CC BY
33
белка в сыворотке крови свиней //Пути интенсификации кормопроизводства и использования кормов в Ростовской области: Сб. ст. / Донской СХИ. — Перси-ановка. - 1981.-Т.16.вып.4.-С.75-77.
3. Кузнецов А.Ф. Некоторые показатели крови у свиней//Ветеринария. — 1981.-№6. - С.63-64.
4. Ладан П.Е., Белкина H.H. Влияние пищевого белка на состав крови и тканей свиней //Свиноводство. - 1961,-№5. - С.25-26.
5. Максименко В.Б. Количественная тонкослойная хроматография липидов и эфиров холестерола // Лабораторное дело. - 1983. -№12,- С. 17-18.
6. Михалап В.А. Изменения сывороточных белков крови у свиноматок в зависимости от беременности,
лактации и сезона года //Материалы науч. конф. по вопросам ветеринарии. М.,1971. — ч.1. — С.6-7,
7. Степашкина К.А. Бши KpoBi maix кл1тчне значения //Держа льроспвидав УССР. — 1958. - №6. — С.65.
8. Сытько В.И. Белковый обмен у свиноматок // Уральские нивы. - 1983,-№8. - С.48.
9. Anderson D.B., Kauffman R.G. Cellular and enzymatic changes in porcine adipose tissue during growth // J. Lipid. Ras. - 1973. - №14. - P. 160-168.
БЕРЕНДЯЕВА Людмила Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры химии.
УДК 616-001.08-036.82-07:616 В. Д. КОНВАЙ
П. П. золин
Институт ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета
РОЛЬ ОСТРОГО НАРУШЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ПУРИНОВ В РАЗВИТИИ ПОСТРЕАНИМАЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ ПЕЧЕНИ
Предпринята попытка объяснить постреанимационные повреждения печени у крыс с позиции теории острого нарушения метаболизма пуринов и предлагают повысить эффективность реутилизации клетками гип океан тине, ингибирование ксантиноксидазы и восполнение дефицита глутатиона — введением его экзогенного препарата.
Смертность среди больных, перенесших клиническую смерть, превышает 60%. Разработке эффективных лечебно-профилактических мероприятий препятствует недостаточное понимание механизмов повреждения ряда жизненно важных органов, в частности, печени, играющей важную роль в поддержании обменных процессов в нервной и других тканях.
В настоящей работе предпринята попытка объяснения постреанимационных повреждений печени с позиции теории острого нарушения метаболизма пуринов, впервые описанного нами [ 1).
Материалы и методы
Опыты проводили на белых крысах-самцах массой 180-220 г, у которых вызывали 6,5-минутную асфиксию перекрытием интубационной трубки. Продолжительность остановки сердца при этом составляла 1 мин. Реанимацию проводили путем непрямого массажа сердца в сочетании с искусственным дыханием. Через 0,5, 30, 90 мин и 6 ч после начала оживления у крыс, находящихся подэфирным наркозом, прижизненно замораживали печень. В ней определяли содержание молочной кислоты (Мл К, аденозинтрифос-фата (АТФ), аденозиндифосфата (АДФ), аденозинмо-нофосфата (АМФ), нуклеозидов и азотистых оснований (Н и АО), гипоксантина и ксантина (Г и Кс), мочевой кислоты (Мч К), гидроперекисей липидов
(Я-ООН), глутатиона (С-БН), антиокислительную активность липидов (АО АЛ), активность супероксиддис-мутаэы (СОД), каталазы (КАТ), глутатионперокси-дазы (ГлПО), глутатионредуктазы (ГлР) иглюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ). Об интенсивности биосинтеза пуринов и реутилизации гипоксантина судили по скорости включения в АТФ соответственно С14-глицинаи С14-гипоксантина. Скорость образования С-БН определяли по интенсивности включения в него С |4-глицина. Коррекцию обнаруженных метаболических нарушений проводили путем введения инозина, содержащего в своем составе пуриновый цикл и рибозу, аллопуринола, ингибитора ксантиноксидазы (КсО) или экзогенного С-БН. Изучали влияние указанных веществ на степень неврологического дефицита и летальность животных. Результаты исследования обрабатывали статистически. Методы исследования и проводимые процедуры описаны в работе [ 3].
