CC BY
22
2005
Известия ТИНРО
Том 143
УДК 594.5-188
Е.В.Михеев, Н.Н.Ковалев
АДАПТИВНАЯ РОЛЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ НЕРВНОЙ ТКАНИ ТИХООКЕАНСКИХ ГОЛОВОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ
Проводились кинетические исследования каталитических свойств холинэс-тераз (ХЭ) зрительных ганглиев головоногих моллюсков различных семейств. Активность ХЭ определяли колориметрическим методом Эллмана с использованием ацетил-, пропионил- и бутирилтиохолина. В зрительных ганглиях всех исследованных видов обнаружено присутствие неспецифической ацетилхолинэстера-зы. Показано, что удельная активность фермента и кинетические параметры ферментативного гидролиза являются видоспецифическими признаками. Полученные данные позволяют предположить, что ХЭ играет адаптивную роль в ходе эволюции головоногих моллюсков, способствуя формированию функциональной организации видов, адекватной меняющимся условиям среды.
Mikheev E.V., Kovalev N.N. Adaptive role of pacific Cephalopods Cholinesterase // Izv. TINRO. — 2005. — Vol. 143. — P. 338-342.
Catalytic properties of Cholinesterase from visual ganglia have been investigated in different families of Cephalopoda. In all species a non specific acetylcholinesterase were found. Interspecific differences were found for kinetic parameters of hydrolysis. Functional significance of these differences is discussed.
Эволюционный прогресс в становлении более активных жизненных форм у головоногих моллюсков, несомненно, должен сопровождаться изменением скорости синаптической передачи нервного импульса, т.е. совершенствованием их медиа-торных систем (известно, что тесное взаимодействие между организмом и средой обитания осуществляется через нервную систему (Орбели, 1979)). Зрительные ганглии являются наиболее массивными образованиями нервной системы головоногих моллюсков. При этом они не только обеспечивают зрительную функцию, но и являются высшим интегральным центром поведенческих реакций и локомоции (Bullock, Horridge, 1965). Система передачи нервного импульса в зрительных ганглиях является практически чисто холинэргической. По сравнению с мозгом других животных в них установлено большее содержание ацетилхолина (Уиттакер, 1977) и высокая активность холинэстеразы (ХЭ) (Бресткин и др., 1997). Это указывает на важность холинэргической системы в целом и ХЭ как отдельного её звена, от которого зависит скорость передачи нервного импульса.
Интерес представляло исследование каталитических свойств ХЭ у представителей различных семейств, составляющих основные этапы развития головоногих моллюсков. Задачей исследования было определение типов субстратной специфичности ХЭ головоногих и её изменчивости в процессе эволюции.
Нами проведено исследование свойств ХЭ оптических ганглиев головоногих моллюсков, принадлежащих к различным семействам: осьминог Octopus dof-leini (сем. Octopodidae); кальмары сем. Ommastrephidae — Ommastrephes bartrami (род Ommastrephes) и Todarodes pacificus (род Todarodes); кальмар-светлячок
Watasenia scintillans сем. Enoploteuthidae и командорский кальмар Berryteuthis magister сем. Gonatidae.
Источником фермента служили центрифугаты (800) водных гомогенатов (10 мг/мл) зрительных ганглиев головоногих моллюсков. В качестве субстратов были использованы ацетилтиохолин (АТХ), пропионилтиохолин (ПТХ) и бутирилтиохолин (БТХ). Диапазон использованных концентраций субстратов составлял от 2 • 10-5 до 2 • 10-2 М. Определение активности ХЭ проводили колориметрическим методом Эллмана (рН 7,4, 25 °С, 0,04 М фосфатный буфер) (Ellman et al., 1961). Определение и расчет кинетических параметров ферментативного гидролиза субстратов осуществляли согласно известной методике (Бре-сткин и др., 1997). Величины максимальной скорости ферментативного гидролиза (Vm) и константы Михаэлиса (KM) были рассчитаны с использованием программы Excel. Трехмерные зависимости распределения констант рассчитывали с применением программы Statistica 6.0.
