CC BY
40
patients with gastrointestinal tract pathology. It is found out that the prevalence of this sign decreases in the series of antilactoferrin (ALfA) - antilysozymic (ALA) activities. The values of studied signs correlated with pathogenic indices of protozoa Blastocystis. High values of ALfA and ALA as compared to background level in protozoa Blastocystis can serve as an evidence of their role in intestinal dysbiosis development.
Key words: protozoa, Blastocystis hominis, persistence, antilactoferrin activity, antilysozymic activity, gastroenterological patients.
УДК 632.938
РОЛЬ АУТОАНТИТЕЛ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА И ПОДДЕРЖАНИИ МЕТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ
Г.Т. ЛЮТФАЛИЕВА*
Проведено исследование содержания и функциональной роли циркулирующих антител к инсулину, к клеткам островков Лангер-ганса и к декарбоксилазе глютаминовой кислоты во взаимосвязи с содержанием глюкозы, инсулина, С-пептида и некоторыми иммунологическими показателями в сыворотке крови практически здоровых жителей Европейского Севера.
Ключевые слова: антителообразование, аутоантитела, регуляция метаболических процессов, экологическая иммунология, физиология.
В последние годы имеется прогресс в понимании того, что значимость аутоантителообразования не ограничивается аутосен-сибилизацией, а определяется участием аутоантител в сохранении гомеостаза. Наличие аутоантител у практически здоровых людей свидетельствует о том, что образование их является физиологическим процессом. Естественно при этом возникают вопросы об их значимости. Литературные данные, касающиеся исследований физиологической роли аутоантител, не многочисленны и носят предположительный характер. Возникает закономерный вопрос: если аутоантитела - это регуляторные молекулы, а стойкое повышение либо снижение их содержания в кровотоке чревато патологическими последствиями, каким образом и что именно эти молекулы могут регулировать в нормальных условиях?
Цель исследования - изучить механизмы участия аутоан-тител в регуляции функциональной активности углеводного обмена и их метаболические эффекты у жителей Европейского Севера. Известно, что у здорового человека на Севере, в условиях комбинированного воздействия факторов среды и особенностей функционирования метаболических механизмов, возрастает роль регуляторных процессов [5].
Материалы и методы исследования. Проведено исследование 159 женщин от 30 до 60 лет. Среди них 75 человек проживающих в г. Архангельске и 84 человека - коренные жители поселка Нельмин-Нос НАО. Группы сопоставимы по возрасту и индексу массы тела (ИМТ). Обследуемые являлись клинически здоровыми добровольцами, которые на момент обследования не страдали острыми инфекционными заболеваниями, и у которых не выявлены признаки аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний, частота ОРЗ составляла не более 1-2 раз в году. Дизайн исследования включал использование анкетного опроса по специально разработанным вопросам. Все обследуемые были поставлены в известность о проводимом исследовании и дали письменное согласие на участие в нем.
Архангельское городское население состояло, главным образом, из этнических русских, родившихся и постоянно проживающих на территории Архангельской области. Добровольцы из НАО - преимущественно ненцы, частично смешанные с коми и русскими, проживающие в п.Нельмин Нос НАО. Осмотр и забор крови у коренных жителей Заполярья проводился в рамках экспедиционных работ, проводимых ИФПА УрО РАН.
Из общей группы обследуемых северян от 30 до 60 лет, сформированы две рандомизированные группы сопоставимые по возрасту: группа 1 - лица с повышенным и пороговыми значениями антител к инсулину (больше 5 Ед/мл, п=54) и группа 2 - лица, у которых содержание аутоантител не превышает 5 Ед/мл (п=105).
Основным методом исследования являлся «конкурентный» иммуноферментный анализ (ИФА) в микропланшетном формате, который проводился на автоматическом иммуноферментном
* Учреждение РАН Институт физиологии природных адаптаций Уро РАН, 163000, г.Архангельск, пр.Ломоносов, 249
анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-Rad» (Германия-США). Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов А, М, G, E, а также цитокинов ИЛ-1 ß, ИЛ-4, ИЛ-6 проводили с использованием тест систем компании «Вектор-Бест» (Новосибирск), ИЛ-10 - «Biosource» (Europe S.A.), ФНО-а (диагностические наборы «ProCon», ООО «Протеиновый контур», С-Петербург). Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили стандартным методом преципитации с использованием 3,5% и 7,5% ПЭГ-6000 в микромодификации реагентами компании «Panrec sintesis», Испания (Барселона).
