CC BY
85
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.12
РОЛЬ цАМФ, цГМФ, NO-СИНТАЗЫ, Катф-КАНАЛОВ И ПРОТЕИНКИНАЗЫ С В РЕАЛИЗАЦИИ КАРДИОПРОТЕКТОРНОГО ЭФФЕКТА АГОНИСТА КАННАБИНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ HU-210
Ю.Б. Лишманов, Л.Н. Маслов, О.В. Ласукова
ФГБУ "НИИ кардиологии" СО РАМН, Томск E-mail: lov_81@list.ru
ROLE OF CAMP, cGMP, NO-SYNTHASE, КАТр -CHANNELS AND PROTEINKINASE C IN DEVELOPMENT OF CARDIOPROTECTIVE EFFECT OF CANNABINOID RECEPTOR AGONIST HU-210
Yu.B. Lishmanov, L.N. Maslov, O.V. Lasukova
Federal State Budgetary Institution "Research Institute for Cardiology" of Siberian Branch under the Russian Academy
of Medical Sciences, Tomsk
Установлено, что активация СВ1- и СВ2-рецепторов с помощью селективного агониста HU-210 в конечной концентрации 0,1-10-3 и 1,0-10-3 мМ способствует повышению устойчивости миокарда к действию тотальной ишемии и реперфузии. Внутриклеточный механизм кардиопротекторного эффекта селективного агониста HU-210 реализуется за счет активации КАТФ-каналов и ПКС, не будучи связанным с изменением активности NO-синтазы и уровня циклических нуклеотидов.
Ключевые слова: каннабиноидные рецепторы, ишемия, реперфузия, изолированное сердце.
The study showed that activation of CB1 and CB2 receptors with selective agonist HU-210 at a final concentration of 0.1-10-3 and 1.0-10-3 mM improved myocardial tolerance to total ischemia and reperfusion. Data suggested that intracellular mechanism of cardioprotective effect of selective agonist HU-210 was mediated through activation of KATp-channels and PKC and was not associated with changes in the activity of NO-synthase and the levels of cyclic nucleotides.
Key words: cannabinoid receptors, ischemia, reperfusion, isolated heart.
Введение
Ишемические и реперфузионные повреждения являются главной проблемой современной кардиологии, от успешного решения которой зависит жизнь тысяч, если не миллионов людей. Острота этой проблемы определяется тем, что необратимые повреждения кардиомиоци-тов возникают уже после 10-минутной ишемии [13], а тромболизис или ангиопластику пациентам с острым инфарктом миокарда обычно начинают проводить через несколько часов после возникновения ангинозного приступа [8]. В этой ситуации неоценимую пользу могли бы оказать фармакологические агенты, которые имитируют феномен ишемического прекондиционирования (ИП). Суть названного феномена заключается в повышении устойчивости сердца к патогенному действию длительной ишемии после нескольких предварительных сеансов
кратковременной коронароокклюзии и реперфузии [16]. Установлено, что феномен ИП способны имитировать экзогенные каннабиноиды [1, 2]. Оставались неизвестными внутриклеточные механизмы кардиопротекторного действия каннабиноидов. Мы предположили, что в этом механизме может участвовать цАМФ. Основанием для подобной гипотезы послужили данные о том, что канна-биноидные (СВ) рецепторы сопряжены через Ц-белки с аденилатциклазой [5], а их активация приводит к угнетению активности аденилатциклазы и снижению продукции цАМФ [5]. С другой стороны, защитные эффекты каннабиноидов могли быть опосредованы Ш-синтазой, которая, согласно некоторым сведениям, может быть задействована в механизме каннабиноид-индуцированного повышения толерантности сердца к ишемическим и репер-фузионным повреждениям [7]. В работе Р. Lepicier и со-авт. [6] установлена ключевая роль протеинкиназы С
(ПКС) в защитном эффекте каннабиноида пальмитоилэ-таноламида на модели коронароокклюзии и реперфузии изолированного сердца крысы [6]. Одними из возможных эффекторов в сигнальном каскаде миокардиальных эффектов каннабиноидов могли являться АТФ-чувстви-тельные К+-каналы (КАТф-каналы). Данное предположение базируется на публикациях о том, что активация КАТф-ка-налов обеспечивает повышение толерантности кардио-миоцитов к патогенному действию ишемии-реперфузии [12]. Эти данные послужили нам основой для выдвижения гипотезы об участии названных ионных каналов в защитном эффекте каннабиноидов.
