CC BY
28
Набор реактивов для выявления аутоантител к декарбоксилазе глютаминовой кислоты
УДК 612.017.1:616-097
Надежда Пивень,
завлабораторией медицинского микроанализа Института биоорганической химии НАН Беларуси, доктор медицинских наук, профессор, лауреат Государственной премии Республики Беларусь
Людмила Лухверчик,
ведущий научный сотрудник лаборатории медицинского микроанализа Института биоорганической химии НАН Беларуси, кандидат медицинских наук
Алесь
Бураковский,
старший научный сотрудник лаборатории медицинского микроанализа Института биоорганической химии НАН Беларуси, кандидат биологических наук
Сахарный диабет 1-го типа (инсулинозависимый, СД1) является основной причиной длительной утраты здоровья, ограничений трудоспособности, ранней инвалидности и преждевременной смертности людей во всех странах мира.
Очевидно, что раннее выявление больных СД1 и лиц, предрасположенных к его развитию, проведение своевременных профилактических мероприятий и адекватной терапии может существенно снизить заболеваемость и дать значимый экономический эффект. Однако создание и реализация системы превентивных мероприятий возможны только после детального понимания механизмов развития (патогенеза) данного заболевания и роли молекулярно-генетических основ аутоиммунных нарушений, сопровождающих СД1, с одной стороны, а с другой - разработкой и использованием в медицинской практике для этих целей современных высокочувствительных и адекватных клинико-диагностических методов.
Инсулинозависимый сахарный диабет 1-го типа - хроническое генетически обусловленное аутоиммунное заболевание, патологической основой которого является разрушение ß-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, секретирующих инсулин, что и обусловливает возникновение дефицита инсулина, приводящего к гипергликемии, кетоацидозу и другим метаболическим нарушениям.
У человека идентифицировано около 20 генов, ассоциированных с заболеваемостью СД1, многие из которых (CTLA4, IL2, IL1, IL4, TCRA, TCRB, Ins и т.д.) контролируют функциональное состояние иммунной системы, в частности синтез цитокинов, цепей T-клеточного рецептора лимфоцитов, супрессорных факторов и инсулина. Установлено, что на фоне генетической предрасположенности различные перенесенные вирусные инфекции являются
одним из пусковых факторов СД1. Вирусы (вирус Коксаки B, краснухи, ветряной оспы, эпидемического паротита, кори, цитомега-ловирус и др.) могут оказывать прямой цитолитический эффект на р-клетки поджелудочной железы либо за счет антигенной мимикрии вызывать развитие аутоиммунного процесса, ведущего к деструкции клеток поджелудочной железы [4].
Результаты исследований, проведенных в последние годы, позволяют представить общую схему иммунопатогенеза СД1 (рис. 1). Антигенпрезентирующие (дендритные) клетки (АРС) захватывают аутоантигены (ауто-АГ) поврежденных различными инфекционными (вирусными), токсическими и другими агентами р-клеток и презентируют их CD4+Т-лифоцитам, которые под влиянием интерлейкина 12 (IL-12) дифференцируются в Т-хелперы (Th1), синтезирующие интерферон-гамма (l FNy), активирующий, в свою очередь, макрофаги (МФ). Thl-зависимый механизм с участием МФ, выделяющих активные формы кислорода (О2-, Н2О2), азота (NO) и токсический для островковых клеток IL-1 р, имеющщих рецепторы к нему, играет важную роль в поражении р-клеток поджелудочной железы (рис. 1А). Одновременно АРС представляют аутоантигены CD8+Т-лимфоцитам, которые под влиянием IFNy (продуцируемого Th1) пролиферируют и дифференцируются в аутоспецифические цитотоксические Т-лимфоциты (CD8). Эти CD8- Т-лимфоциты, в свою очередь, вызывают повреждение р-клеток поджелудочной железы путем цитолиза и индукции Fas-опосредованного апоптоза [5].
Наличие большого количества аутоантигенов р-клеток поджелудочной железы обусловливает присутствие у больных СД1 аутоантител (ауто-АТ) различной специфичности, точная патогенетическая роль которых до конца не установлена. Предполагают, что их появление связано с развитием аутоиммунного ответа с участием Т-хелперов 2-го типа (Th2), продуцирующих цитокины -
интерлейкины IL-4 и IL-6, что, в свою очередь, вызывает диффе-ренцировку незрезлых В-лимфоцитов в плазмоциты, синтезирующих аутоантитела различной специфичности (рис. 1В).