Циркулирующие IgG антитела к инсулину (АТ к инсулину) исследовали с помощью иммуноферментного набора для количественного определения антител к человеческому инсулину в сыворотке «Анти-Инсулин» производства фирмы «Orgentec» (Германия). Согласно рекомендациям фирмы-производителя: нормальная концентрация антител - меньше 5 Ед/мл, пороговые значения - 510 Ед/мл, повышенные - больше 10 Ед/мл. Антитела к декарбоксилазе глютаминовой кислоты класса IgG (АТ к ДКГ) в сыворотке крови определяли тест-набором фирмы «Biomedica Gruppe». Референтные значения: отрицательный - <1 Ед/л, пороговые значения ->1-1,05 Ед/л, положительный - >1,05 Ед/л. Антитела к клеткам островков Лангерганса класса IgG (АТ к клеткам о.Лангерганса) в сыворотке крови исследовали с помощью тест-системы фирмы «Biomedica Gruppe». Диапазон значений: отрицательный - <0,95 Ед/мл, положительный - >1,05 Ед/мл.
Количественное содержание инсулина и С-пептида в сыворотке крови определяли реактивами фирмы «DRG» (Германия). Референтные значения инсулина - 2-25 мкМЕ/мл, С-пептида -0,5-3,2 нг/мл.
Натощаковый уровень глюкозы в сыворотке крови определялся ферментативным колориметрическим методом с использованием наборов "Chronolab AG" (Швецария) ( референтные значения 4,2-6,09 ммоль/л).
Количество клеток гемограммы, моноцитограммы, лимфо-цитограммы подсчитывали в мазках крови, окрашенных по методу Романовского-Гимза. Моноцитограмму определяли по методу О.Н. Григоровой [2]. Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли с помощью тест-набора химической компании «Реа-комплекс» (г. Чита). Выделение мононуклеаров из периферической крови производили по методу A.Boymn [7]. Для фенотипи-рования лимфоцитов использовали непрямую иммуноперокси-дазную реакцию с применением моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр» и ООО «Сорбент» г. Москва).
Статистический анализ результатов исследования проведен с помощью компьютерной программы статистической обработки данных «SPSS for Windows. Версия 13». Для всех имеющихся выборок данных проверена гипотеза нормальности распределения (по критерию Колмогорова-Смирнова). Числовые характеристики представлены в виде: средняя арифметическая ± ошибка средней, стандартного отклонения, в условиях подчинения данных закону нормального распределения. В процессе статистической обработки результатов непараметрического анализа, исследованные количественные показатели представлены как медиана и интерквартиль-ные ранги Ме (L-H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н -верхний квартиль, р - достигнутый уровень значимости. Достоверность различий между группами определяли по критерию t Стъю-дента, критерию Фишера и критерию х2, использовались непараметрические тесты - Mann-Whitney Test и Kruskal-Wallis Test при множественном сравнении. Корреляции между показателями определяли с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена и коэффициента линейной корреляции Пирсона. Проводился однофакторный регрессионный анализ. Критический уровень значимости р при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение. Проведенные исследования показали, что сывороточное содержание глюкозы у женщин в возрасте 30-60 лет составляет 4,50±0,69 ммоль/л, отмечается большая вариабельность концентрации инсулина (7,37(4,51-12,26) мкЕд/мл), со смещением в сторону более низких значений относительно рекомендуемых нормативов. Установленный средний базальный уровень С-пептида характеризуется как сохраненный, но сниженный вариант секреторного ответа (0,21(0,13-0,91) нг/мл).
Анализ зависимости исследуемых показателей от района проживания выявил смещение уровня гликемии в сторону низких значений (4,26±0,08 ммоль/л против 4,95±0,11ммоль/л; р<0,001) и
относительное повышение уровня С-пептида в сыворотке крови жителей Заполярья (0,24(0,16-0,36) нг/мл против 0,17(0,09-0,24) нг/мл; р=0,022), что согласуется с литературными данными [5]. Зависимости концентрации инсулина от района проживания в нашем исследовании не зарегистрировано (р=1,08).