Цель: исследовать роль цАМФ, NO-синтазы, протеин-киназы С, КАТф-каналов в реализации цитопротекторного эффекта агониста каннабиноидных рецепторов HU-210.
Материал и методы
Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г по следующей схеме: 20 мин адаптации + 10 мин перфузии фармакологическим агентом + 10 мин перфузии без фармакологического агента (“отмывка от препарата”) + 45 мин тотальной ишемии + 30 мин реперфузии. Параметры сократимости регистрировали путем введения в полость левого желудочка латексного баллончика, сопряженного с датчиком давления прибора SS13L (Biopac System Inc., Goleta, Калифорния, США), встроенного в аппарат для физиологических исследований МР36 компании “Biopac Systems Inc” (Goleta, Калифорния, США). В ходе экспериментов проводили запись кривой внутрижелудочкового давления. Раствор Кребса-Хензелайта и все реактивы готовились на дистиллированной воде, которая подвергалась дополнительной очистке на установке “Simplicity” компании Millipore (Millipore, США). Используемые в эксперименте препараты растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) и после стабилизационного периода добавляли в перфузионный раствор. В работе были использованы: селективный агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 (6aR)-trans-3-(1,1-Dimethylheptyl)-6a,7,10,10a-tetrahydro-1-hydroxy-6,6-dimethyl-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol), который добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации
0,1*10-3 и 1,0*10-3 мМ [2]. Для изучения роли сигнальных систем были использованы следующие фармакологические агенты: бло-катор протеинкиназы С хелеритрин добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 2*10-3 мМ [4]; блокатор сар-колеммальных и митохондриальных КАТф-каналов глибенкла-мид добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 1,0*10-3 мМ [10]; ингибитор NO-синтазы L-nAmE (NG-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) добавляли в пер-фузионный раствор в конечной
концентрации 100х10-3 мМ [3]. По окончании этих экспериментов сердца также подвергали быстрой заморозке для исследования в них уровня циклонуклеотидов. Для определения содержания цАМФ проводили экстракцию последних из ткани сердца этиловым спиртом [9]. В полученных образцах оценивали уровень цАМФ и цГМФ с помощью стандартных коммерческих радиоиммунных наборов “RIA AMPc/cAMP” и “RiA AMPc/cGMP” (компания “Immunotech”, Марсель, Франция). Измерение радиоактивности в пробах производили на отечественном гамма-счетчике “Гамма-12”. В конце эксперимента в перфу-зате, собранном за 30 мин реперфузии, определялся уровень креатинфосфокиназы (КФК) с помощью стандартных наборов Ck NAC, Германия. Активность КФК определяли на спектрофотометре Smart Spec Plus (Bio-Rad, США). Конечный результат выражали в мкмоль НАДН/мин в пересчете на 1 г ткани сердца за 30 мин реперфузии (мкМ/ г*мин). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы STATISTICA 6.0 (StatSoft). Для проверки нормальности распределения числовых показателей использовался критерий Колмогорова-Смирнова; для оценки статистической значимости различий между группами применялся непараметрический критерий Манна-Уитни для количественных признаков. Статистически значимыми считались различия при p<0,05. Результаты всех экспериментов приведены на рисунках 1-5, где указан разброс значений относительно средних величин.
Результаты и обсуждение
После тотальной ишемии изолированного сердца с последующим возобновлением коронарной циркуляции отмечалось развитие некроза кардиомиоцитов. Об этом свидетельствовало повышение активности КФК в 4,5 раза в растворе, собранном за период 30-минутной реперфузии, по сравнению с исходными значениями (рис. 1). В ходе экспериментов с использованием HU-210 в конечной концентрации 0,1х10-3 мМ было показано, что данный препарат не влиял на исходное содержание креа-
>,®М/г к мин
контроль ни-2 ю (0,1 HLT-210 ^ контроль ни-210 (0,1 HU-210
* 10'3 мМ/л) (1,0 * 10'3 мМ/л) х 10'3 мМ/л) (1,0 * 10'3 мМ/л)
Исходные значения до ишемии Во время реперфузии
Рис. 1. Влияние агониста каннабиноидных рецепторов Ни-210 в концентрации 0,1*10-3 и 1,0*10-3 мМ на активность креатинфосфокиназы в перфузионном растворе до ишемии и во время реперфузии. * - р<0,05 по сравнению с контролем; # - р<0,05; ## - р<0,01 по сравнению с исходными значениями
тинкиназы в доишемическом периоде. Однако названный каннабиноид способствовал снижению степени повреждения кардиомиоцитов в условиях глобальной ишемии и последующей реперфузии. Так, после предварительной перфузии изолированного сердца НИ-210 в указанной концентрации повышение активности КФК в реперфу-зионном периоде оказалось на 47% ниже, чем в контроле.
