CC BY
86
ЛАБОРАТОРНЫ1Е И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 34.15.63
РЕЦЕПТОРНАЯ ПРИРОДА КАРДИОПРОТЕКТОРНОГО ЭФФЕКТА КАННАБИНОИДОВ ПРИ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА
Ю.Б. Лишманов, О.В. Ласукова, Л.Н. Маслов, А.В. Крылатов
ФГБУ "НИИ кардиологии" СО РАМН, Томск E-mail: maslov@cardio.tsu.ru
RECEPTOR NATURE OF CARDIOPROTECTIVE EFFECT OF CANNABINOIDS DURING ISCHEMIA AND REPERFUSION OF ISOLATED HEART
Yu.B. Lishmanov, O.V. Lasukova, L.N. Maslov, A.V. Krylatov
Federal State Budgetary Institution "Research Institute for Cardiology" of Siberian Branch under the Russian Academy
of Medical Sciences, Tomsk
Установлено, что эндогенные агонисты каннабиноидных (СВ) рецепторов не участвуют в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии у неадаптированных крыс. Активация СВ1- и СВ2-рецепторов с помощью экзогенно вводимых каннабиноидов (HU-210, ACPA, CP55.940) способствует повышению устойчивости изолированного перфузируемого сердца к действию тотальной ишемии и реперфузии. Агонист СВ2-рецепторов JWH133, а также агонист СВ1-рецепторов анандамид и его энзиморезистентный аналог метанандамид не влияет на устойчивость сердца к действию ишемии и реперфузии. Кардиопротекторный эффект агониста СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 связан с активацией СВ1-рецепторов, расположенных в миокарде.
Ключевые слова: каннабиноидные рецепторы, ишемия, реперфузия, изолированное сердце.
The present study showed that endogenous agonists of cannabinoid (CB) receptors were not involved in the regulation of cardiac resistance to ischemia and reperfusion in non-adapted rats. Activation of CB1 and CB2 receptors by exogenously administered cannabinoids (HU-210, ACPA, and CP 55940) promoted an increase in the tolerance of isolated perfused heart to total ischemia and reperfusion. The CB2 receptor agonist, JWH133, the CB receptor agonist, anandamide, and its enzyme-resistant analogue, methanandamide, had no effect on the tolerance of heart to ischemia and reperfusion. The cardioprotective effect of CB1 and CB2-agonist, HU-210, was associated with activation of CB1 receptors, localized in the myocardium.
Key words: cannabinoid receptors, ischemia, reperfusion, isolated heart.
Введение
Общеизвестно, что за открытием ацетилхолина и катехоламинов последовало открытие их рецепторов. В случае эндоканнабиноидов события развивались прямо противоположным образом: сначала открыли каннабиноидные (СВ) рецепторы, а затем их эндогенные агонисты [9]. Каннабиноидные рецепторы первого типа (СВ1) имеются на эндотелиальных клетках артерий и капилляров [13], а также на нервных окончаниях симпатических нервов, иннервирующих сердце [10]. Каннабиноидные рецепторы второго типа (СВ2) находятся в кардиомио-цитах и эндотелиальных клетках артерий [13]. Установлено [8], что в миокарде синтезируются эндогенные кан-
набиноиды - анандамид и 2-арахидонилглицерол, однако их роль в регуляции функционального состояния сердца изучена недостаточно. Единичные работы свидетельствуют о том [1, 12, 14, 17], что экзогенно вводимые кан-набиноиды повышают устойчивость сердца к действию ишемии-реперфузии. Так, нами было показано, что активация СВ-рецепторов оказывает кардиопротекторный эффект в условиях коронароокклюзии и реперфузии миокарда in vivo [1]. Вместе с тем остается неясным, в какой степени кардиопротекторный эффект СВ-агонистов связан с активацией миокардиальных каннабиноидных рецепторов, а в какой - является результатом взаимодействия с рецепторами, расположенными экстракардиаль-но. Литературные данные о роли СВ1- и СВ2-рецепторов
в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии носят противоречивый характер. Одни авторы полагают, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ1-рецепторов [2, 13], а другие исследователи полагают [4, 7, 11], что инфаркт-лимитирующий эффект каннабиноидов определяется стимуляцией СВ2-рецепторов. Ответ на эти вопросы могли бы дать эксперименты in vitro с агонистами каннаби-ноидных рецепторов.
Цель: выяснить рецепторную природу кардиопротек-торного эффекта каннабиноидов.
