2,6 100 3,89 ± 0,10 3,90
ПТХ 2,9 64 4,50 ± 0,20 10,00
БТХ 2,6 32 3,89 ± 0,10 1,20
Кальмары
Ommastrephes bartrami
АТХ 1,3 100 3,37 ± 0,10 0,64
ПТХ 1,5 52 3,90 ± 0,10 1,50
БТХ 1,7 42 3,54 ± 0,10 1,00
Todarodes pacificus
АТХ 2,3 100 3,73 ± 0,10 8,20
ПТХ 2,9 102 3,83 ± 0,10 10,70
БТХ 1,9 96 3,55 ± 0,10 5,20
Berryteuthis magister
АТХ 2,1 100 2,90 ± 0,10 2,00
ПТХ 2,1 54 1,99 ± 0,05 2,00
БТХ 2,5 49 0,71 ± 0,03 3,00
Watasenia scintillans
АТХ 2,6 100 4,16 ± 0,20 4,30
ПТХ 2,6 78 4,51 ± 0,20 8,10
БТХ 3,2 28 4,51 ± 0,20 2,90
Примечание. pS = -lg[S]; [S] — концентрация субстрата; PKm = —lgKw
Среди кальмаров ХЭ тихоокеанского кальмара характеризуется в 5-13 раз большим сродством к изученным субстратам. Использование величины "сродства" субстратов к ферменту в сравнительно-энзимологических исследованиях определяется двумя основными причинами. Во-первых, данное соотношение позволяет более реально оценить каталитическую эффективность процесса гидролиза субстрата при концентрациях, встречающихся in vivo, которые, как правило, значительно ниже таковых в экспериментах in vitro. Во-вторых, активные участки ферментов, взаимодействующие с субстратами, обычно одинаковы у гомологичных ферментов различных видов. Следовательно, химизм процесса в гомологичных ферментных реакциях у разных животных одинаков. Выявление различий в величине "сродства", свидетельствующих о различной эффективности каталитического процесса, может являться следствием биохимической (качественной и количественной) адаптации.
Оптические ганглии осьминога характеризуются высоким значением величины удельной активности, причем именно ХЭ осьминога имеет наибольшее значение максимальной скорости гидролиза АТХ и ПТХ. На фоне низких значений величины Km этот фермент обладает наибольшим сродством к изученным субстратам.
Меньшее значение по величине значений удельной активности ферментов определено для ХЭ командорского кальмара (B. magister) и кальмара-светлячка (W. scintillans). Эти две ХЭ различались по субстратной специфичности: для ХЭ
462
W. scintillans скорость гидролиза субстратов уменьшалась по мере изменения структуры субстрата (VATX : VnTX : VBTX = 100 : 78 : 28), в то время как ХЭ B. magister катализировала гидролиз ПТХ и БТХ практически с одинаковой скоростью (VATX : VnTX : VOTX = 100 : 54 : 49). ХЭ оптических ганглиев командорского кальмара характеризуется также и наименьшими значениями величины сродства к изученным субстратам.
Согласно номенклатуре ферментов, основанной на определении субстратной специфичности, исследованные XЭ можно отнести к ацетилгидролазам ацетил-холина (Моралев, Розенгарт, 1999). Полученные нами данные свидетельствуют, что классификация, основанная на определении соотношения скорости гидролиза трех субстратов, дает упрощенное представление о разнообразии каталитических свойств ферментов. Согласно современным представлениям, аминокислотная последовательность XЭ существенно различается у животных разных таксономических групп, а структура активных центров фермента различных видов животных практически идентична (Моралев, Розенгарт, 1999; Моралев и др., 2001). Это, по-видимому, свидетельствует, что процесс адаптации организмов на молекулярном уровне направлен в первую очередь на механизмы аллосте-рического контроля активности фермента, что может привести к замене аминокислотных остатков, не входящих в состав каталитического центра фермента (Taylor et al., 1994; Cousin et al., 1996).
Обнаруженные различия в параметрах ферментативного катализа у головоногих моллюсков разных таксономических групп согласуются с различиями биологии изученных видов — распределением общей биомассы и численности, способами размножения, онтогенетическими перемещениями и суточными миграциями (Несис, 1977).