Полученные данные и их обсуждение
Из приведенных в таблице данных видно, что во время асфиксии в печени резко увеличивается содержание Мл К, что связано с интенсификацией анаэробного гликолиза, развившейся в условиях прогрессирующего снижения в тканях напряжения кислорода. Закисление клеток, в свою очередь, приводит к усилению катаболизма АТФ и АДФ, содержание ко-
торых резко снижается, до АМФ, Н и АО, уровень которых увеличивается. При этом расщепляется также значительное количество АМФ, о чем свидетельствует снижение общего количества АТФ, АДФ и АМФ.
Развившийся во время асфиксии дефицит адени-ловых производных в печени выражен и в первые 1,5 ч постреанимационного периода, несмотря на резкое увеличение скорости биосинтеза пуринов de novo. Интенсивность включения Си-глицина в АТФ в этот период составляете,75±0,07 против 0,92 ±0,06 импульсов \(ммоль. мин) (Р<0,001). Снижение общего количества АТФ, АДФ и АМФ, связано, вероятнее всего, с продолжающимся расщеплением АМФ до ГпКи Кс, уровень которых в печени продолжает оставаться повышенным. Способствует этому закисление тканей, вызванное усиленной выработкой МлК. Нами установлено, что скорость гликолиза, определяемая in vitro, не только не увеличивается, но даже снижается. На 6,5-й мин асфиксии, через 5 и 30 мин после оживления она составляет соответственно 3,25±0,18, 3,06±0,33 и 2,94±0,23 нмольлактата/(мг белка, мин) (Р< 0,05). Тем не менее, это не является препятствием для усиления ее in vivo, поскольку каталитическая мощность ферментов гликолиза превышает мощность их, необходимую для функционирования клетки. Это подтверждается повышенным содержанием МлК в печени на данных этапах исследования, связанным с усиленной генерацией ее в реакциях гликолиза.
Вместе с тем развившийся в гепатоцитах лакто-ацидоз в меньшей степени связан с недостаточно эффективной реутилизацией МлК, образующейся в печени, и поступающего в нее из других органов, в реакциях глюконеогенеза. Интенсивность включения С1''-глицина в гликоген печени не только не снижена, но даже увеличена. Через 90 мин после реанимации она составляет 8,84 ± 1,26 по сравнению с 5,63 ±0,18 импульсов /(мггликогена-' мин) (Р<0,05).
Лактоацидоз, вызванный вышеуказанными факторами, способствует усиленному катаболизму АМФ до инозина, ГпК и Кс. Известно, что при снижении рН активируются аденилатдезаминаза, расщепляющая аденилатдоинозинмонофосфата (ИМФ), и аде-нозиндезаминаза, отщепляющая аминогруппу от аде-нозина [5]. Данный нуклеозид образуется после дефосфорилирования АМФ в результате реакции, катализируемой 5'-нуклеотидазой[5]. Последняя также отщепляет остаток фосфорной кислоты от ИМФ, превращая его в инозин. Активируется 5'-нуклеоти-даза при сниженном содержания в клетке АТФ , ее ингибитора [2].