Материал и методы
Эксперименты проводились на крысах самцах линии Вистар массой 250-300 г. Сердце, выделенное из грудной клетки, помещали в ванночку со льдом, подвешивали за аорту к канюле установки изолированного сердца и перфузировали раствором Кребса-Хензелайта. Все эксперименты проводили по следующей схеме: 20 мин адаптации + 10 мин перфузии фармакологическим агентом + 10 мин перфузии без фармакологического агента (“отмывка от препарата”) + 45 мин тотальной ишемии + 30 мин реперфузии. Раствор Кребса-Хензелайта готовили на дистиллированной воде, которую подвергали дополнительной очистке на установке “Simplicity” компании Millipore (Millipore, США). В качестве контроля были использованы изолированные сердца, которые перфузиро-вали по следующему протоколу: 20 мин адаптации + 10 мин перфузии с диметилсульфоксидом (DMSO, 0,01%,) + 10 мин “отмывка от DMSO” + 45 мин тотальной ишемии + 30 мин реперфузии. Используемые в эксперименте препараты растворяли в диметилсульфоксиде и добавляли в перфузионный раствор. Конечная концентрация DMSO составляла в растворе 0,01%. В этой концентрации он не влиял на сократимость миокарда и устойчивость сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям [4]. В работе были использованы: агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 ([(6aR)-trans-3-(1,1-Dimethylheptyl)-6a,7,10,10a-tetrahydro-1-hydroxy-6,6-dimethyl-6H-dibenzo [b,d]pyran-9-methanol) в конечных концентрациях
0,1х10-3 и 1,0х10-3 мМ; селективный агонист СВ1-рецеп-торов ACPA (arachidonilcyclopropilamid/N-(cyclopropil)-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenamide) в тех же концентрациях; агонист каннабиноидных рецепторов анандамид (ара-хидонилэтаноламид) - 1 мкМ/л; агонист каннабиноид-ных рецепторов метанандамид ((R)-N-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenamide) - 1,0х10-3 мМ; селективный агонист СВ2-рецепторов JWH 133 ((6aR,10aR)-3-(1,1-dimethylbutyl)-6a,7,1010a-tetrahydro-6,6,9-trimethyl-6H-dibenzo[b,d]pyran) - 0,1 мкМ; агонист СВ1- и СВ2-рецепторов СР55.940 ((-)-cis-3-[2-Hydroxy-4-(1 , 1 -dymethylheptyl)phenyl]-trns-4-(hydroxipropyl)cyclohexanol) - 0,1х10-3 и 1,0х10-3 мМ. При выборе концентраций СВ-агонистов мы опирались на ранее опубликованные нами данные о кардиопротектор-ной активности HU-210 [2]. Для изучения роли СВ1- и СВ2-рецепторов в реализации кардиотропных эффектов кан-набиноидов использовали селективный антагонист СВ1-рецепторов SR141716 (N-[piperidin-1-yl]-1-[1,2-
dichlorophenyl]-4-methyl-1H-pyrazole-3-caboxamid HCl) в конечной концентрации 0,1х10-3 мМ [6] и селективный антагонист СВ2-рецепторов SR144528 (N-(1S)-endo-1,3,3-trimethylbicyclo [2.2.1] hepta-2-yl]-5-(4-chloro-3-methylphenyl)-1-(4-ethylbenzyl)-pyrazole-3-carboxamide) в конечной концентрации 0,1х10-3 мМ [6]. В конце эксперимента в перфузате, собранном за 30 мин реперфузии, определялся уровень креатинфосфокиназы (КФК) с помощью стандартных наборов Ck NAC, (Marienhagen, Германия). Активность КФК определяли на спектрофотометре Smart Spec Plus (Bio-Rad, США). Конечный результат выражали в мкмоль НАДН/мин в пересчете на 1 г ткани сердца за 30 мин реперфузии (U/г). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы STATISTICA 6.0 (StatSoft). Для проверки нормальности распределения числовых показателей использовался критерий Колмогорова-Смирнова; для оценки достоверности различий между группами использовался непараметрический критерий Манна-Уитни для количественных признаков. Статистически значимыми считались различия при p<0,05. Результаты всех экспериментов приведены в рисунках, где указан разброс значений относительно средних величин.
