Адаптивная роль холинэстеразы гемолимфы двустворчатых моллюсков Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

2003

Известия ТИНРО

Том 133

УДК 628.394.6:594

Н.Н.Ковалев

АДАПТИВНАЯ РОЛЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ГЕМОЛИМФЫ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ

Проведено исследование субстратных свойств холинэстеразы гемолимфы двустворчатых моллюсков — анадары Броутона, мидии Грея, модиолуса многощетинистого. Показано, что наибольшей активностью фермента характеризуется гемолимфа анадары. Показана зависимость кинетических параметров гидролиза субстратов от условий обитания моллюсков. Исследованы свойства холинэсте-разы гемолимфы мидии Грея, выловленной в акваториях, различающихся степенью загрязнения солями тяжелых металлов.

Kovalyov N.N. Cholinesterases of hemolymph of bivalve mollusks // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 133. — P. 264-270.

Substrate characteristics of cholinesterase of hemolymph of bivalve mollusks: Anadara broughtoni, Crenomytilus grayanus, and Modiolus kurilensis, were examined with usage of a reference set of thiocholine substrates (acetylthiocholine (ATC), propionylthiocholine (PTC), butyrylthiocholine (BTC)). The hemolymph of Anadara broughtoni was determined as the most active enzyme with 3.9 mmolATCh/mg/ml. The maximal rate of hydrolysis was registered for PTCh hydrolysis under cholinest-erase activity of the Anadara broughtoni hemolymph. Substrate specificity of cho-linesterase was different for the certain species: VATC: VPTC: VBTC = 100: 40: 30 for Crenomytilus grayanus; V : VPTC = 100: 11 for Modiolus kurilensis; VATC: VPTC: : VBTC = 100: 148: 26 for Anadara broughtoni.

Kinetic parameters of hydrolysis of substrates depended on environmental conditions of the mollusks habitat.

Features of cholinesterase of hemolymph of Crenomytilus grayanus caught in different areas distinguished by degree of pollution by salts of heavy metals were explored. There is explained that boosted, in comparison with control area, concentrations of heavy metals lead to inhibition of cholinesterase activity of hemolymph and decreasing of its affinity to substrates.

Adaptation of cholinesterase of Crenomytilus grayanus to chronic antropoge-neous influence resulted to change of substrate specificity of enzymes. The strategy of adaptation to such conditions of habitat was, as a whole, the same as for other bivalves. The ability of enzymes to adapt for boosted concentrations of heavy metals is realized by changing Km value and affinity of substrates to enzymes.

Морские беспозвоночные представляют особый интерес для исследователей как организмы-индикаторы загрязнения окружающей среды, так как способны накапливать в органах и тканях значительное количество различных токсикантов, в том числе тяжелых металлов. Использование животных как индикаторов состояния среды удобно в тех случаях, когда определить содержание металлов в воде затруднительно вследствие их низкой и непостоянной концентрации. Концентрации же металлов в мягких тканях морских животных, в том числе двустворчатых моллюсков, стабильны и точнее отражают среднюю концентрацию металлов в воде (Христофорова и др., 1994; Galloway et al., 2002).

Помимо использования организмов-индикаторов загрязнения окружающей среды, в настоящее время широко развивается направление с использованием биохимических маркеров. Биохимические маркеры дают вполне адекватную информацию о нарушениях состояния гидробионтов в условиях загрязнения (Лукьянова, 1994, 2001). Использование холинэстеразы (ХЭ) как ключевого фермента холинэргической системы, в связи с возможностью оценки как комплексного действия поллютантов, так и индивидуальных химических агентов, представляется перспективным (Fishelson et al., 1994; Payene et al., 1996). Известно, что соли металлов могут угнетать активность ХЭ (Бресткин, Фруентова, 1968).