Все вышесказанное позволяет предположить, что в раннем постреанимационном периоде катаболизму адениловых мононуклеотидов в печени до инозина и гипоксантина способствует как продолжающийся лактоацидоз, так и недостаточная эффективная генерация в митохондриях АТФ, обусловленная дефицитом АДФ, усиливающем тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование. Сами же митохондрии во время асфиксии и в первые часы после оживления сильно не повреждаются. Нами отмечено лишь снижение скорости потребления этими органоидами кислорода после добавления к ним глутамата (в состоянии V3) на 6,5-й минуте асфиксии (до 1,45±0,03 против 1,74±0,07мк-атомкислорода/(мгбелка-с) (Р< 0,01). Через 5 и 90 мин после оживления этот показатель даже увеличен (соответственно до 1,62±0,05и 1,87±0,08 по сравнению с 1,46±0,05 и 1,44±0,09 мк-атом кислорода/(мг белка-с) (Р < 0,05)). Торможение функции митохондрий можно объяснить снижением в клетках
уровня АДФ, развившемся в условиях общего дефицита адениловых производных.
Чрезмерному катаболизму адениловых мононуклеотидов, наряду с вышеуказанными факторами, способствует также недостаточно эффективная реутилизация образующегося гипоксантина в результате реакции, катализируемой гипоксаш-ин-фосфорибозилтрансферазой, вследствие дефицита второго субстрата этого энзима — фосфорибозил-дифосфата (ФРДФ). Последний вовлекается в реакции биосинтеза пуриновых мононуклеотидов, интенсификация которого в печени в первые 90 мин постреанимационного периода была отмечена выше. Образуется ФРДФ из рибозо-5-фосфата, генерация которого в пентозном цикле в этот период недостаточно эффективна вследствие торможения активности Г-6-ФДГ, ключевого энзима этого метаболического пути, и дефицита глюкозы, усиленно окисляющейся в реакциях анаэробного гликолиза. Введение инозина, содержащего в своем составе рибозу, снижает дефицит адениловых мононуклеотидов в печени через 30 мин после оживления. Еще больший эффект оказывает введение экзогенной рибозы, которая не только уменьшает нарушения обмена веществ в организме оживленных животных, неврологический дефицит, но и уменьшает их летальность.
Вышеуказанные метаболические нарушения приводят к увеличению уровня ГпК и Кс и последующего окисления этого вещества до МчК, уровень которых в печени в первые 30 мин после реанимации повышен. Данная реакция в физиологических условиях катализируется ксантиндегидрогеназой (КсДГ), восстанавливающей НАД и не продуцирующей активные формы кислорода. При частичной деструкции молекулы этого энзима или окислении входящих в ее состав сульфгидрильных групп происходит конверсия КсДГ в ксантиноксидазу (КсО), способную генерировать супероксидные радикалы (молекулы кислорода, содержащие неспаренные электроны) и перекись водорода. При взаимодействии их между собой образуются гидроксильные радикалы, наиболее реакцион-носпособные из известных окислителей.
Конверсии КсДГ в КсО в раннем постреанимаци-опном периоде способствует окисление сульфгидрильных групп энзима, происшедшее в результате снижения в гепатоцитах уровня в-БН вследствие метаболических нарушений, описанных ниже. Введение крысам перед асфиксией в-БН снижает продукцию КсО-й активных форм кислорода, что выражается в предотвращении чрезмерного расхода фонда липидных антиоксидантов. АОАЛ печени крыс, получавших данный трипептид, через 30 мин после реанимации составляет 6,38 ±0,26 по сравнению с 5,53 ±0,34 мэкв/мглипидов у животных, оживленных (Р<0,05).