Увеличение концентрации НИ-210 до 1,0*10-3 мМ не приводило к усилению кардиопротекторного эффекта, поэтому в дальнейших экспериментах мы использовали Ни-210 в концентрации 0,1*10-3 мМ.
Таким образом, активация каннабиноидных рецепторов препятствует некрозу кардиомиоцитов во время тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца.
Следующим этапом стало выяснение роли цАМФ в кардиопротекторном эффекте исследуемого каннабино-ида. Для этого мы провели измерение уровня цАМФ в ткани миокарда на 15-й мин ишемии, а также на 5-й и 30-й мин реперфузии (рис. 2). В контрольной группе нами было обнаружено некоторое увеличение уровня цАМФ на 15-й и 45-й мин тотальной ишемии изолированного сердца по сравнению с исходным уровнем до ишемии. Однако эти изменения были недостоверны. К 30-й мин реперфузии содержание цАМФ практически не отлича-
лось от исходного уровня до ишемии. В опытной серии с применением СВ-агониста, вопреки ожиданиям, мы не обнаружили статистически значимых изменений уровня цАМФ относительно контроля в динамике всего эксперимента.
Таким образом, цитопротекторный эффект, наблюдаемый при активации кардиальных каннабиноидных рецепторов, не был связан с изменением внутриклеточного содержания цАМФ.
Мы предположили, что в реализации кардиопротек-торного эффекта НИ-210 могут участвовать другие сигнальные системы, такие как Ш-синтаза, цГМФ, проте-инкиназа С и КАТФ-каналы. В частности, известно, что кан-набиноиды могут активировать синтез оксида азота [15], который играет важную роль в повышении устойчивости миокарда к ишемическим воздействиям [3]. Возможно, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов является результатом усиления синтеза N0 и, как следствие, повышения уровня цГМФ в миокарде. С этой целью были проведены эксперименты, в которых определяли уровень цГМФ в ткани миокарда на 10-й мин перфузии изолированного сердца раствором, содержащим СВ-агонист НИ-210 (0,1*10-3 мМ). Кроме того, в тех же условиях мы определяли уровень цГМФ на 15-й мин ишемии, а также на 5-й и 30-й мин реперфузии. Нам не удалось обнаружить
статистически значимых изменений уровня цГМФ в миокарде в ответ на стимуляцию СВ-рецепто-ров. Следовательно, защитный эффект НИ-210 развивался независимо от цГМФ, т.е. без участия гуанилатциклазы. Оставалось установить роль других МО-зависимых механизмов в реализации кардиопротектор-ных эффектов агониста каннабиноидных рецепторов НИ-210. С этой целью были проведены эксперименты с использованием блокатора N0-синтазы L-NAME, который добавляли в перфу-зионный раствор в конечной концентрации 100*10-3 мМ непосредственно перед стимуляцией СВ-рецепторов.
