CC BY
35
2001
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра
Том 129
Н.Н.Ковалев, А.И.Чепкасова
ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ НЕРВНОЙ ТКАНИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РЫБ
В связи с ключевой ролью холинэстераз (ХЭ) нервной ткани в передаче нервного импульса изучение свойств и модуляция ее активности под действием различных соединений издавна являются предметом исследования биохимиков, фармакологов, токсикологов.
ХЭ относятся к группе сериновых гидролаз, с наибольшей скоростью гидролизующих карбоновые эфиры холина. Согласно "Номенклатуре ферментов" различают два типа ХЭ: ацетилгидролаза ацетилхолина (НФ 3.1.1.7, АХЭ) и ацилгидролаза ацилхолинов (НФ 3.1.1.8), представленная рядом ферментов, в том числе и бутирилхолинэстеразой (БуХЭ). Характерной АХЭ считается фермент нервной ткани и эритроцитов млекопитающих, скорость гидролиза субстратов под действием которого снижается в ряду АХ>ПХ>>БХ (соответственно ацетилхолин, пропи-онилхолин, бутирилхолин). Другим характерным признаком этого фермента является субстратное торможение. Типичной БуХЭ считается фермент сыворотки крови, под действием которого скорость гидролиза снижается в ряду БХ>ПХ>АХ и отсутствует субстратное торможение.
Сведения о холинэстеразной (ХЭ) активности нервной ткани морских гидробионтов касаются в основном представителей класса головоногих моллюсков. Информация по субстратной специфичности и активности ХЭ кальмаров обобщена в нескольких публикациях (Эпштейн и др., 1987; Бресткин и др., 1997). Всего исследовано 12 видов кальмаров из трех семейств (Ommastrephidae, Gonatidae, Onychoteuthidae). Скорость гидролиза субстратов под действием ХЭ ганглиев кальмаров сем. Ommastrephidae и Gonatidae снижалась в ряду АХ>ПХ>БХ, а для ХЭ кальмаров сем. Onychoteuthidae - в ряду ПХ>БХ>АХ. Показано, что наибольшей ХЭ-активностью характеризуются ганглии кальмаров семейства Ommastrephidae, наименьшей - Gonatidae. Наблюдались также значительные различия в величинах констант, характеризующих процесс каталитического гидролиза субстратов (оптимальная концентрация субстратов, константа Михаэлиса, максимальная скорость гидролиза). Исследователями подтвержден тезис о видовой специфичности ХЭ. В ряде публикаций (Шевцова и др., 1977, 1979, 1982; Ковалев, 1990) на основании изучения субстратно-ингибиторных свойств ХЭ кальмаров предложено использовать характеристики фермента в целях уточнения таксономии различных видов головоногих моллюсков. На основании значительных различий в субстратной специфичности ХЭ, выделенных из разных источников, сделан вывод о необходимости определения вида головоногих
моллюсков при заготовке ганглиев как источника фермента.
82
В доступной нам литературе о свойствах ХЭ рыб имеются сведения только о ферменте в электрическом органе угря Electrophorus electricus (Augustinson, 1949), ската Torpedo marmorata (Бресткин и др., 1975) и головном мозге миноги Lamperta fluviatilis (Cousin et al., 1996). ХЭ угря, отнесенная к типу ацетилхолинэстераз (АХЭ), с наибольшей скоростью катализирует гидролиз АХ и не гидролизует БХ: VAX: Vnx: УБХ = = 100: 95: 0. ХЭ ската характеризуется несколько иным соотношением скоростей гидролиза субстратов: VM: Vra = 100: 21.
Целью настоящей работы было исследование свойств ХЭ нервной ткани морских рыб, поиск новых источников сырья для получения фермента с последующим возможным его использованием как биохимического реактива, в том числе при оценке загрязнения окружающей среды.
Источником фермента служили центрифугаты (800 g) водных го-могенатов (10 мг/мл) мозга следующих видов рыб: осетр, терпуг бурый, сельдь тихоокеанская, минтай, горбуша, кета, камбала длиннорылая. Скорость гидролиза тиосубстратов - ацетилтиохолина (АТХ), пропионилти-охолина (ПТХ) и бутирилтиохолина (БТХ) - определяли спектрофото-метрически (Ellman et al., 1961) при X = 412 нм. Кинетические параметры взаимодействия ХЭ с субстратами (Vm и Km) определяли методом Лайнувера-Берка (Диксон, Уэбб, 1982).