Аутоантигены, ассоциированные с СД1. В результате повреждения ткани поджелудочной железы в кровоток попадает ряд антигенных компонентов р-клеток, против которых развивается специфический иммунный ответ в виде продукции аутоантител различной специфичности. Идентифицировано более 10 компонентов р-клеток, являющихся диабет-ассоциированными аутоан-тигенами [6, 7]. К ним относят:
■ инсулин (In) - органоспецифический антиген р-клеток, гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен;
■ тирозинфосфатазно-подобный белок IA-2 (insulinoma-associated antigen or islet antigen-2), (IA-2a/ICA512) - представитель семейства тирозиновых фосфатаз, который экспрессируется в
p-, a-, б-клетках панкреатических островков, клетках гипофиза, мозгового вещества надпочечников, а также в клетках тимуса, селезенки и других нейроэндокринных тканях;
■ фогрин lA-2p (insulinoma-associated antigen or islet antigen-2p) -еще один представитель семейства тирозиновых фосфатаз; помимо р-клеток поджелудочной железы экспрессируется и в мозге;
■ islet cell antigen 69 (ICA 69) - антиген, который кроме р-клеток обнаружен в мозге, сердце, печени, почках; установлено, что ICA представляет собой комплекс из нескольких островковых белков (ICA 512, IA-2a, IA-2P).
В последние годы внимание многих исследователей привлечено к декарбоксилазе глютаминовой кислоты (glutamic acid decarboxylase, GAD) - аутоантигену-мишени, связанному с развитием СД1. GAD (L-глютаматИ-карбоксилиаза, К.Ф.4.1.1.15 в соответствии с официальной Номенклатурой ферментов 1992 IUBMB) участвует в биосинтезе основного медиатора процессов торможения в нейронах головного мозга - Y-аминомасляной кислоты путем декарбоксилирования глютаминовой кислоты. GAD обнаружена в нейронах головного мозга, клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, в мозжечке, сетчатке глаза, спинном мозге, почках, семенниках и яичниках [8].
Кроме вышеперечисленных антигенов выделены и другие, обладающие невысокой степенью специфичности и поэтому, по мнению специалистов, имеющие меньшее значение в патогенезе СД1 (ганглиозид GM 2-1, ICA 69, карбоксипептидаза Н, белок теплового шока HSP 60 и др.), которые выявляются с различной частотой (от 10 до 80%) у лиц с высоким риском СД1 и играют роль индукторов аутоиммунного процесса [9].
Аутоантитела, ассоциированные с СД1. Впервые аутоантитела к антигенам островковых клеток поджелудочной железы (AT-ICA), взаимодействующие с антигенами р-клеток, были описаны более 30 лет назад. AT-ICA являются гетерогенной группой аутоантител к различным аутоантигенам р-клеток, основную часть которых (до 97%) составляют антитела к GAD, IA-2 и инсулину. AT-ICA определяются у 70-90% лиц с впервые диагностированным СД1 при манифестации диабета в возрасте до 15 лет, с увеличением возраста заболевания частота встречаемости ATICA снижается до 60% [9, 10].
Аутоантитела к инсулину (АТ-1п) определяются у 35-60% пациентов с впервые выявленным СД1 до назначения инсулиноте-рапии. После начала ее проведения этот тип АТ свидетельствует скорее о реакции на экзогенно вводимый инсулин, являясь маркером инсулинорезистентности и аллергических реакций. Так же как и АТ-1СА, частота встречаемости АТ-1п выше при манифестации СД1 в детском возрасте и снижается по мере взросления пациентов на момент дебюта СД1 [11, 12].
Антитела к 1А-2 выявляют у 50-85% лиц с вновь диагностированным СД1. Частота их обнаружения максимальная при манифестации СД1 в раннем детском возрасте и снижается с увеличением срока заболевания.