В результате исследований, включающих определение уровня циркулирующих ^О антител к инсулину, антител к декарбокси-лазе глютаминовой кислоты, клеткам островков Лангерганса у северян определен весь спектр изучаемых аутоантител в различных концентрациях. Среднее содержание их не превышает физиологических пределов, но уровни их концентраций смещены в сторону больших значений. Частота регистрации повышенных концентраций спектра исследуемых антител в среднем составила 1,74%.
У жителей Заполярья содержание антиинсулиновых антител выше, чем у жителей г.Архангельска (табл.1).
Таблица 1
Сравнение содержания антиинсулиновых антител у жителей г. Архангельска и п.Нельмин-Нос НАО
АТ к инсулину , Ед/мл АТ к ДКГ, ЕД/мл АТ к клеткам о .Лангерганса, Ед/мл
г. Архангельск 1,80 (0,65-3,11) 0,16 (0,14-0,18) 0,29 (0,18-0,42)
НАО 2,63 (1,56-4,86) 0,22 (0,11-0,45) 0,40 (0,30-0,47)
р р=0,030 р=0,380 р=0,005
Повышение концентрации аутоантител у жителей Заполярья регистрируется на фоне невысоких значений уровня базаль-ной секреции С-пептида (0,24 (0,16-0,36) нг/мл), инсулина (7,48 (3,78-11,56) мкЕд/мл) и более низкого уровня гликемии (4,26±0,08 ммоль/л против 4,95±0,11ммоль/л у жителей г. Архангельска. Методом однофакторного регрессионного анализа установлено, что концентрация глюкозы является предиктором влияния на уровень АТ к инсулину (R2=47,7; р=0,026).
На фоне повышения концентраций антител к инсулину регистрируется снижение уровня глюкозы (с 4,61±0,09 ммоль/л до 4,19±0,13 ммоль/л; р=0,009) и повышение С-пептида (с 0,19(0,11-0,27) нг/мл до 0,36(0,21-0,67) нг/мл; р=0,005). Согласно недавним исследованиям К. Siewko увеличение уровня С-пептида является индикатором компенсаторной секреции р-клеток и может служить косвенным доказательством наличия инсу-линрезистентности [15].
Повышение уровня инсулина сопряжено с ростом концентрации ЦИК класса IgG на 32,76% (r=0,40; р=0,004) и повышением провоспалительных цитокинов ФНО-а на 50,88% (6,78(3,33-14,51) против 3,33(1,99-7,11) пг/мл; р=0,005) и ИЛ-6 на 32,84% (9,35(8,65-14,51) против 6,28(3,42-10,88) пг/мл; р=0,017). Формирование ЦИК помогает низкомолекулярным белкам избежать гломулярный фильтр и захват клетками, что пролонгирует их циркуляцию. Пролонгирование клиренса иммунных комплексов с инсулином существенно повышает их иммуногенность и опосредует повышение продукции аутоантител.
Регистрируемая отрицательная взаимосвязь антител к инсулину с ЦИК IgG (r=-0,41; р=0,033) является отражением краткосрочности образования и сохранения комплексов гормон-антитело в кровотоке с последующей диссоциацией соответствующих антигенных структур.
Принципиально важно отметить способность антител специфически взаимодействовать с антигенами-мишенями in vitro, меняя их конформационные характеристики [6]. Влияя на пространственную структуру белков, блокируя либо активируя определенные функциональные сайты антигенов, антитела оказываются универсальным инструментом, способным специфически и обратимо менять функциональную активность своих мишеней [13].
Показано, что взаимосвязь исследуемых антиинсулиновых антител представляет собой систему регулирования и контроля метаболических процессов, направленную на поддержание функциональной активности углеводного обмена и поддержание метаболизма глюкозы (рис).
Выявлены положительные ассоциации АТ к ДКГ с АТ к инсулину (r=0,45; р=0,023) и отрицательные с АТ к клеткам островков Лангерганса (r=-0,47; р=0,020). Регистрируемое вторичное повышение продукции аутоантител носит адаптивно-
компенсаторный характер. В частности, оно способствует повышению эффективности клиренса органа от продуктов распада отмирающих клеток и активирует регенераторные процессы.