Из 7 исследованных нами видов рыб наибольшей ХЭ-активностью по АТХ, ПТХ и БТХ характеризуется мозговая ткань осетра и горбуши (см. таблицу). Следует отметить, что изученные ферменты по активности значительно уступают ранее исследованным ХЭ ганглиев кальмаров (Бресткин и др., 1997).
Обычно при сравнении субстратной специфичности ХЭ используют два показателя: скорости гидролиза различных субстратов и количественное сравнение величин отношения Vm/Km, в определенной мере отражающее сродство субстрата к ферменту.
Изученные ХЭ рыб значительно различались по соотношению скоростей гидролиза тиосубстратов. У большинства исследованных объектов скорость гидролиза тиосубстратов под действием ХЭ мозга изменялась в ряду V^^V^^V^. По субстратной специфичности среди ферментов изученных рыб четко выделяются ХЭ лососевых. Так, ХЭ горбуши характеризуется соотношением скоростей гидролиза субстратов V^: : Vnra: V^ = 100: 114: 72, а ХЭ кеты - VA^: Vnra: V^ = 100: 133: 122. По указанному признаку данные ХЭ могут быть отнесены к неспецифическим ХЭ. В то же время ХЭ осетра ^АТХ: V^: V^ = 100: 11: 4) и камбалы ^АТХ: V^: V^ = 100: 50: 8) по соотношению максимальных скоростей гидролиза тиосубстратов ближе к классической АХЭ, которая не гидролизует БТХ. Схожей зависимостью скорости гидролиза от структуры субстрата характеризуются ферменты мозга сельди и терпуга: скорость гидролиза ПТХ и БТХ составляла соответственно 24-26 и 45 % от таковой АТХ.
Обнаружены межвидовые различия в сродстве субстратов к исследованным ферментам (по величине отношения Vm/Km). Так, наибольшим сродством ко всем трем изученным субстратам характеризуются ХЭ мозга осетра. Среди других изученных рыб ХЭ мозга горбуши имеет наибольшее сродство к АТХ, что ниже, чем эта же величина у осетра, в 9 раз. Остальные виды рыб имеют приблизительно равные значения Vm/ Km по АТХ (0,5-0,9 мин-1), которые в 28-51 раз ниже, чем эти значения
у ХЭ осетра. ХЭ мозга кеты характеризуются наибольшим сродством к ПТХ, а ХЭ мозга терпуга - к БТХ.
Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ мозга различных видов рыб Kinetic data of substrate hydrolise by Cholinesterase from different fish species
□ С V , K , Вид pS .. m , m г опт мМмин 1 мМ V /К , mm мин-1 Удельная актив. на 1 мг ткани
Осетр Acipenser medirostris
АТХ 2,88 8,75 3,4510-4 25,4 1,54
ПТХ 2,57 0,98 1,6710-5 58,7 0,46
БТХ 6,27 0,34 5,5610-3 61,2 0,22
Терпуг бурый Hexagrammos octogrammus
АТХ 2,57 0,49 5,5610-4 0,9 0,15
ПТХ 1,30 0,22 4,7810-4 0,5 0,05
БТХ 2,28 0,22 0,3210-4 6,9 0,03
Сельдь тихоокеанская Clupea pallasi
АТХ 2,78 0,098 1,4910-4 0,7 0,16
ПТХ 1,3 0,023 1,0510-3 0,02 0,07
БТХ 3,18 0,025 2,6310-4 0,095 0,05
Минтай Theragra chalcogramma
АТХ 2,57 0,089 1,4710-4 0,6 0,13
ПТХ 3,40 0,015 1,0510-4 0,1 0,11
БТХ 2,40 0,08 3,310-4 0,2 0,12
Камбала длиннорылая Limanda punctatissima punctatissima
АТХ 2,57 0,26 3,9610-4 0,7 0,07
ПТХ 2,57 0,13 2,6310-4 0,5 0,03
БТХ 3,18 0,02 4,5510-4 0,04 0,004
Горбуша Oncorhynchus gorbuscha
АТХ 2,57 0,29 1,0310-4 2,8 0,25
ПТХ 2,18 0,33 5,85-4 0,6 0,27
БТХ 1,88 0,21 2,0410-5 1,0 0,20
Кета Oncorhynchus keta
АТХ 3,48 0,09 1,7910-4 0,5 0,08
ПТХ 3,81 0,12 0,5310-4 2,3 0,10
БТХ 3,64 0,11 1,8710-4 0,6 0,09
Константа Михаэлиса количественно характеризует концентрацию субстрата, при которой скорость его гидролиза равна половине максимальной. Для всех ХЭ исследованных видов рыб изменение структуры субстрата значительно сказывалось на величине Km. Из данных таблицы видно, что максимальные межвидовые различия в величинах Km составляют: по АТХ - 5,4 раза у терпуга и горбуши, по ПТХ - на два порядка у осетра и сельди, а по БТХ - на два порядка у горбуши и осетра.