Аутоантитела к декарбоксилазе глютаминовой кислоты (АТ-GAD) присутствуют у большинства страдающих СД1, что свидетельствует об аутоиммунном механизме деструкции островкового аппарата поджелудочной железы. АТ-GAD представляют собой высокоинформативный маркер для идентификации и выявления индивидуумов с высоким риском развития СД1, так как их возникновение в циркуляции по времени может намного опережать клинические проявления болезни, а у людей с вновь диагностированным СД1 они выявляются в 50-80% случаев. Во время асимптоматиче-ского развития диабета АТ-GAD могут детектироваться у пациента за 5-7 лет до клинических проявлений болезни, которые возникают только после гибели не менее 80% инсулинсекретирующих клеток. У лиц без диабета с высокой концентрацией данных аутоантител риск возникновения СД1 составляет от 10 до 45% [12, 13]. Для пациентов с диабетом 2-го типа (инсулинонезависимым) присутствие АТ-GAD может говорить о риске развития аутоиммунных процессов как осложнения. АТ-GAD и другие антитела к островковым клеткам обнаруживаются у 1-2% здоровых лиц, у которых впоследствии не происходит развития СД1 [1].
Следует заметить, что деструкция р-клеток поджелудочной железы, приводящая к недостаточной продукции инсулина и развитию СД1, возникает, по общепринятому мнению, после гибели 80-90% инсулинсекретирующих клеток. При этом полагают, что этот иммунологический процесс является клеточно-опос-редованным, а патогенетическая роль органоспецифических ауто-АТ (к инсулину, глютаматдекарбоксилазе и другим антигенам) почти не рассматривается. К настоящему времени прежние представления об ауто-АТ как о связывающих и блокирующих продукты метаболизма или чужеродные субстанции претерпе-
Рис. 1. Схема клеточного (А) и гуморального (В) механизмов иммунопатогенеза СД1
вают значительные изменения. Продуцируемое в организме на протяжении жизни огромное количество естественных ауто-АТ различной специфичности (по 20-30 тыс. молекул) к антигенам собственного организма позволяет предположить, что ауто-АТ являются нормальными (физиологическими) компонентами организма, сохраняющими практически постоянный состав и участвующими в реализации большинства биологически значимых регуляторных функций. Синтез их программируется экспрессируемыми генами и регулируется уровнем синтеза и распада различных общеорганизменных и тканеспецифических аутоантигенов-мишеней, которые в норме не очень сильно варьируют, что и обусловливает определенное содержание разных видов естественных ауто-АТ у здоровых лиц. В условиях физиологической нормы любые регуляторные молекулы, включая и естественные ауто-АТ, содержатся в организме в определенном количестве. Изменение их концентраций в тканях и кровотоке и длительное сохранение его за пределами физиологического уровня приводит к развитию общеорганизменных патологических нарушений, которые могут проявляться в виде дисрегуля-торных или даже морфологических, структурно выраженных деструктивных патологических процессов (при гиперпродукции ауто-АТ), либо в виде существенно менее изученных нарушений общего гомеостаза организма, связанных с недостатком синтеза и секреции определенных видов физиологических ауто-АТ (гипо-продукция) [12].
Развитие той или иной патологии сопровождается нарушением продукции различных антигенов, что неизбежно приводит к количественным изменениям синтеза антител соответствующей специфичности и повышению их концентрации в кровотоке. При этом динамика нарастания титров ауто-АТ (к инсулину, глюта-матдекарбоксилазе, проинсулину и др.) прямо коррелирует со скоростью перехода заболевания в стадию клинической манифестации. Избыток ауто-АТ к антигенам поджелудочной железы влияет на аутоагрессию цитотоксических клеток - тканевых макрофагов и Nk-клеток (натуральных киллеров), имеющих высокоаффинные рецепторы ^с RI и Fc RШ) для взаимодействия и связывания антител класса G.
В связи с этим многие исследователи высказывают мнение об обязательной связи развития СД1 с сочетанным нарушением как клеточного, так и гуморального иммунитета. При этом почти у 50% пациентов оно происходит без предшествующей лимфоци-тарной инфильтрации - инсулита, который ранее рассматривали как обязательный процесс, предшествующий манифестации СД1. Это позволило полагать, что инсулиты и развитие СД1 могут быть мало связанными между собой процессами [12].