Установлено, что концентрация инсулина выше у тучных лиц (11,671(8,21-15,23) мкЕд/мл против 4,51 (3,18-6,25) мкЕд/мл; р<0,001) и частично это зависит от объема висцерального жира (Chi.square -38,929; df - 4; sig.-0,000). Выявленные устойчивые ассоциации уровня инсулина с ИМТ (r=0,57; р<0,001) отражают взаимосвязь увеличения синтеза и секреции адипоцитами ФНО-а, с последующей стимуляцией синтеза ИЛ-6, что обуславливает развитие инсулинорезистентности [1,14]. Пропорционально нарастанию массы жировой ткани и инсулинорезистентности концентрация ИЛ-6 увеличивается. Известно, что этот адипоцитокин оказывает прямое воздействие на метаболические процессы путем подавления чувствительности рецепторов инсулина, стимулируя липолиз и тормозя секрецию адипонектина [4,1]. В наших исследованиях выявлены положительные взаимосвязи между содержанием инсулина и уровнем ФНО-а (r=0,40; р=0,003) и ИЛ-6 (r=0,38; р=0,044), а также между уровнем базальной секреции С-пептида и ФНО-а (r=0,35; р=0,020), ИЛ-6 (r=0,33; р=0,006) и ИЛ-ф (r=0,49; р=0,001).
Повышение уровня циркулирующих АТ к инсулину (r=0,44; р=0,044) и АТ к клеткам островков Лангерганса (r=0,40; р=0,001) сопровождается повышением концентрации ИЛ-6 (рис). Содержание ААТ к ДКГ имеет отрицательные взаимосвязи с уровнем ИЛ-6 (r=-0,40; р=0,009). В литературе имеются сведения, что уровни ИЛ-6 в центральной нервной системе отрицательно коррелируют с количеством жирового депо у больных с избыточной массой тела. В эксперименте показано, что центральное введение ИЛ-6 уменьшает жировую массу у грызунов и способствует регрессу врожденного ожирения у ИЛ-6 дефицитных мышей [10].
Итак, пролонгирование циркуляции инсулина в периферической крови на фоне снижения процессов утилизации глюкозы, обусловленной инсулинрезистентностью, существенно повышает иммуногенность инсулина и опосредует повышение продукции аутоантител.
о. Лангерганса
Рис. Характер взаимосвязи антиинсулиновых антител в регуляции функциональной активности углеводного обмена.
Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 - уровень достоверности установленных взаимосвязей.
Как известно, ИЛ-6 также осуществляет регуляцию процессов созревания антителопродуцирующих клеток из В-лимфоцитов и самой продукции иммуноглобулинов [11]. Повышение уровня циркулирующих АТ к инсулину сопровождается увеличением содержания ^Л (г=0,34; р=0,046), АТ к ДКГ с ^М (г=0,33; р=0,040), ^О (г=0,47; р=0,008) и ^Б (г=0,38; р=0,033), АТ к клеткам о.Лангерганса с ^А (г=0,35; р=0,001) и ^Б (г=0,53; р=0,003).
Установлено, что повышение концентрации антител к инсулину сопровождается увеличением уровня ИЛ-10 на 33,21% (с 1,81 (1,10-3,53) пг/мл до 2,71(1,70-5,31) пг/мл; р=0,035), который усиливает дифференцировку и функциональную активность В-лимфоцитов посредством активации 1Ъ2, подавляет синтез про-воспалительных цитокинов. Взаимосвязанная активация синтеза ИЛ-10 аутоантителами направлена на ограничение бесконтрольного развития воспаления и предотвращение повреждения собственных тканей [8]. Данный факт свидетельствует о том, что повышение уровня аутоантител играет защитную роль, связанную с контролем гиперактивации воспаления, и способствует повышению эффективности клиренса органа от продуктов распада отмирающих клеток, тем самым активирует регенераторные процессы, что согласуется с литературными данными [3]. В тоже время любые адаптивные реакции могут перейти в патологические,
если их длительность и/или выраженность выходят за физиологические рамки.
Повышение циркулирующих АТ к инсулину в пределах пороговых значений (5-10 Ед/мл) сопровождается ростом в пределах референтных значений содержания ИЛ-6 на 26,48%(р=0,031), ^О на 19,22% (р=0,030), ^Л на 39,34% (р=0,034) и АТ к ДКГ на 27,27% (р=0,025). Увеличение концентраций АТ к инсулину (более 10 Ед/мл) сопряжено с более значительным повышением (но в пределах референтных значений) уровня ИЛ-6 на 34,69% (р=0,012), а также увеличением провоспалительных цитокинов ИЛ-1р на 39,65% (р=0,023), ФНО-а на 43,37% (р=0,048) и повышением АТ к клеткам островков Лангерганса на 28,57% (р=0,028).