Как видно из представленных в таблице данных, наибольшей активностью ХЭ характеризуется нервная ткань кальмаров сем. Ommastrephidae (O. bartrami и T. pacificus). При этом ХЭ тихоокеанского кальмара (T. pacificus) характеризуется менее выраженной субстратной специфичностью (рис. 1). Для этой ХЭ соотношение скоростей гидролиза имеет следующий вид — Va^ : V^^ : V™ = = 100 : 103 : 96, в то время как для ХЭ кальмара Бартрама (O. bartrami) — V^^ : V^^ : V^ = 100 : 53 : 42. Значительно различались изученные ХЭ и по величинам значений Vm: преимущество фермента тихоокеанского кальмара для процесса гидролиза АТХ составило 4,1 раза, для ПТХ — 7,9 раза, а для БТХ — 9,3 раза. Различий в значениях величины КМ при этом не отмечалось. Выявленные различия в величинах значений максимальных скоростей гидролиза субстратов отражаются и на величине Vm/KM — "сродства" субстратов к ферментам (бимолекулярная константа образования фермент-субстратного комплекса). ХЭ тихоокеанского кальмара характеризуется в 5-13 раз большим сродством к изученным субстратам.
Наименьшее значение величины удельной активности свойственно оптическим ганглиям осьминога. Однако именно ХЭ осьминога характеризуется наибольшим значением максимальной скорости гидролиза АТХ и ПТХ. На фоне низких значений величины рКМ (lgKM) этот фермент обладает наибольшим сродством к изученным субстратам.
Промежуточное положение по величине значений удельной активности ферментов занимают ХЭ командорского кальмара (B. magister) и кальмара-светлячка (W. scintillans). Эти две ХЭ различались по субстратной специфичности: для ХЭ W. scintillans скорость гидролиза субстратов уменьшалась по мере изменения структуры субстрата (V^ : V^ : V^ = 100 : 78 : 28), в то время как ХЭ B. magister катализировала гидролиз ПТХ и БТХ практически с одинаковой скоростью (V^ : V^ : V^ = 100 : 54 : 49). ХЭ оптических ганглиев командорского кальмара также характеризуется наименьшими значениями величины сродства к изученным субстратам.
Обнаруженные различия в параметрах ферментативного катализа у головоногих моллюсков разных таксономических групп согласуются с различиями биологии изученных видов — распределением общей биомассы и численности, способами размножения, онтогенетическими перемещениями и суточными миграциями (Несис, 1977).
Формирование жизненных форм головоногих моллюсков, начиная с ведущих преимущественно донный образ жизни (осьминог) видов или видов, совершающих незначительные вертикальные суточные миграции (командорский кальмар, кальмар-светлячок), к видам, для которых характерны значительные миграции (кальмары сем. Ommastrephidae) и различная стратегия пищевого поведения,
на биохимическом уровне отражается прежде всего на величине удельной активности ХЭ нервной ткани (рис. 1). Стратегия пищевого поведения кальмаров, как активных хищников, выражается в высокой скорости холинэргических реакций и высоком сродстве субстратов к ферменту. Для осьминогов, по-видимому, основной стратегией адаптации холинэргической системы к проявлению единовременных (и кратковременных) реакций пищевого поведения служат более выраженная субстратная специфичность (VATX : VnTX : УБТХ = 100 : 34 : 3) и высокая степень сродства субстратов к ферменту.
Кинетические параметры гидролиза тиосубстратов под действием холинэстераз различных видов головоногих моллюсков Kinetic parameters of thiosubstrates hydrolysis by cholinesterase of different species of Cephalopod
Параметры
Субстрат рS*, Vm, pKM, Vm/K„, Удельная активность,
M мМ/мин М мин 1 мкМ/мг ткани
Осьминог Octopus dofleini
АТХ 2,6 7,64 ± 0,2 4,46 ± 0,2 222,1 0,18 ± 0,006
ПТХ 2,9 2,57 ± 0,1 4,35 ± 0,2 57,9 0,21 ±0,01
БТХ 1,5 0,23 ± 0,01 4,49 ± 0,2 7,3 0,08 ± 0,002
Кальмары
Ommastrephes bartrami
АТХ 1,3 0,38 ± 0,01 3,37 ± 0,1 0,64 1,04 ± 0,03
ПТХ 1,5 0,20 ± 0,01 3,90 ± 0,1 1,5 0,79 ± 0,02
БТХ 1,7 0,16 ± 0,01 3,54 ± 0,1 1,0 0,55 ± 0,02
Todarodes pacificus
АТХ 2,3 1,54 ± 0,002 3,73 ± 0,1 8,2 0,76 ± 0,03
ПТХ 2,9 1,58 ± 0,003 3,83 ± 0,1 10,7 0,68 ± 0,03
БТХ 1,9 1,48 ± 0,002 3,55 ± 0,1 5,2 0,73 ± 0,03
Berryteuthis magister
АТХ 2,1 0,41 ± 0,02 2,90 ± 0,1 2,0 0,36 ± 0,01
ПТХ 2,1 0,22 ± 0,01 1,99 ± 0,05 2,0 0,15 ± 0,01
БТХ 2,5 0,20 ± 0,01 0,71 ± 0,03 3,0 0,15 ± 0,01
Watasenia scintillans
АТХ 2,6 0,32 ± 0,01 4,16 ± 0,2 4,3 0,40 ± 0,02
ПТХ 2,6 0,25 ± 0,01 4,51 ± 0,2 8,1 0,25 ± 0,01
БТХ 3,2 0,09 ± 0,003 4,51 ± 0,2 2,9 0,14 ± 0,004
Примечание. pS = —lg[S]. [S] — концентрация субстрата.