Известно, что гидроксильные радикалы способны повреждать мембранные структуры клеток. Фосфоли-пидная основа последних, на которой располагаются ферменты, и происходит перенос электронов, является слабым эвеном в ауторегуляционном аппарате энергетического цикла клетки. Это связано с наличием в составе фосфоглицеридов мембранных структур ненасыщенных жирных кислот, дивенилметановая основа которых легко вступает в реакцию отрыва гид-роксильным радикалом атома водорода. Это приводит к образованию свободных радикалов, а в присутствии кислорода — к иницированию реакции автоокисления фосфоглицеридов с последующим увеличением в клетках уровня продуктов этого процесса - К-ООН. Увеличение содержания последних в печени отмечено нами на всех этапах раннего постреанимационного
Таблица 1
Показатели энергетического обмена и перекисного окисления липидов в печени контрольных крыс и перенесших 6,S-минутную асфиксию, М±т
Показатели п Контроль После реанимации
0 мин 5 мин 30 мин 90 мин 6 часов
МлК 10 15,8±1,9 28, «±1,6* 31,611,8* 32,814,5* 19,911,7 19,210,2
АТФ 6 10,4±1,6 3,810,5* 8,111,2* 13,711,3* 17,713,0 20,112,3
АДФ 6 14,7±1,2 5,Э±6,7* 8,310,9* 10,810,7 7,110,7 . 15,611,6
АМФ 6 7,8±0,9 11,3+1,6* 5,9±0,7* 7,610,4 4,110,6* 10,410,2
АТФ+АДФ+ +АМФ 6 41,1 ±2,8 2,0±t,5- 23,511,3* 32,2+1,8* 28,914,3* 46,112,0
Ни АО 6 Э2,2±2,8 67,016,7* 43,313,2" 45,23.2* 54,918,8* 37,014,7
ГпК+Кс 6 0,470±0,040 0,97610,062* 0,822+0,128* 0,82710,040* 0,64210,039* 0,50010,012
МчК 8 0,232±0,021 0,48010,021* 0,52010,015* 0,40910,028* 0,28610,010 . 0,24410,033
AOAJ1 10 6,14±0.09 5.5610,54* 6;14±0,44* 6,6610,28 8,2110,60 • 8,3810,36
сод 10 15,9±0,8 9,610,4* 11,810,5* 15,111,1 14,311,0 23,613,3*
КАТ 10 11,0±1,1 5,810,5* 8,010,6* .9,61.1,5 .6,710,7* 66,6121,3"
R-OOH 10 2,70±0,16 4,9410,46" ' 5,0110,1* 4,9810,44* 4,9210,36* 4,5810,19*
G-SH 10 42,5111,9 38,6±2,3 42,011,4 34,811.4* 33,213,9* 26,212,2*
ГлПО 10 53,2±3,3 35,312,7* 44,4±3,0* 55,114,0 51,614,7 58,414.4
ГлР 10 39,812,5 28,7it9* 34,612,3 38,911,5 39,413,6 36,313,8
: Г-6-ФДГ 10 4,3810.22 2,9610,15*. 4,6810,29 4,9910,25 5,1110,36 2,8910,30*
* - различие достоверно по сравнению с контролем. Сокращения в разделе «Материал и методы».
Содержание МлК, АТФ, АДФ, АМФ, ГпК и Кс, С-вН в нмОль/мг белка, Н и АО - в единицах оптической плотности/мг белка,
Р-ООН - в нмоль/мг липидов, активность СОД и КАТ - в единицах/мг белка,
ГлПО, ГлР и Г-6-ФДГ - в нмоль/(мин мг белка).
периода. Свидетельством того, что оно связано с продукцией КсО-й активных форм кислорода является снижение уровня - Я-ООН при ингибировании этого энзима аллопурйнолом или метронидазолом.
Определенный вклад усилениилипопероксидации мембранных структур гепатоцитов оживленных животных, наряду с продукцией КсО-й активных форм кислорода, вносит и недостаточно эффективное функционирование системы антиперекисной защиты. Первым звеном последней являются СОД и КАТ, являющиеся, наряду с карбоангидразой, самыми активными в природе ферментами. Активность СОД, катализирующий реакцию дисмутации супероксидного радикала в перекиси водорода, и КАТ, разрушающий перекись водорода снижена уже на 6,5-й мин асфиксии и продолжает оставаться таковой в первые 5 мин постреанимационного периода. Это, вероятно, является одной из причин высокой уязвимости тканей ряда жизненно важных органов в первые минуты после оживления. Известно, что даже в физиологических условиях из четырех миллиардов супероксидных радикалов, «проходящих» через СОД, один не инакти-вируется. При снижении ее активности число не обезвреженных радикалов может возрасти.