Регуляторная роль аутоантителообразования подтверждается зависимостью от состояния тканевого метаболизма и концентраций поступающих в кровь продуктов обмена. Регистрируемое повышение аутоантител не только отражает степень развивающихся нарушений, но и оказывает протективное действие, направленное на снижение развивающихся дисметаболических нарушений. Повышение уровня гликемии и содержания инсулина у исследуемых женщин сопряжено с повышением циркулирующих АТ к ДКГ, регистрируются положительные связи данных аутоантител с содержанием глюкозы (г=0,44; р=0,002), инсулина (г=0,40; р=0,002). На фоне повышения уровня исследуемых аутоантител также увеличено в крови содержание лактата (г=0,41; р=0,021) и АСТ (г=0,36; р=0,048), что свидетельствует об увеличении уровня ацидоза и отражает степень снижения функциональных резервов печени по утилизации этого метаболита.
Проведенные исследования показали, что уровень секреции инсулина имеет положительную взаимосвязь с содержанием ЛПНП (липопротеидов низкой плотности) (г=0,41; р<0,001) и триглицеридов (ТГ)(г=0,46; р<0,001), что объясняется переходом на повышенный уровень энергообеспечения организма с активизацией липидного обмена, и в первую очередь жирового обмена у жителей севера [5]. Повышение уровня антител к инсулину ассоциировано со снижением уровня общего холестерина (г=-0,30; р=0,010), ЛПНП (г=-0,39; р=0,013), ТГ (г=-0,29; р=0,011). Наблюдаемое снижение уровня общего белка в сыворотке крови (68,75(64,12-70,90) против 72,05(69,20-74,18) г/л; р=0,018) на фоне повышенных концентраций АТ к инсулину, свидетельствует о том, что антителообразование формируется на фоне снижения процессов утилизации глюкозы, обусловленной инсулинре-зистентностью, что ускоряет распад и замедляет синтез белка.
Дополнительный аспект антителообразования непосредственно связан со способностью последних связывать фактор роста нервов (ФРН), создавая депривацию по данному трофическому фактору [9]. Дело в том, что, как было установлено в экспериментах Р.ВогЬош, инсулин-продуцирующие р-клетки экспрессируют рецепторы ФРН и продуцируют сам ФРН, который является аутокринным трофическим фактором для островковых клеток, а его удаление (или антителозависимая инактивация) сопровождается быстрым апоптозом р-клеток [12]. На фоне повышения уровня АТ к клеткам островков Лангерганса, регистрируется снижение уровня инсулина на 44,02% (р=0,039). Выявлены отрицательные ассоциации уровня циркулирующих АТ к клеткам островков Лангерганса с содержанием инсулина (г=-0,43; р=0,032). Увеличение содержания аутоантител отражает нарушения апоптоза р-клеток островков Лангерганса, являясь сигналом для запуска механизмов репарации и коррекции.
Взаимосвязь антителообразования с фагоцитозом подтверждена многочисленными взаимосвязями исследуемых аутоантител с абсолютным и относительным числом нейтрофильных лейкоцитов (г=-0,36; р=0,018), фагоцитарным показателем (г=-0,38; р=0,025), абсолютным и относительным числом моноцитов (г=0,42; р=0,043). Проведенные исследования показали, что наиболее частый признак, сопровождаемый аутосенсибилизацию, является дефицит фагоцитарной защиты за счет снижения активности фагоцитов и количества нейтрофильных лейкоцитов.
Повышение уровня антителообразования сопряжено с активизацией процессов дифференцировки макрофагов с повышение количества молодых форм моноцитов, что обосновано участием их в процессах утилизации антигена аутоантител при выполнении ими транспортной функции.
В условиях снижения механизмов утилизации и выведения ау-тоантигенов посредством фагоцитоза, повышение концентрации аутоантител имеет биологический смысл: происходит более эффективное связывание, утилизация и элиминация антигена из организма.
Выводы.