Значительно различались изученные ХЭ и по величине pS . Так,
Г J Г опт '
близкородственные виды (на примере лососевых) показывают два типа зависимости величины pS от структуры субстрата: для ХЭ горбуши увеличение длины ацильной части молекулы субстрата сопровождается уменьшением значений величин pS , в то время как эта величина для ХЭ кеты практически не зависела от природы субстрата.
Интересно отметить, что для большинства исследованных рыб величина pS по БТХ больше либо равна таковой по АТХ, что нехарактерно для ХЭ наземных животных.
Исследование ХЭ эволюционно древнего вида хрящевых рыб (осетра) позволило показать, что с наибольшей скоростью под действием этой ХЭ протекает гидролиз АТХ, а наибольшим значением pS и V /К
r r ' г опт m m
характеризуется процесс гидролиза БТХ. Подобное соотношение присуще и для ХЭ терпуга при равенстве величин pS по АТХ и БТХ. Иную закономерность проявляет ХЭ сельди и камбалы: наибольшим сродством к субстрату и величиной Vm характеризуется процесс гидролиза АТХ, а наибольшее значение pS отмечается для БТХ.
опт
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что ХЭ изученных видов рыб значительно различаются по субстратной специфичности и удельной активности между собой и от изученных ранее ХЭ разных видов головоногих моллюсков, нервная ткань которых используется для производства фермента ПХЭ. Полученные данные и выявленные различия в субстратной специфичности ХЭ рыб следует учитывать при поиске новых источников фермента.
Литература
Бресткин А.П., Григорьева Г.М., Еремеева A.M. и др. Ацетилхоли-нэстераза электрического органа Torpedo marmorata // Журн. эволюц. био-хим. и физиол. - 1975. - Т. 11. - С. 250-257.
Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н. и др. Холинэстера-зы наземных животных и гидробионтов. - Владивосток: ТИНРО-центр, 1997. -466 с.
Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. - Т. 1. - 389 с.
Ковалев Н.Н. Свойства холинэстеразы командорского кальмара Berryteuthis magister из разных частей видового ареала: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Л., 1990.
Шевцова С.П., Бресткин А.П., Несис К.Н., Розенгарт Е.В. Об идентичности каталитических свойств холинэстеразы оптических ганглиев кальмара из экваториальной и периферической популяций // Тез. докл. 2-й Всесо-юз. конф. по морской биологии. - Владивосток, 1982.
Шевцова С.П., Бресткин А.П., Несис К.Н., Розенгарт Е.В. Об идентичности свойств холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров Бартрама из южной Атлантики и Большого Австралийского залива // Океанол. - 1977. -Т. 17, вып. 6. - С. 1102-1105.
Шевцова С.П., Бресткин А.П., Несис К.Н., Розенгарт Е.В. Различия в свойствах холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров Ommastrephes bartrami (Les.) как показатель изолированности различных частей разорванного ареала // Океанол. - 1979. - Т. 19, вып. 8. - С. 481-486.
Эпштейн Л.М., Шевцов Г.А., Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В. Субстратная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров как показатель ценности сырья // Технология гидробионтов: Сб. науч. тр. - Владивосток: ТИНРО, 1987. - С. 37-46.
Augustinsson K.B. Substrate concentration and specifity of cholinesterase splitting enzymes // Arch. Biochem. - 1949. - № 23. - P. 111-126.
Cousin X., Bon S., Duval N. et al. Cloning and expression of acetylcholinesterase from Bungarus fasciatus venom. A new type of COOH-terminal domain; involvement of a positively charged residue in the peripheral site // Journ. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271. - P. 1599-15108.
Ellman G.H., Countney R.D., Anders V., Feather K.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. - 1961. - Vol. 7. - P. 88-95.
Поступила в редакцию 18.05.2001 г.