Результаты и обсуждение
На первом этапе нашей работы мы исследовали роль эндогенных агонистов каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости миокарда при ишемии-реперфузии. Для этого нами были выполнены две серии экспериментов с использованием селективных блокаторов каннабиноидных рецепторов 1 и 2-го типов: SR141716 и SR144528 в конечной концентрации 0,1х10-3 мМ, что достаточно для полной блокады СВ1- и СВ2-рецепторов соответственно [6]. В контрольной серии после тотальной ишемии изолированного сердца с последующим возобновлением коронарной циркуляции отмечалось развитие некроза кардиомиоцитов. Об этом свидетельствовало повышение активности КФК в 4,5 раза в растворе, оттекающем от сердца, по сравнению с исходными значениями (рис. 1). В случае предварительной блокады СВ1-рецепторов миокарда с помощью SR 141716 или блокады СВ2-рецепторов с помощью SR144528 каких-либо существенных различий в активности креатинфосфоки-назы, по сравнению с контролем, в доишемическом и ре-перфузионном периодах нами отмечено не было. Изменение уровня КФК в оттекающем от сердца растворе оставалось практически идентичным в контрольной и опытной сериях.
Полученные результаты указывают на то, что эндогенные агонисты каннабиноидных рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости сердца неадаптированных крыс к действию ишемии и реперфузии. К сказанному следует добавить, что сходные данные были получены нами ранее в экспериментах in vivo, в ходе выполнения которых было установлено, что предварительное внутривенное введение селективного блокатора СВ1-рецепторов SR141716 или блокатора СВ2-рецепто-ров SR144528 не влияет на размер зоны инфаркта при коронароокклюзии и реперфузии [2].
мкМ/г X мин 40 35 30 25 20 15 10 5 0
—т—
' ' ЙШ8ІШ-
контроль
141528
С1>
144528
контроль
141716
ЭЯ
144528
Исходные значения до ишемии
Во время реперфузии
Рис. 1. Уровень КФК в перфузате до ишемии и во время реперфузии в сериях с применением блокатора СВ1-рецепторов 5К141716 и блокатора СВ2-рецепторов 5К144528 в конечной концентрации 0,1х10-3 мМ
Рис. 2. Сравнительный анализ кардиопротекторного эффекта агонистов каннабино-идных рецепторов (значения креатинфосфокиназы, собранные за 30 мин реперфузии). * - р<0,05 по сравнению с контролем. Контроль - ишемия и реперфузия
На втором этапе работы мы исследовали влияние агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов на устойчивость миокарда к действию ишемии и реперфузии: НИ-210, АСРА, JWH133, анандамид, метанандамид, СР55.940. В результате оказалось, что наиболее выраженный кардиопротек-торный эффект проявлял агонист каннабиноидных рецепторов Ни-210 в концентрациях 0,1х10-3 и 1,0х10-3 мМ, поскольку снижение реперфузионного выброса КФК при его применении составило в среднем 43% по отношению к аналогичным величинам в контроле (рис. 2). В серии с применением СР55.940 в концентрации 0,110-3 мМ активность креатинкиназы в перфузате во время реперфузии была в 2,2 раза ниже, чем в контроле (рис. 2). Однако использование СР55.940 в большей концентрации (1,0х10-3 мМ) не привело к ожидаемому усилению кар-диопротекторного эффекта, поскольку статистически значимого снижения активности КФК в перфузате во время реперфузии по сравнению с контролем мы не зарегистрировали (рис. 2). Таким образом, агонист СВ1- и СВ2-рецепторов СР 55.940 оказывает кардиопротекторное действие лишь в дозировке 0,1х10-3 мМ. Исчезновение кардиопротекторного эффекта СР55.940 по мере увели-
чения концентрации, по-видимому, связано с неспецифическим действием препарата, то есть с активацией пока не идентифицированных неканнабиноидных рецепторов, стимуляция которых негативно сказывается на устойчивости сердца к ишемии-реперфузии.
Наши дальнейшие исследования были продолжены в направлении изучения кардиопротекторных свойств эффектов селективных агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов. Применение селективного агониста СВ1-рецепторов АСРА в концентрации 0,1х10-3 мМ не приводило к достоверным изменениям активности КФК в перфузионном растворе, как до ишемии, так и в периоде реперфузии (рис. 2). Однако в большей концентрации (1,0х10-3 мМ) препарат оказывал достоверный кардио-протекторный эффект. В этом случае уровень КФК в перфузате был в 1,75 раза меньше, чем в контроле (рис. 2). Полученные данные дали основания полагать, что кардиопро-текторный эффект селективного агониста СВ1-рецепторов АСРА связан с активацией каннабиноидных рецепторов первого типа. При этом эффект препарата был дозозависимым, поскольку в меньшей дозировке АСРА не оказывал кардиопротек-торного действия, а антинекроти-ческий эффект этого СВ1-агониста отмечался только при использовании препарата в концентрации 1,0х10-3 мМ. Однако в этом случае нельзя было исключить вероятность того, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ2-рецепторов, поскольку К (константа ингибирования) к СВ2-рецепторам у этого агониста составляет 715 нМ. В связи с этим мы провели эксперименты с агонистом СВ2-рецепторов Х^Н133. Оказалось, что перфузия изолированного сердца раствором Кребса-Хензелайта, содержащим агонист СВ2-рецепторов JWH 133 (0,1х10-3 мМ), практически не повлияла на реперфузионный выброс КФК. Следовательно, исследуемый агонист СВ2-рецепторов не проявил кардиопротекторных свойств на модели тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца. Этот факт может свидетельствовать в пользу того, что кардиопро-текторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ1-рецепторов, расположенных в миокарде.