Однако в случае предварительной блокады мО-синтазы с помощью L-NAME кардиопротек-торный эффект каннаби-ноида НИ-210 сохранялся (рис. 3). При этом сам L-NAME не оказывал достоверного влияния на
Рис. 2. Влияние активации каннабиноидных рецепторов с помощью селективного агониста НИ-210 (0,1*10-3 мМ) на уровень цАМФ в миокарде крыс
Рис. 3. Влияние блокатора N0-син тазы L-NAME (1,0*10-2 мМ) и агониста каннабиноидных рецепторов НИ-210 (0,1*10-3 мМ) на активность креатинфосфокиназы в перфузионном растворе до ишемии и во время реперфузии. * - р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем; ## -р<0,01 по сравнению с исходными значениями
Рис. 4. Влияние блокатора протеинкиназы С хелеритрина (2,0-10-3 мМ) и агониста каннаби-ноидных рецепторов Ни-210 (0,Ь10-3 мМ) на активность креатинфосфокиназы в перфузи-онном растворе до ишемии и во время реперфузии. * - р<0,05 по сравнению с контролем
мкМ/г х мин 25
т Г-Н ш т
1
А
И-и 1
1 "1
контроль НЧ-210 Глиб Глиб +
Ни-210
Исходные значения до ишемии
контроль ни-210 Глиб Глиб +
Ни-210
Во время реперфузии
Рис. 5. Влияние блокатора КАТф-каналов глибенкламида (1,0*10-3 мМ) и агониста каннабино-идных рецепторов Ни-210 (0,1*10-3 мМ) на активность креатинфосфокиназы в перфузион-ном растворе до ишемии и во время реперфузии. * - р<0,05 по сравнению с контролем; ## -р<0,01 по сравнению с исходными значениями. “Глиб” - глибенкламид
Существует ряд публикаций о том, что активация КАТф-каналов обеспечивает повышение толерантности карди-омиоцитов к патогенному действию ишемии-реперфузии [12]. Мы предположили, что в основе защитного эффекта каннабиноидов может лежать активация КАТф-кана-лов и провели эксперименты с использованием блокатора КАТф-каналов глибенкламида. Применение Ни-210 в концентрации 0,1*10-3 мМ сопровождалось снижением репер-фузионного выброса КФК по сравнению с контролем. Предварительное применение одного глибенкламида не оказывало статистически значимого влияния на уровень КФК в растворе, оттекающем от сердца в реперфузионный период (рис. 5). Стимуляция СВ-рецепторов с помощью агониста НИ-210 на фоне блокады КАТф-каналов глибенкла-мидом приводила к устранению кардиопротекторного эффекта СВ-агониста. Полученные результаты свидетельствуют о том, что КАТф-каналы участвуют в реализации ци-топротекторного эффекта СВ-агониста НИ-210.
уровень КФК. Следовательно, кардиопротекторный эффект НИ-210 не был связан с активацией Ш-синтазы.
Известно, что протеинкиназа С (ПКС) катализирует фосфорилирование ряда белков, обеспечивающих повышенную устойчивость сердца к ишемическим и репер-фузионным воздействиям [14]. Результаты проведенных нами экспериментов показали, что после блокады про-теинкиназы С хелеритрином кардиопротекторный эффект СВ-агониста Ни-210 не проявляется (рис. 4). Применение одного хелеритрина сопровождалось снижением реперфузионного выброса креатинкиназы по сравнению с контролем, но эти изменения носили недостоверный характер. Таким образом, протеинкиназа С участвует в формировании кардиопротекторного эффекта агониста каннабиноидных рецепторов Ни-210. Полученные результаты в полной мере согласуются с данными Р. Lepicier с соавт., которые исследовали кардиопротек-торные эффекты каннабиноидов [6].
Таким образом, ПКС играет ведущую роль в реализации кардиопротекторного эффекта СВ-агониста НИ-210. Механизм, с помощью которого протеинкиназа С опосредует свое цитопротекторное действие агониста СВ-рецепторов НИ-210, до настоящего времени не изучен.
Заключение
Результаты выполненных экспериментов свидетельствуют о важной роли каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости миокарда к ишемическим и репер-фузионным воздействиям. Установлено, что в развитии кардиопротекторного эффекта НИ-210 участвует ПКС, КАТф-каналы. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что циклонуклеотиды и Ю-синтаза не участвуют в механизме цитопротекторного действия канна-биноида НИ-210.
Работа подготовлена при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям государственный контракт № 02.740.11.0714, контракт № 11.519.11.2016, № 11.519.11.2028, РФФИ гранты: 10-04-00288,11-04-00467,11-04-98001,11-04-98000,
11-04-98004.
Литература
1. Крылатов А.В. Повышение устойчивости сердца к аритмо-генным воздействиям и уменьшение зоны ишемического некроза миокарда при активации каннабиноидных рецеп-
торов // Росс. физиол. жур. - 2002. - Т. 88, № 5. - С. 560— 567.
2. Ласукова О.В., Маслов Л.Н., Ермаков С.Ю. и др. Роль канна-биноидных рецепторов в регуляции толерантности сердца к действию ишемии и реперфузии // Известия РАН. -2008. - Т. 35, № 4. - С. 471-478.
3. Andelova E. The role of NO in ischemia/reperfusion injury in isolated rat heart // Gen. Physiol. Biophys. - 2005. -Vol. 24. No. 4. - P. 411-426.