Вторым звеном системы антиперекисной защиты являются антиоксиданты. Токоферол встраивается в фосфолипидную мембрану и своим гидрофобным радикалом закрывает двойные связи арахидоновой кислоты. Циклическая часть молекулы его инактивирует свободные радикалы, превращаясь в токоферилХи-нон. Последний восстанавливается аскорбатом обратно в токоферол. Образующийся при этомдегидро-аскорбат восстанавливается в аскорбат в-БН. В водной фазе клетки аскорбат и в-БН непосредственно инак-тивируют перекисные соединения. Нами установлено, что в первые 30 мин постреанимационного пери-
ода в печени снижена АОАЛ, которая главным образом обеспечивается токоферолом. Уровень аскорбата и в-БН в гепатоцитах в этот период времени еще не снижается. Ингибирование КсО аллопурйнолом или метронидазолом в значительной мере предотвращает снижение антиокислительной активности в печени.
Усиление продукции КсО-й супероксидных радикалов и перекиси водорода на фоне сниженной активности СОД, КАТ и антиокислительной активности липидов создает угрозу чрезмерной липоперокси-дации мембранных структур. В этих условиях устойчивость последних к повреждению во много зависит от эффективности инактивации уже образовавшихся Я-ООН в результате реакции, катализируемой ГлПО-й. При этом Я-ООН взаимодействует с С-.БН и превращается в безвредную для клетки гидроокись жирной кислоты. Образующийся параллельно глутатионди-сульфид восстанавливается НАДФЧН2 ГлР-й в С-БН. НАДФЧНг генерируется в Г-6-Ф ДГ-й и 6-фосфоглю-конатдегидрогеназной реакциях пентозного цикла.
Проведенные нами исследования показали, что эффективность инактивации уже образовавшихся Я-ООН также снижается. В первые 5 мин постреанимационного периода в печени снижена активность ГлПО, ГлР и Г-6-ФДГ. Через 30 и 90 мин после оживления она восстанавливается до конрольного уровня, но уменьшено содержание С-БН. Можно полагать, что восстановление активности ГлПо в условиях интенсивного образования Я-ООН приводит к усиленному вовлечению этого трипептида в реакции обезвреживания перекисных соединений с последующим развитием его дефицита. Интенсивность биосинтеза его из глутамата, цистеина и глицина при этом не только не снижается, но даже увеличивается. Скорость включения в С-БН С14-глицина 11,1 ± 1,3 по сравнению с 4,4 ±0,2 импульсами/(ммоль-мин) в контроле (Р<0.001).
Тем не менее, это не предотвращает развитие дефицита данного соединения, Введение животным перед асфиксией G-SH не только восполняет его дефицит в печени через 30 мин после реанимации, предотвращает снижение антиокислительной активности липи-дов, но и снижает содержание R-OOH.(ao 3,59±0,15 по сравнению с 6,43±0,62 нмоль/мглипидов; Р<0,01). Отрицательным последствием дефицита G-SH является, на наш взгляд, не только снижение эффективности системы антиперекисной защиты, но й окисление сульфгидрильных групп КсДГ с последующей конверсией ее в КсО, о чем шла речь выше.
В дальнейшем, через 6 ч после реанимации, гипок-сические явления в печени выражены не так резко, как на предыдущих этапах исследования. Содержание МлК, АТФ, АДФ, НиАО, ГпК и Кс, МчК достоверно не отличается отконтроля. Это позволяет уменьшить скорость катаболизма ггуриновых мононуклеотидов. Тем не менее, интенсивность свободнорадикальных процессов в этом органе продолжает оставаться повышенной. Можно полагать, что это связано с высокой степенью конверсии КсДГ в КсО, связанной с продолжающимся дефицитом G-SH. Усиленная генерация супероксидных радикалов и перекиси водорода приводит к компенсаторному увеличению в печени активности СОД и КАТ. Несмотря на это, интенсивность липопероксидации мембранных структур продолжает оставаться повышенной, о чем свидетельствует повышенное содержание в гепатоцитах R-OOH.