В настоящее время накопились данные о корреляции между прогрессом общей организации моллюсков, степенью сложности их нервной системы и активностью ацетил-ХЭ. Эта корреляция выражена также в некоторых периферических органах и тканях. Показано, что у моллюсков, прикрепленных к грунту, активность ХЭ составляет в миокарде около 1 мкм АХ/час/г и около 10 мкм АХ/час/в гемолимфе. У подвижных брюхоногих моллюсков активность фермента в миокарде выше и составляет 7-10 мкм АХ/час/г, а в гемолимфе — до 70-100 мкм АХ/час/г. Холинэстеразная же активность гемолимфы у кальмара колеблется около 6-7 мкм АХ/час/г, а в главном жаберном сердце достигает 100-200 мкм АХ/час/г (Григорьева и др., 1967; Турпаев и др., 1967; Розенгарт, 2001). Активность ХЭ в гемолимфе двустворчатых моллюсков достаточно высока, в связи с чем может быть использована как биоиндикатор загрязнения водоемов.

Целью настоящей работы являлось исследование субстратных характеристик ХЭ гемолимфы двустворчатых моллюсков и определение типа стратегии их биохимической адаптации к различным условиям обитания.

Объектами исследования были анадара Anadara broughtoni, модиолус Modiolus difficilis (зал. Петра Великого) и мидия Грея Crenomytilus grayanus, собранная в различных частях видового ареала (зал. Петра Великого Японского моря; о. Итуруп, Охотское море).

Двустворчатые моллюски — одна из массовых групп беспозвоночных, некоторые виды доминируют в сообществах донных организмов. Морских двустворчатых моллюсков можно разделить на 3 большие группы видов: ведущие прикрепленный образ жизни, свободно живущие на субстрате и закапывающиеся в грунт. К первой группе относятся мидия Грея и модиолус, к третьей — анадара.

В качестве фермента использовали центрифугаты гемолимфы двустворчатых моллюсков. Активность холинэстераз определяли спектрофотометрическим методом (Ellman et al., 1961) с использованием в качестве субстратов иодидов ацетил- (АТХ), пропионил- (ПТХ) и бутирилтиохолина (БТХ) (ICN, США). Кинетические константы гидролиза субстратов определяли по Луйнуверу-Берк (Кор-ниш-Боуден, 1979). Концентрацию металлов в гемолимфе моллюсков определяли методом атомно-абсорбционной спектрометрии в пламени на приборе "Nippon Jarel Ash", модель АА-885, после кислотного озоления проб.

Кинетические параметры гидролиза тиосубстратов под действием ХЭ гемолимфы двустворчатых моллюсков показывают, что ХЭ гемолимфы анадары и мидии, в отличие от ХЭ гемолимфы модиолуса, катализировали гидролиз всех трех изученных субстратов. ХЭ гемолимфы модиолуса не катализировала гидролиз БТХ. Следует заметить, что все три ХЭ различались по зависимости скорости гидролиза субстратов от концентрации последних (рис. 1).

Так, величина pS-оптимума для ПТХ и БТХ под действием ХЭ анадары были равны и превышали таковое значение для АТХ. Значение pS-оптимума по всем трем субстратам для ХЭ мидии были ниже, чем для ХЭ анадары. Кроме того, ХЭ модиолуса не имеет четко выраженного пика pS-оптимума по ПТХ: диапазон оптимальных концентраций ПТХ находится в пределах значений pS от 2,3 до 3,6.

Изученные XЭ двустворчатых моллюсков различались по величинам значений удельной активности фермента в 1 мл гемолимфы. Н аи-большими значениями величин удельной активности по всем трем изученным субстратам характеризуется гемолимфа ана-дары. Н аимень-шие значения величин удельной активности получены для ХЭ гемолимфы модио-луса.