1. Антителообразование является особым физиологическим механизмом, обеспечивающим защитные функции и метаболические процессы.
2. Специфическое связывание инсулина с аутоантителами предохраняет гормон от преждевременной протеолитической деградации, увеличивает чувствительность клетки к инсулину и пролонгирует его биологическое действие, тем самым стабилизируя уровень глюкозы и нивелируя нарушения метаболических реакций, связанных с активизацией энергетических процессов.
3. Активность антителообразования определяется повышением концентрации аутоантигенов и длительностью сохранения повышенных их концентраций в организме.
4. Функциональная роль аутоантител зависит от концентрации циркулирующих аутоантител и содержания субстрата-вещества, вызвавшего их образование, а также от состояния иммунного фона и эффективности иммунной регуляции.
Динамический проспективный анализ изменений сывороточного содержания аутоантител определяет возможность ранней (донозологической) диагностики сахарного диабета и необходимость разработки новых подходов к лечению на стадии доклинической манифестации заболевания. При оценке клинической и диагностической значимости обнаружения аутоантител необходимо учитывать стойкость и выраженность аутоиммунного ответа. Естественно, что нефизиологический аномально высокий уровень реакций, как и других физиологических процессов и реакций, делает аутоантитела механизмом агрессии.
Литература
1. Бутрова С. А. Ожирение и сахарный диабет: общность этиологии и профилактики / С. А. Бутрова, А. А. Плохая // Сахарный диабет. - 2005. - № 3. - С. 45-50.
2. Григорова О. П. Роль моноцитарной системы в реактивности человека / О. П. Григорова. - М. : Медицина, 1956. - 189 с.
3. Направленное иммунное программирование в раннем онтогенезе и предотвращение формирования сердечно-сосудистой патологии / В. Палински [и др.] // Иммунофизиология. Естественный аутоиммунитет в норме и патологии. - М., 2008. - С. 156-165.
4. Солнцева А. В. Эндокринные механизмы жировой ткани / А. В. Солнцева // Мед. новости. - 2009. - № 3. - С. 7-11.
5. Экологическая зависимость физиологических функций человека / Л. К. Добродеева [и др.]. - Архангельск : Изд-во Ар-ханг. гос. техн. ун-та, 2006. - 299 с.
6. Alarcon-Segovia D. Shared autoimmunity : the time has come / D. Alarcon-Segovia // Curr. Rheumatol. Rep. - 2004. - Vol. 6, N 3. - P. 171-174.
7. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // S. Cand. I. Clin. Lab. Invest. - 1968. - Vol. 21. - P. 97.
8. In the absence of endogenous IL-10, mice acutely infected with Toxoplasma gondii succumb to a lethal immune response dependent on CD4+ T-cells and accompanied by overproduction of IL-12, IFN-gamma and TNF-alpha / R. Gazzinelli [et al.] // J. Immunol. -1996. - Vol. 157. - P. 798-805.
9. Insulin-like growth factor 1 regulates the location, stability, and transcriptional activity of beta-catenin / M. P. Playford [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97, N 22. - P. 1210312108.
10. Interleukin-6-deficient mice develop mature-onset obesity / V. Wallenius [et al.] // Nat. Med. - 2002. - Vol. 8. - P. 75-79.
11. Kishimoto T. Interleukin-6 : discovery of a pleiotropic cytokine / T. Kishimoto // Arthritis Res. Ther. - 2006. - Vol. 8, suppl. 2. - P. 2-14.
12. Molecular and functional characterization of pituitary ade-nylate cyclase - activating polypeptide (PACAP-38)/vasoactive intestinal polypeptide receptors in pancreatic beta-cells and effects of PACAP-38 on components of the insulin secretory system / P. Bor-boni [et al.] // Endocrinology.- 1999.- Vol. 140, N 12.- P. 55305537.
13. Notkins A. L. Autoantibodies as Diagnostic and Predictive Markers of Autoimmune Diseases / A. L. Notkins, A. Lernmark, D. Leslie // Autoimmunity. - 2004. - Vol. 37, N 4. - P. 251-368.
14. Partial leptin deficiency and human adiposity / I. S. Farooqi [et al.] // Nature. - 2001. - Vol. 414. - P. 34-35.
15. The C-peptide as a risk factor of development of type 1 diabetes in the first degree relatives of the autoimmunological diabetic
patients / K. Siewko [et al.] // Endokrynol Pol. - 2009. -Vol. 60, N 5. - P. 357-362.