Исследование роли каннабиноидов в формировании устойчивости миокарда к действию ишемии и реперфузии мы продолжили с применением агонистов каннаби-ноидных рецепторов анандамида и его энзимоустойчивого аналога метанандамида. Исследуемые препараты не влияли на уровень креатинфосфокиназы в реперфузи-
мкм/r х мин
35
30
25
20
15
10
5
0
^yyyyy; NxsSSSSSSSn
/vyvyv NSSSSSnSSSn; лолл/у; *
m i m Л/V^A/ V\VvV4 \NXVv SKSKSS^4S\V wxxvxx
контроль HU-210 SR14 SR14 1+ 4+
HU-210HU-210
Исходные значения до ишемии
контроль HU-210 SR14 SR14 1+ 4+
HU-210 HU-210
Во время реперфузии
Рис. 3. Уровень КФК в перфузате до ишемии и во время реперфузии в сериях с применением агониста СВ1- и СВ2-рецепторов НИ-210 (0,1х10-3 мМ), антагониста СВ1-ре-цепторов 5К141716 (0,1 мкМ), антагониста СВ2-рецепторов 5К141716 (0,1х10-3 мМ). * - р<0,05 по сравнению с контролем. Контроль - ишемия и реперфузия
онном периоде. Данный факт мог быть связан со значительно меньшим сродством анандамида и метанандами-да к каннабиноидным рецепторам, чем у рассмотренных выше синтетических агонистов СВ-рецепторов [15]. Кроме того, отсутствие кардиопротекторного эффекта у этих препаратов в используемых нами концентрациях могло быть связано с тем, что анандамид и метанандамид подверглись энзиматическому гидролизу в ткани миокарда и в результате не оказали влияния на толерантность кар-диомиоцитов к действию ишемии и реперфузии. Более высокие концентрации анандамида и его аналога мы не использовали, потому что в высоких концентрациях они могут активировать ваниллоидные или анандамидовые рецепторы, к которым они проявляют умеренное сродство [16].
Следующим этапом нашей работы было выяснение роли СВ1- и СВ2-рецепторов в реализации кардиопро-текторного эффекта НИ-210. С этой целью были проведены серии экспериментов с применением селективных блокаторов СВ1- и СВ2-рецепторов: 5К141716 и 5К144528.
Оказалось, что кардиопротекторный эффект канна-биноида НИ-210 не проявляется в случае предварительной блокады СВ1-рецепторов с помощью 5К141716 (рис. 3). Как показано на рисунке 3, после перфузии изолированных сердец раствором, содержащим Ш41716 (0,1х10-3 мМ) и НИ-210 (0,1х10-3 мМ), реперфузионный выброс креатинкиназы практически не отличался от соответствующих значений контрольной серии. В то же время применение блокатора СВ2-рецепторов 5Я144528 не приводило к устранению кардиопротекторного эффекта НИ-210. При этом сами антагонисты никак не повлияли на уровень КФК в перфузате (рис. 1).
Выяснение рецепторной природы кардиопротектор-ного эффекта НИ-210 позволило заключить, что он реализуется посредством активации СВ1-рецепторов.
Заключение
Результаты выполненных экспериментов с антагонистами СВ1-и СВ2-рецепторов свидетельствуют о том, что эндогенные канна-биноиды не участвуют в регуляции устойчивости миокарда к ишемическим и реперфузионным воздействиям. Экзогенно вводимые синтетические каннабиноиды по способности повышать устойчивость сердца к ишемическим воздействиям и реперфузии располагаются следующим образом:
НИ-210>СР55.940>АСРА. При этом эти каннабиноиды имеют различное химическое строение и принадлежат к разным классам, что не мешает им проявлять кардиопро-текторные свойства. Выраженность кардиопротекторного эффекта использованных нами кан-набиноидов не зависит от их химического строения, а определяется сродством к СВ1-ре-цепторам. Цитопротекторный эффект каннабиноида НИ-210 связан с активацией СВ1-рецепторов.