ХЭ гемолимфы двустворчатых моллюсков существенно различаются по субстратной специфичности (табл. 1). Так, для ХЭ гемолимфы мидии и модиолу-са характерно снижение активности фермента (Уотн) при увеличении длины алкильного радикала субстрата: для ХЭ мидии — ^АТХ: УПТХ: УБТХ = 100: 40: 30, а

Рис. 1. Зависимость скорости гидролиза субстратов от их концентрации под действием холинэстераз гемолимфы двустворчатых моллюсков

Fig. 1. The dependence of velocity substrate hydrolisis from that concentration by hemo-lymph cholinesterase of shellfish

для ХЭ модиолуса VATX: VnTX = 100: 11.

В то же время ХЭ гемолимфы анадары

характеризуется качественно иной субстратной специфичностью

: VBTX = 100: 148: 26.

V : V :

v ATX v ПТХ'

Таблица 1

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием холинэстераз гемолимфы двустворчатых моллюсков (n = 10)

Table 1

Kinetic parameters of substrate hydrolisis by hemolymph cholinesterase of bicuspid shellfish (n = 10)

Субстрат

ps

V ,

m

мМ/мин

Параметры

Vотн, %

K 10-5,

m '

М

Удельная V /К активность,

m' m, '

мин-1 мкМ/мин/мл

ATX ПТХ BTX

ATX nTX BTX

ATX nTX BTX

3,2-4,3 4,2 4,2

Aнадара Вроутона Anadara broughtoni

86 43 13

2,6

3.2

3.3

2,2 2,3

0,69±0,01 100 0,8±0,03 1,02 ±0,04 148 2,4±0,01 0,18 ±0,001 26 1,4 ±0,01

Мидия Грея Crenomytilus grayanus 0,10±0,01 100 0,9±0,003 0,04 ±0,002 40 3,8±0,04 0,03 ±0,002 30 9,3 ±0,1 Модиолус многощетинистый Modiolus difficilis 2,9 0,09±0,01 100 3,9±0,04 2,3 3,6 0,01 ±0,001 11 1,3±0,02 0,8

Aктивности нет в пределах [S] 210-2 — 210-5 M

11 1,0 0,3

3,9±0,01 5,0±0,05 0,9±0,003

3,4±0,01

1,3±0,005

0,5±0,04

0,5±0,003 0,05± 0,002

Примечание: Р < 0,05.

ХЭ гемолимфы анадары имеет наибольшие значения максимальной скорости гидролиза (Vm) по всем трем изученным субстратам. Так, различия в величинах Vm по сравнению с ХЭ мидии и модиолуса составляли: для процесса гидролиза АТХ — 7 раз; для ПТХ — от 3 раз по сравнению с ХЭ мидии до двух порядков — по сравнению с ХЭ модиолуса. Vm у анадары и мидии при гидролизе БТХ различались в 6 раз.

Несмотря на самую низкую активность фермента в гемолимфе, ХЭ модиолуса характеризуется наибольшим (в 4-5 раз) значением константы Михаэли-са (Km) по АТХ, по сравнению с ХЭ других двустворчатых моллюсков. Наибольшие значения Km по ПТХ и БТХ отмечаются для ХЭ гемолимфы мидии.

Выявленные значительные различия значений кинетических констант оказывают влияние на величину "сродства" (Vm/Km) субстратов к ферментам. Как и ожидалось, наибольшие значения величины "сродства" обнаружены у ХЭ гемолимфы анадары. Значительными оказались и различия в величинах Vm/Km при сравнении ХЭ гемолимфы анадары и ХЭ мидии и модиолуса: различия по АТХ составляли 8-39 раз; по ПТХ — 42-53 раза.

Следует отметить, что удельная активность ХЭ гемолимфы моллюсков (рис. 2) в меньшей степени связана с процессом гидролиза БТХ: от 0 % для модиолуса до 10 % для мидии. Большая часть удельной активности ХЭ гемолимфы мидии (65 %) и модиолуса (91 %) определяется процессом гидролиза АТХ. В то же время удельная активность ХЭ анадары в большей степени определяется гидролизом ПТХ (51 %), а не АТХ (40 %).