THE ROLE OF AUTOANTIBODIES IN THE REGULATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF CARBOHYDRATE EXCHANGE AND GLUCOSE METABOLISM SUPPORT
G.T. LYUTFALIEVA Institute of Natural Adaptations, Arkhangelsk
The article highlights the research of substance and functional role of circulating IgG antibodies for insulin (IAA), islets of Langer-ans and glutamine acid decarboxylase in relation substance with of glucose insulin, C-peptide and some immunological blood serum indices in inhabitants of European North blood.
Key words: production of autoantibodies, autoantibodies, regulation of metabolic processes, ecological immunology, physiology.
УДК 612.015
ИНТРОДУКЦИЯ ГИДРОКСИЛЬНЫХ И КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП В МОЛЕКУЛЯРНУЮ СТРУКТУРУ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ТОРФА ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ИХ БИОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ И АДАПТОГЕННОЙ СПОСОБНОСТИ
В.В. ПЛАТОНОВ, Д.Н. ЕЛИСЕЕВ, Р.З. ТРЕЙТЯК, А.Ю. ШВЫКИН, А.А. ХАДАРЦЕВ, А.Г. ХРУПАЧЕВ*
Осуществлена интродукция гидроксильных и карбоксильных групп в макромолекулы гуминовых веществ. Проведено модельное испытание физиологической активности полученных препаратов. В ходе оценки обнаружено заметное возрастание общестимулирующих и адаптоген-ных свойств. Показана перспективность использования данных методов химической модификации для повышения эффективности гуми-новых препаратов, получаемых из природных источников. Ключевые слова: гуминовые кислоты, гидроксилирование, карбок-силирование, физиологическая активность, биостимуляторы.
Гуминовые кислоты (ГК) - природные полимеры нерегулярного строения, являются составной частью объектов природного происхождения (лечебные грязи (ЛГ) илового и сапропелевого типов, торфяные и угольные ископаемые) и обладают достаточно разнообразной биологической активностью. В последнее десятилетие сформировалась необходимость разработки на основе ЛГ таких препаратов, которые, сохраняя высокую терапевтическую активность нативных грязей, освобождены от негативных сторон классической пелоидотерапии. Большинство хорошо известных пелоидопрепаратов (ФиБС, Гумизоль, Торфот и др.) производятся теперь зарубежными фирмами [1].
Так как ГК являются составной частью объектов природного происхождения [2], в настоящее время одним из ведущих направлений развития исследований является изучение физикохи-мических, биохимических аспектов их строения и активности с целью получения новых высокоэффективных пелоидопрепаратов.
Одной из главных проблем на пути разработки теории и практики применения пелоидопрепаратов является недостаточная изученность ГК (как компонентов пелоидов), которые обуславливают их терапевтическую эффективность. С другой стороны, обнаруживаемые в нативных пелоидах антропогенные загрязнители могут быть отсепарированы только в процессе высокотехнологичной переработки при выделении физиологически активных компонентов [1,3].
Предыдущие исследования показывают, что уровень общей физиологической активности зависит от следующих важнейших параметров структуры гуминовых веществ (ГВ): молекулярная масса и количество полярных функциональных групп на периферической части молекул ГВ [4]. В обоих случаях данная зависимость является прямо пропорциональной на всем изученном пределе изменения данных факторов [5,6].
Данный факт свидетельствует о том, что возможно направленное изменение различных параметров структуры ГВ посредством различных приемов их химической модификации. Так, например, при создании гуминовых препаратов с лучшей проницаемостью по отношению к клеточным мембранам, уменьшают их молекулярную массу, производя окислительную деструкцию нативных ГВ [7].
Цель исследования - оценка влияния интродукции поляр-
* Тульский государственный университет, медицинский институт; Тульский государсвтенный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.
ных функциональных групп в структуру исходных ГВ на показатели их физиологической активности.
Материалы и методыисследования. ГК были выделены согласно [8].