O.bartrami
о
T.paclficus
Рис. 1. Зависимость активности холинэстераз (мкМ/мин/мг) нервных ганглиев головоногих моллюсков от кинетических параметров гидролиза субстратов
Fig. 1. Dependence of Ceph-alopods nervous tissue cholinesterase activity from kinetic parameters of thiosubstrate hydrolysis
Подтверждением приведенных фактов могут служить приведенные на рис. 2 данные по соотношению величин удельной активности в оптических ганглиях головоногих моллюсков. Так, из представленных данных видно, что 74 % удельной активности ХЭ осьминога обусловлено гидролизом АТХ, в то время как в оптических ганглиях активных пловцов и хищников (кальмар Бартрама и тихоокеанский кальмар) удельная активность характеризуется равными значениями скорости гидролиза трех субстратов. Для кальмаров, не совершающих значительных пищевых и онтогенетических миграций, характерно гораздо более (от 50 %) высокое значение величины удельной активности для процесса гидролиза АТХ по сравнению с другими субстратами. Полученные данные согласуются с положением о функционировании холинэргического синапса. Согласно данной теории, при осуществлении передачи нервного импульса, связанного с проявлением быстроты физиологической реакции, избыток медиатора — ацетилхолина — в межсинаптическом пространстве инактивируется (в случае ингибирования аце-тилхолинэстеразы (АХЭ) избытком субстрата) присутствующей иной, чем АХЭ, формой фермента (бутирилхолинэстераза, БуХЭ) либо ферментом синаптичес-кой щели, отличным по субстратной специфичности от типичной АХЭ.
Рис. 2. Соотношение величин удельной активности для процесса гидролиза тиосубстратов под действием холинэсте-раз различных видов головоногих моллюсков
Fig. 2. Ratio of specific activity sizes of substrate hydrolysis by cho-linesterase from different species of Cephalopod
T.pacificus
БТХ
34%,
p»
АТХ
35%
ПТХ 31%
B.magister БТХ
9
ПТХ
23%
m
АТХ 54%
W.scintillans
БТХ
18%
/^^^АТХ pi«50% ПТХ\ 32%
Обнаруженные изменения величин кинетических параметров для ХЭ зрительных ганглиев в ряду исследованных видов хорошо коррелируют с общим уровнем их организации. Увеличение активности ХЭ и ее сродства к АТХ указывает на то, что ХЭ, как ключевое звено в передаче нервного импульса, играет адаптивную роль при переходе видов к более активному образу жизни. По-видимому, можно полагать, что высокий уровень активности фермента, с субстрат-
ной специфичностью характерной для ацетилхолинэстераз, в зрительных ганглиях был фактором, предшествующим появлению новых жизненных форм головоногих моллюсков.
Литература
Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Морален С.Н. и др. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. — Владивосток: ТИНРО, 1997. — 466 с.
Несис К.Н. Вертикальное распределение пелагических моллюсков // Журн. общ. биол. — 1977. — Т. 38, вып. 4. — С. 547-558.
Орбели Л.А. Основные задачи и методы эволюционной физиологии // Эволюционная физиология. Ч. 1. — Л.: Наука, 1979. — С. 12-23.
Уиттакер В.П. Биохимия холинэргического синапса: сравнительные аспекты // Сравнительная фармакология синаптических рецепторов. — Л.: Наука, 1977. — С. 15-26.
Bullock T.H., Horridge G.A. Mollusca: Cephalopoda. The functions of the ganglia and divisions of brain // Structure and function in the nervous system of vertebrates. — San Francisco, L., 1965. — Vol. 1. — P. 1497-1505.
Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.J., Featerstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. — 1961. — Vol. 7, № 1. — P. 88-95.
Поступила в редакцию 22.07.05 г.