Формирование жизненных форм головоногих моллюсков, начиная с донных (осьминог) видов или видов, совершающих незначительные вертикальные суточные миграции (командорский кальмар, кальмар-светлячок, каракатица), к видам, для которых характерны значительные миграции (кальмары сем. Ommastrephidae) и различная стратегия пищевого поведения, на биохимическом уровне отражается прежде всего на величине удельной активности XЭ нервной ткани. Стратегия пищевого поведения кальмаров как активных хищников выражается в высокой скорости холинэргических реакций и невысоком сродстве субстратов к ферменту. Для осьминогов, по-видимому, основной стратегией адаптации холинэргичес-кой системы к проявлению единовременных (и кратковременных) реакций пищевого поведения служат более выраженная субстратная специфичность (VATX : : VnTX : VOTX = 100 : 34 : 3) и высокая степень сродства субстратов к ферменту.
Подтверждением приведенных фактов может служить соотношение величин удельной активности в оптических ганглиях головоногих моллюсков (рис. 2). Tак, на рис. 2 видно, что 72 % удельной активности XЭ осьминога обусловлено гидролизом ATX, в то время как в оптических ганглиях активных пловцов и хищников (кальмар Бартрама и тихоокеанский кальмар) удельная активность характеризуется более близкими значениями для гидролиза трех субстратов. Для кальмаров, не совершающих значительных пищевых и онтогенетических миграций, характерна значительная доля (50 % и более) вклада величины удельной активности для процесса гидролиза ATX и наименьшая для процесса гидролиза БTX по сравнению с другими видами. Полученные данные согласуются с положением о функционировании холинэргического синапса (Уиттакер, 1977). Согласно данной теории, при осуществлении передачи нервного импульса, связанного с проявлением быстроты физиологической реакции, избыток медиатора — ацетилхолина — в межсинаптическом пространстве инактивируется (в случае ингибирования AXЭ избытком субстрата) присутствующей иной, чем AXЭ, формой фермента (БуКЭ) либо ферментом синаптической щели, отличным по субстратной специфичности от типичной AXЭ.
463
Watasenia scintillans
18%
<J)
Berryteuthis mag ister Ommastrephes bartrami
БТХ 2 3% ^—„^ W )АТХ ПТХ К/у 54% 23% БТХ 23% w= ПТХ -----
33%
Se pio la birostrata
Octopu s d ofle in i
БТХ
8%
ПТХ /1
2 0% )
V У АТХ
7 2%
Рис. 2. Соотношение величин удельной активности для процесса гидролиза тио-субстратов под действием холинэстераз различных видов головоногих моллюсков
Fig. 2. Parity of sizes of specific ChE activity for thiosubstrate hydrolysis by cephalo-pods ChE
Заключение
Обнаруженные изменения величин кинетических параметров для ХЭ зрительных ганглиев в ряду исследованных видов хорошо коррелируют с общим уровнем их организации. Увеличение активности ХЭ и ее сродства к АТХ указывает на то, что ХЭ, как ключевое звено в передаче нервного импульса, играет адаптивную роль при переходе видов к более активному образу жизни. По-видимому, можно полагать, что высокий уровень активности фермента по типу аце-тилхолинэстераз в зрительных ганглиях предшествовал формированию новых жизненных форм головоногих моллюсков и способствовал экологической экспансии этих видов.
Список литературы
Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н. и др. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. — Владивосток: ТИНРО-центр, 1997. — 466 с.
Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. — 1999. — Т. 53, № 1. — С. 3-14.
Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Суворов А.А. "Каталитическая машина" холинэстераз устроена одинаково // ДАН СССР. — 2001. — Т. 381, № 1. — С. 123-125.
464
Несис К.Н. Вертикальное распределение пелагических моллюсков // Журн. общ. биол. — 1977. — Т. 38, вып. 4. — С. 547-558.
Орбели Л.А. Основные задачи и методы эволюционной физиологии // Эволюционная физиология. Ч. 1. — Л.: Наука, 1979. — С. 12-23.
Уиттакер В.П. Биохимия холинэргического синапса: сравнительные аспекты // Сравнительная фармакология синаптических рецепторов. — Л.: Наука, 1977. — С. 15-26.
Bullock T.H., Horridge G.A. Mollusca: Cephalopoda. The functions of the ganglia and divisions of brain // Structure and function in the nervous system of vertebrates. — San Francisco; L., 1965. — Vol. 1. — P. 1497-1505.
Cousin X., Hotelier L., Lievin P. A cholinesterase genes server (ESTHER): a data base of cholinesterase-related sequences for multiple aligments, philogenetic relationships, mutations and structural data retrieval // Nucleic Acid Res. — 1996. — Vol. 24. — P. 132-136.
Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.J., Featerstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. — 1961. — Vol. 7, № 1. — P. 88-95.
Taylor J.L., Mayer R.T., Himel C.M. Conformers of acetylcholinesterase: a mechanism of allosteric control // Mol. Pharmacol. — 1994. — Vol. 45. — P. 74-83.
Поступила в редакцию 8.06.07 г.