Работа подготовлена при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям, государственный контракт № 02.740.11.0714, контракт №11519.112016, № 11.519.11.2028, РФФИ гранты: 10-04-00288,11-04-00467,11-04-98001, 11-04-98000,11-04-98004.
Литература
1. Маслов Л.Н., Крылатов А.В., Бернацкая Н.А. и др. Повышение устойчивости сердца к аритмогенным воздействиям и уменьшение зоны ишемического некроза миокарда при активации каннабиноидных рецепторов // Рос. физиол. жур.
- 2002. - Т. 88, № 5. - С. 560-567.
2. Ласукова О.В., Маслов Л.Н., Ермаков С.Ю. и др. Роль канна-биноидных рецепторов в регуляции толерантности сердца к действию ишемии и реперфузии // Известия РАН. -2008. - Т. 35, № 4. - С. 471-478.
3. Di Filippo C., Rossi F., Rossi S. et al. Cannabinoid CB2 receptor activation reduces mouse myocardial ischemia-reperfusion injury: involvement of cytokine/chemokines and PMN // J. Leukoc. Biol. - 2004. - Vol. 75, No. 3. - P. 453-459.
4. Du Toit E.F., Opie L.H. Antiarrhythmic properties of specific inhibitors of sarcoplasmic reticulum calcium ATPase in the isolated perfused rat heart after coronary artery ligation // J. Am. Coll. Cardiol. - 1994. - Vol. 23. - P. 1505-1510.
5. Gebremedhin D., Lange A.R., Campbell W.B. et al. Cannabinoid CB1 receptor of cat cerebral arterial muscle functions to inhibit L-type Ca2+ channel current // Am. J. Physiol. - 1999. - Vol. 276. - P. 2085-2093.
6. Hajrasouliha A.R., Tavakoli S., Ghasemi M. et al. Endogenous cannabinoids contribute to remote ischemic preconditioning via cannabinoid CB2 receptors in the rat heart // Eur. J. Pharmacol. - 2008. - Vol. 579, No. 1-3. - P. 246-252.
7. Hiley C.R. Endocannabinoids and the heart // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 2009. - Vol. 53, No. 4. - P. 267-276.
8. Howlett A.C. Cannabinoid receptor signaling // Handb. Exp. Pharmacol. - 2005. - Vol. 168. - P. 53-79.
9. Lagneux C., Lamontagne D. Involvement of cannabinoids in the cardioprotection induced by lipopolysaccharide // Br. J. Pharmacol. - 2001. - Vol. 132, No. 4. - P. 793-796.
10. Lepicier P., Bibeau-Poirier A., Lagneux C. et al. Signaling pathways involved in the cardioprotective effects of cannabinoids // J. Pharmacol Sci. - 2006. - Vol. 102, No. 2. -P. 155-166.
11. Lepicier P., Lagneux C., Sirois M.G. et al. Endothelial CB1-receptors limit infarct size through NO formation in rat isolated hearts // Life Sci. - 2007. - Vol. 81, No. 17-18. - P. 1373-1380.
12. Montecucco F., Lenglet S., Braunersreuther V. et al. CB(2) cannabinoid receptor activation is cardioprotective in a mouse model of ischemia/reperfusion // J. Mol. Cell. Car diol. - 2009.
- Vol. 46, No. 5. - P. 612-620.
13. Pertwee R.G. Pharmacology of cannabinoid receptor ligands // Curr. Med. Chem. - 1999. - Vol. 6, No. 8. - P. 635-634.
14. Toth A., Blumberg P.M., Boczôn J. Anandamide and the vanilloid receptor (TRPV1) // Vitam. Horm. - 2009. - Vol. 81. - P. 389419.
15. Walsh S.K., Hepburn C.Y., Kane K.A. et al. Acute administration of cannabidiol in vivo suppresses ischaemia-induced cardiac arrhythmias and reduces infarct size when given at reperfusion // Br. J. Pharmacol. - 2010. - Vol. 160, No. 5. - P. 1234-1242.
Поступила 16.05.2011
Сведения об авторах:
Лишманов Юрий Борисович, докт. мед. наук, чл.-корр. РАМН, научный руководитель отдела лучевой диагностики ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.
E-mail: zamdir@cardio.tsu.ru.
Ласукова Ольга Владимировна, канд. мед. наук, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной кардиологии ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.
E-mail: lov_81@list.ru.
Маслов Леонид Николаевич, докт. мед. наук, профессор, зав. лабораторией экспериментальной кардиологии ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.
E-mail: Maslov@cardio.tsu.ru.
Крылатов Андрей Владимирович, канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной кардиологии ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.