Методика карбоксилирования исходных ГК. 5 г исходных ГК было добавлено к 500 мл водного раствора смеси 25 г (0,25моль) КНСО3 и 17,25 г (0,125 моль) К2СО3 (мольное соотношение КНСО3/К2СО3 = 2:1). При этом произошло их полное растворение с образованием раствора черно-коричневого цвета. Его перемешивали в двугорлой колбе на 1 л с механической мешалкой и термометром при постепенном, в течение 1 ч, подъеме температуры (с помощью регулируемого колбонагревателя) до 90°С. При этой температуре началось выделение СО2, вызвавшее нарастающее вспенивание реакционной массы. С целью снижения интенсивности разложения КНСО3, скорость повышения температуры была замедлена до 10°С/ч. Наиболее интенсивное выделение СО2 наблюдалось при 95-97°С. Одновременно при этом имел место быстрый прогрессивный разогрев реакционной смеси (вероятно, из-за теплового эффекта реакции карбоксилиро-вания), сопровождавшийся ее бурным вспениванием и закипанием. Чтобы исключить выброс реакционной смеси из колбы, перемешивание и нагревание иногда приходилось полностью останавливать. После снижения интенсивности выделения СО2 и саморазогревания реакционной массы, ее перемешивание было продолжено при слабом кипении (t ~ 100-103°С) в течение 3 ч. Затем реакционная смесь была охлаждена до комнатной температуры, перелита в стакан объемом 1 л и нейтрализована 6 н HCl до рН ~ 5-6. При этом наблюдалось ее интенсивное вспенивание вследствие выделения СО2 за счет разложения К2СО3 под действием HCl и выделение карбоксилированных ГК (КГК) в виде тонкодисперсного коричневого осадка. Последний был десятикратно декантацией промыт дистиллированной водой, центрифугирован при 8 тыс. об/мин и высушен в вакуум-эксикаторе над CaCl2 до постоянной массы. После растирания в агатовой ступке было получено 4,2519 г препарата КГК в виде мелкодисперсного порошка коричневого цвета.
Методика гидроксилирования ГК. Гидроксилирование исходных ГК было выполнено действием насыщенного раствора K2S2O8 при 15-20°С на щелочной раствор исходных ГК с последующей нейтрализацией реакционной смеси 50% Н3РО4. Последняя была взята вместо HCl, поскольку при избытке K2S2O8 возможно ее окисление с выделением хлора. Навеска 5 г исходных ГК была растворена в 500 мл 1%-ного водного раствора NaOH. Полученный раствор был помещен в трехгорлую колбу на 1 л с механической мешалкой, термометром и капельной воронкой, погруженную в охлаждающую водяную баню. Затем при интенсивном перемешивании к полученному черно-коричневому раствору очень медленно, поддерживая температуру не выше 20°С, через капельную воронку в течение 4 ч был добавлен раствор 5 г (0,0185 моль) K2S2O8 в 150 мл Н2О. При этом наблюдалось незначительное вспенивание реакционной массы вследствие разложения K2S2O8 и выделения кислорода. Цвет раствора постепенно изменился на оранжево-коричневый. По окончании добавления раствора K2S2O8 перемешивание реакционной смеси при указанной температуре продолжали еще в течение 3 ч, после чего она была оставлена на ночь при указанной температуре. Затем реакционная смесь была перелита в химический стакан на 1 л и нейтрализована 50% Н3РО4 до рН ~ 5-6. При этом наблюдалось выделение оранжево-коричневого тонкодисперсного осадка гидро-ксилированных ГК (ГГК). Данная смесь при перемешивании нагревалась на кипящей водяной бане в течение 30 минут, после чего была охлаждена до комнатной температуры. Осадок ГГК был десятикратно декантацией промыт дистиллированной водой, центрифугирован при 8 тыс. об/мин и высушен в вакуум-эксикаторе над CaCl2 до постоянной массы. После растирания в агатовой ступке было получено 2,3723 г препарата ГГК в виде мелкодисперсного порошка оранжево-коричневого цвета.
Изучение химического состава исходных и химически модифицированных ГВ. Молекулярная структура соединений, определяющих состав ГВ была охарактеризована с использованием ИК-Фурье спектроскопии, криоскопии, а также элементного и количественного функционального анализов.
Элементный анализ образцов выполнялся на автоматическом CHN-анализаторе фирмы Carlo Erba, модель 1100 (Италия). Условия: температура в реакторе окисления 1100°С, который заполнен Cr2O3/CuO; газ-носитель - He. Температура в восстановительном