Как говорилось выше, двустворчатые моллюски широко используются в целях мониторинга загрязнения окружающей среды. Среди молекулярных биомаркеров двустворчатых моллюсков исследовано влияние концентрации тяжелых металлов на содержание адениновых нук-леотидов, каратиноидов, глутатиона и активность ферментов углеводного обмена у некоторых представителей двустворчатых моллюсков и иглокожих (Лукьянова, 2001).

Нами проведено сравнение свойств холинэстераз гемолимфы мидии Грея, выловленной в различающихся по степени загрязнения акваториях: в качестве контроля выбраны моллюски, собранные в условно чистом районе — о. Рейне-ке; в районе, подверженном хроническому антропогенному воздействию (бухта Десантная — зона городской свалки промышленных и бытовых отходов г. Владивосток); в районе о. Большой Пелис (бухта Восточная), акватория которого подвержена периодическому действию высоких концентраций тяжелых металлов (сезонный апвеллинг); и районе мыса Консервного (о. Итуруп) характеризующимся высокими фоновыми значениями концентраций тяжелых металлов вследствие постоянного апвеллинга (Kavun et al., 2002).

Проведенные исследования по определению концентраций тяжелых металлов в гемолимфе мидий из разных районов обитания (табл. 2) показывают, что моллюски проявляют определенную специфичность в аккумуляции металлов. Так, в гемолимфе мидии из акватории о. Большой Пелис определено большее

Рис. 2. Соотношение значений величин удельной активности холинэстераз гемолимфы двустворчатых моллюсков

Fig. 2. Ratio of hemolymph cholinesterase activity in shellfish

содержание цинка и марганца, у мидий из района мыса Консервного — кадмия и свинца, а у мидии из бухты Десантной — меди и железа.

Таблица 2

Концентрация тяжелых металлов в гемолимфе мидии Грея различных районов обитания, мкг/мл (n = 5)

Table 2

Trace metal concentration in hemolymph of Crenomytilus grayanus from different area of inhabitate, mkg/ml (n = 5)

Место сбора Cd Zn Cu Mn Fe Ni Pb

О. Большой Пелис 0,24 ±0,02 1,40 ±0,006 0,14 ±0,002 0,09 ±0,003 0,55 ±0,03 0,38 ±0,002 0,58 ±0,004

Мыс Консервный 0,35 0,60 0,17 0,045 0,31 0,33 0,75

±0,03 ±0,004 ±0,002 ±0,0003 ±0,002 ±0,004 0,005±

Бухта Десантная 0,09 ±0,0004 0,041 ±0,0001 0,35 ±0,001 0,07 ±0,0001 0,76 0,005± 0,21 ±0,001 0,52 0,003 ±

Примечание: P < 0,05.

Наибольшая активность фермента, по всем трем субстратам, обнаружена в гемолимфе мидии с о. Рейнеке. Для этой ХЭ характерны и наибольшие значения величин максимальных скоростей гидролиза.

Таблица 3

Кинетические характеристики гидролиза субстратов под действием холинэстеразы гемолимфы мидии Грея, выловленной в различных районах

Table 3

Kinetic characteristics of substrate hydrolisis by C. grayanus cholinesterase from different area of inhabitate

Параметры .

Субстрат pS V , Vотн, K 10"5, V /K Активность>

M/m % mM m m мкМ/мин/мл

мМ/мин % M

О. Большой Пелис (бухта Восточная)