4. Bugge E., Ytrehus K. Ischaemic preconditioning is protein kinase C dependent but not through stimulation of alpha adrenergic or adenosine receptors in the isolated rat heart // Cardiovasc. Res. - 1995. - Vol. 29, No. 3. - P. 401-406.
5. Howlett A.C. Cannabinoid receptor signaling // Handb. Exp. Pharmacol. - 2005. - Vol. 168. - P. 53-79.
6. Lepicier P. Endocannabinoids protect the rat isolated heart against ischaemia // Br. J. Pharmacol. - 2003. - Vol. 139, No. 4.
- P. 805-815.
7. Lepicier P., Bibeau-Poirier A., Lagneux C. Endothelial CB1 receptors confer cardiac protection through nitric oxide production // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2004. - Vol. 37. - P. 197198.
8. Mahaffey K.W., Puma J.A., Barbagelata N.A. et al. Adenosine as an adjunct to thrombolytic therapy for acute myocardial infarction: results of a multicenter, randomized, placebo-controlled trial: the acute myocardial infarction study of adenosine (AMISTAD) trial // J. Am. Coll. Cardiol. - 1999. -Vol. 34, No. 6. - P. 1711-1720.
9. Maslov L.N., Lishmanov Y.B. Changes in opioid peptide level in the heart and blood plasma during acute myocardial ischaemia complicated by ventricular fibrillation // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 1995. - Vol. 22. - P. 812-816.
10. McCullough J.R., Normandin D.E., Conder M.L. et al. Specific block of the anti-ischemic actions of cromakalim by sodium 5-hydroxydecanoate // Circ. Res. - 1991. - Vol. 69. - P. 949-958.
11. Murry C.E., Jennings R.B., Reimer K.A. et al. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium // Circulation. - 1986. - Vol. 74, No. 5. - P. 1124-1136.
12. Patel H.H., Gross E.R., Peart J.N. et al. Sarcolemmal KATP channel triggers delayed ischemic preconditioning in ratsAT P// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2005. - Vol. 288, No. 1. - P. H445-447.
13. Trost S.U., Omens J.H., Karlon W.J. et al. Protection against myocardial dysfunction after a brief ischemic period in transgenic mice expressing inducible heat shock protein 70 // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol. 101, No. 4. - P. 855-862.
14. Yellon D.M., Downey J.M. Preconditioning the myocardium: from cellular physiology to clinical cardiology // Physiol. Rev. - 2003.
- Vol. 83. - P. 1113-1151.
15. Yusifzade K., Akin M., Isikgonul I. et al. The protective role of anandamide in mesenteric ischemia reperfusion injury in guinea pig // Bratisl. Lek. Listy. -2009. - Vol. 110, No. 7. - Р. 379-384.
Поступила 16.05.2011
Сведения об авторах
Лишманов Юрий Борисович, д.м.н., профессор, чл.-корр. РАМН, заместитель директора по НИР ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.
E-mail: zamdir@cardio.tsu.ru.
Маслов Леонид Николаевич, д.м.н., профессор, руководитель лаборатории экспериментальной кардиологии ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634021, г. Томск, ул. Шевченко, 24.
E-mail: maslov@cardio.tsu.ru.
Ласукова Ольга Владимировна, к м.н., младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной кардиологии ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634021, г. Томск, ул. Шевченко, 24.
E-mail: lov 81@list.ru.
КАЛЕНДАРЬ НАУЧНО-ОРГАНИЗАЦИОННЫХ МЕРОПРИЯТИЙ, ПРОВОДИМЫХ В ФГБУ «НИИ КАРДИОЛОГИИ» СО РАМН В 2012 г. (II ПОЛУГОДИЕ)
1. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Сахарный диабет, метаболический синдром и сердечнососудистая патология: современные подходы к диагностике и лечению», г. Томск, 24-26 октября 2012 г.
2. IV Региональная междисциплинарная научно-практическая конференция «Клинические и нейрофизиологические аспекты психокардиологии», г. Томск, 8-9 ноября 2012 г.
3. V Всероссийская школа-семинар «Томская школа детских кардиологов», г. Томск, 22-23 ноября 2012 г.
4. Региональная научно-практическая конференция «Эффективность эндо-васкулярной и хирургической реваскуляризации при многососудистом поражении коронарного русла», г. Томск, 20 декабря 2012 г.