Определенный вклад в увеличение уровня последних вносит и недостаточно эффективная инактивация R-OOH в результате реакции, катализируемой ГлПО^й. Активность последней в печени через 6 ч после реанимации даже увеличена, что можно объяснить усиленным биосинтезом ее в условиях повышенной генерации перекисных соединений. Тем не менее, in vivo эффективность инактивации R-OOH лимитируется.недостаточной обеспеченность тканей НАДФ.Н2, связанной с торможением реакций пентоз-ного цикла. Активность Г-6-ФДГ, лимитирующей скорость окислительной ветви этого метаболического пути, в гепатоцитах через 6 ч после оживления снижена. Функционирование пентозного цикла в этих условиях может тормозиться также вследствие недостаточной обеспеченности тканей глюкозой, а также никотинамидом и тиамином,необходимыми ддя биосинтеза коферментов Гл-б-ФДГ, 6-фосфЪглюконат-дегидрогеназы и транскетолазы.
Выводы
1. Во время 6,5 минутной асфиксии ий первые 90 мин постреанимационного периода в печёнй крыс выражены явления гипоксии, что выражается врезком увеличении в ней содержания молочной кислоты.
2. Развившийся в печени оживленных животных лактоацидоз способствует усилению катаболизма аденилата до инозина, гипоксантина и ксантина с последующим развитием дефицита адениловых производных тормозящего генерацию АТФ в клетках.
3. Увеличение в гепатоцитах реанимированных крыс уровня гипоксантина и ксантина приводит к усиленному окислению их ксантиноксидазой до мочевой кислоты, сопряженному с чрезмерной продукцией этим ферментом активныхформ кислорода. •
4. Продуцируемые ксантиноксидазой активные формы кислорода истощают антиоксидантную систему с последующим увеличением интенсивности липопероксидации мембранных структур гепатоцитов. Уменьшить интенсивность этого явления можно путем восполнения дефицита адениловых производных, ингибирования ксантиноксидазы и восполнение недостатка в организме глутатиона.
5. Через 6 часов после оживления, несмотря на уменьшение интенсивности катаболизма пуринов в печени, интенсивность липопероксидации мембранных структур в печени продолжает оставаться высокой.
Литература
1. Киреев М.М., Конвай В.Д. Продукты деградации кислоторастворимых нуклеотидов в больших полушариях головного мозга крыс в различные сроки умирания организма. //Патогенез и экспериментальная терапия терминальных состояний. —Омск, 1976, — С. 44-45.
2. Кольтовер В.К. Теория надежности, супероксидные радикалы и старение. //Успехи совр. биологии. -1983. -Том.-96,№1. -С.85-100.
3. Конвай В.Д. Нарушение пуринового обмена в печени в постреанимационном периоде и его профилактика. Дисс... доктора мед. наук. —Омск, 1988. —417с.
4. Конвай В. Д., ЗолинП.П. Средство для коррекции энергерического обмена. Патент РФ на изобретение №2169568. //Бюллетень изобретений и открытий. -2001. - № 11.
5. ArchJ.R.S., Newsholm Е.А. Activities and some properties of 5'-nucleotidase, adenosine kinase and adenosine dearriinise iti tissue from vertebrates// Biochem.J. — 1978. -V. 174, № 3. - P. 965-977.
6. Bulh M.R. Purine metabolim in ischemic kidney tissue//Dan.med.bull. - 1982.-V. 29, № l.-P. 1-26.
КОНВАЙ Владимир Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры химии. ЗОЛИН Петр Петрович, ассистент кафедры химии.