АТХ - 0,10±0,004 100 0,9±0,04 11,1 0,53 ±0,03

ПТХ - 0,04±0,001 40 3,8±0,02 1,1 0,16±0,006

БТХ - 0,03±0,0001 30 9,3±0,3 0,3 0,13 ±0,002

О. Рейнеке

АТХ 2,6 0,26±0,003 100 0,72±0,02 17,1 1,97 ±0,05

ПТХ 3,2 0,08 ±0,004 31 2,04±0,1 3,9 0,48±0,02

БТХ 3,3 0,04±0,002 15 0,37±0,01 10,8 0,21 ±0,001

Бухта Десантная

АТХ 2,3 0,05±0,002 100 2,25± 0,1 2,2 0,26 ±0,001

ПТХ 2,6 0,01 ±0,0001 20 11,9±0,5 0,1 0,06 ±0,002

БТХ Активности нет при [S] = 0,02 — 0,000002 M

Мыс Консервный (о. Итуруп)

АТХ 3,3 0,21 ±0,004 100 1,8 ± 0,05 11,7 1,04 ±0,05

ПТХ 4,2 0,06 ±0,0,005 30 0,4 ±0,002 15,0 0,28 ±0,01

БТХ 3,6 0,01 ±0,0002 5 2,2 ± 0,1 0,46 0,05±0,002

Примечание: P < 0,05.

Для мидий, обитающих в акваториях, периодически подверженных воздействию металлов (о. Большой Пелис), характерно 4-кратное снижение величины удельной активности фермента (по АТХ). При этом происходит снижение как величины максимальной скорости гидролиза субстратов, так и значений величины "сродства" субстратов к ферменту. Однако следует отметить, что воздействие неблагоприятных факторов внешней среды приводит к увеличению значений величины Km. Особенно выражено увеличение Km для гидролиза БТХ и ПТХ.

Хроническое антропогенное воздействие (бухта Десантная) приводит к изменению субстратной специфичности ХЭ в гемолимфе исследованных моллюсков. ХЭ гемолимфы мидии из этой акватории не катализирует гидролиз БТХ. При этом происходит практически 8-кратное снижение активности фермента по сравнению с ХЭ гемолимфы мидии из "контрольного" района, а также снижение значений V и V /К .

т т' т

Компенсаторной реакцией ХЭ гемолимфы моллюсков из этого района является значительное увеличение Кт. По-видимому, именно изменение эффективных концентраций субстрата, необходимых для проявления физиологической функции ХЭ, является стратегией адаптации фермента к хроническому воздействию тяжелых металлов.

В качестве модели механизма возможной адаптации ХЭ гемолимфы моллюсков к повышенному (природному) фону тяжелых металлов можно использовать сравнение свойств фермента мидии из акваторий о. Рейнеке — о. Большой Пелис — о. Итуруп. Как уже говорилось выше, обитание моллюсков в условиях периодического апвеллинга тяжелых металлов приводит к увеличению величины Кт, но снижению удельной активности, величины V и V /К

7 7 т т т

(сравнение о. Рейнеке — о. Большой Пелис). Результатом же адаптации моллюсков к повышенному природному фону концентраций тяжелых металлов (сравнение о. Большой Пелис — о. Итуруп) является не только повышение (в два раза) величины удельной активности фермента, но также величин Кт и значений "сродства" субстратов к ферменту.

Таким образом, изучение свойств ХЭ гемолимфы различных видов моллюсков позволяет выдвинуть предположение, что основным направлением биохимической адаптации холинэргической системы к условиям обитания является регуляция величины удельной активности фермента. Основными кинетическими параметрами, на которые влияют изменяющиеся факторы среды, являются оптимальная концентрация субстрата и значение величины Кт. Очевидно, особенности биологии двустворчатых моллюсков (неподвижный образ жизни, наличие активных хищников и т.д.) приводят к выработке стратегии, требующей быстроты выполнения поведенческих реакций. Скорость этого процесса зависит от квантового выброса медиатора (ацетилхолина) в концентрации, необходимой для осуществления физиологической функции.

Выполнение холинэргических функций в гемолимфе мидии Грея в большей степени определяется величиной оптимальной концентрации субстратов, их сродством к ферменту, значением величины Кт и, в меньшей степени, концентрацией фермента и значениями величин максимальной скорости их гидролиза. В целом эта стратегия адаптации характерна и для фермента моллюсков, обитающих в условиях временного апвеллинга, за исключением одного момента. Для осуществления физиологических функций у моллюсков, обитающих в таких условиях (о. Большой Пелис), ХЭ приобретают способность катализировать гидролиз субстратов в широком пределе их концентраций, что выражается в отсутствии субстратного торможения.

Адаптация ХЭ к хроническому антропогенному воздействию приводит к изменению субстратной специфичности ферментов. Стратегия адаптации к таким условиям обитания остается в целом такой же, как и для всех двустворчатых моллюсков.

Способность ферментов адаптироваться к повышенному природному фону концентраций тяжелых металлов осуществляется благодаря изменению величин Кт и сродства субстратов к ферментам.

Таким образом, ХЭ гемолимфы двустворчатых моллюсков показывают несколько направлений стратегии биохимической адаптации к различным условиям обитания.

Концентрации металлов в гемолимфе моллюсков определены в лаборатории геохимии ТИГ ДВО РАН, за что выражаю глубокую признательность В.Я.Кавуну, А.Н.Плотниковой и Т.А.Примак.

Литература

Бресткин А.П., Фруентова Т.А. Влияние солей на холинэстеразный гидролиз ацетилхолина при различных рН // Биохимия. — 1968. — Т. 33, № 4. — С. 817-822.

Григорьева Г.М., Розенгарт Е.В., Розенгарт В.И. Характеристика специфичности холинэстераз сердечной мышцы и гемолимфы моллюсков // Журн. эволюц. биохим. и физиол. — 1967. — Т. 23. — С. 67-71.

Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. — М.: Мир, 1979. — 280 с.

Лукьянова О.Н. Некоторые биохимические параметры у морских беспозвоночных из района антропогенного загрязнения // Экология. — 1994. — № 6. — С. 43-48.

Лукьянова О.Н. Молекулярные биомаркеры. — Владивосток: ДВГАУ, 2001. — 191 с.

Розенгарт Е.В. Субстратно-ингибиторный анализ холинэстеразы гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска Neptunea eulimata // Журнал эволюц. биохим. и физиол. — 2001. — Т. 37, № 5. — С. 401-405.

Турпаев Т.М., Абашкина Л.И., Бресткин А.П. и др. Холинэстераза зрительных ганглиев кальмара Ommastrephes sloani-pacificus // Физиология и биохимия беспозвоночных. — Л.: Наука, 1968. — С. 121-130.

Христофорова Н.К., Шулькин В.М., Кавун В.Я., Чернова Е.Н. Тяжелые металлы в промысловых и культивируемых моллюсках залива Петра Великого. — Владивосток: Дальнаука, 1994. — 296 с.

Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.Jr., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. — 1961. — Vol. 7, № 1. — P. 88-95.

Fishelson L., Yawets A., Perry A.S. et al. The environmental health profil (EHP) for the Acre Valley (Israel): xenobiotics in animals and physiological evedance of stress // Sci. Total Environ. — 1994. — Vol. 144. — P. 33-45.

Galloway T.S., Millward N., Browne M.A., Depledge M.H. Rapid assessment of organophosphorous/carbamate exposuere in the bivalve mollusk Mytilus edulis using combined esterase activities as biomarkers // Aquat. Toxicol. — 2002. — Vol. 61. — P. 169-180.

Kavun V.Ya., Shulkin V.M., Khristophorova N.K. Metal accumulation in mussels of the Kuril Islands, north-west Pacific Ocean // Marine Environmental Reseach. — 2002. — Vol. 53. — P. 219-226.

Payene J.F., Mathieu A., Melwin W., Fancey L.L. Acetylcholinesterase, an Old Biomarker with a New Future? Field Trials in Accociation with Two Urban River and a Paper Mill in Newfoundland // Marine Pollution Bulletin. — 1996. — Vol. 32, № 2. — P. 225-231.

Поступила в редакцию 21.03.03 г.