С учетом современных представлений иммунопатогенез СД1 можно представить следующим образом. На ранних стадиях заболевания при сочетании эндогенных (генетически обусловленных) и экзогенных (например, инфекционных) причин происходят нарушения в иммунорегуляторных механизмах в виде активации «антипанкреатического» хелперного звена или ингибирования соответствующего супрессорного звена, результатом чего будет повышение избыточной продукции ауто-АТ к одному или нескольким антигенам р-клеток поджелудочной железы. Ауто-АТ инициируют
аутодеструктивные процессы в инсулинпродуцирующих клетках, результатом которых является их уничтожение макрофагами и NK-клетками. Антителозависимый процесс разрушения р-клеток может быть не очень активным и длительно (годами) оставаться функционально скомпенсированным. Цитотоксические специфические Т-лимфоциты вовлекаются в аутодеструкцию на более поздних этапах, и тогда вялотекущий процесс получает ускорение, что завершается разрушением р-клеток, то есть деструкцией большей части инсулинсекретирующих клеток. В результате этих событий заболевание СД1 переходит из скрытой (функционально компенсированной) формы в декомпенсированную, то есть в стадию клинической манифестации болезни [12, 14].
Таким образом, ауто-АТ к антигенам поджелудочной железы нельзя рассматривать лишь в качестве пассивных «свидетелей» панкреодеструктивных процессов. Их аномально высокий уровень - один из главных составляющих патогенетических механизмов, ведущих в конечном итоге к развитию сахарного диабета и его осложнений.
Поэтому изменение уровня ауто-АТ в сыворотке крови, по современным воззрениям, важный диагностический и прогностический признак развития СД1, связанный с верификацией аутоиммунного генеза заболевания, который может служить маркером для раннего выявления лиц с повышенным риском возникновения СД1 и его диагностики на доклинических стадиях.
Принципиальные подходы к разработке метода имму-ноферментного анализа аутоантител к GAD. Для решения задач, связанных с необходимостью изучения молекулярно-ге-нетических механизмов и закономерностей течения СД1 (именно они могут служить основой для разработки новых принципов диагностики, профилактики и лечения этого заболевания), необходимы новые высокочувствительные, специфичные и информативные методы идентификации и количественной детекции различных типов аутоантител, основанные на достижениях современной иммунобиотехнологии, позволяющие не только обнаруживать аутоиммунные нарушения на доклинической стадии и тем самым своевременно предотвращать развитие недуга у детей и взрослых, диагностировать СД1 с высоким уровнем чувствительности и точности, но и контролировать эффективность и целесообразность проводимых терапевтических мероприятий, развитие инсулинорезистентности и прогнозировать течение заболевания и возникновение его осложнений.
В зарубежных странах используются коммерческие наборы реактивов для анализа различных типов циркулирующих аутоантител, в том числе AT-GAD. Аналоги этих наборов отсутствуют в Беларуси и странах СНГ Стоимость же зарубежных диагно-стикумов («Immunotech», Франция; «Orgentec», Германия; «BCM Diagnostic», США; «Dialab», Австрия) колеблется от 500 до 1000 долл., что ограничивает их широкое применение в отечественной медицинской практике и делает актуальной проблему создания диагностических наборов белорусского производства.
В лаборатории медицинского микроанализа Института биоорганической химии НАН Беларуси в соответствии с заданием Государственной программы ориентированных фундаментальных исследований «Физиологически активные вещества» были раз-
работаны научные основы нового высокочувствительного, специфичного и информативного метода иммуноферментного анализа концентрации аутоантител к декарбоксилазе глютаминовой кислоты в сыворотке крови. С помощью лабораторного варианта тест-системы проведена оценка клинико-диагностической значимости аутоантител к декарбоксилазе глютаминовой кислоты на клиническом материале (при поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований). Полученные результаты легли в основу разработки и освоения технологии производства отечественного набора реактивов для иммуноферментного анализа аутоантител к декарбоксилазе глютаминовой кислоты в рамках задания Государственной программы по развитию импортозамещающих производств фармацевтических субстанций, готовых лекарственных и диагностических средств в Республике Беларусь на 2010-2014 гг. и на период до 2020 г.
Результатом проведенных исследований явилась разработка отечественного набора реактивов для определения концентрации AT-GAD (ИФА-АТ-GAD) в формате непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (inderect ELISA - enzyme-liked immunosorbent assay) [15].
Принцип метода (рис. 2): анализируемые аутоантитела к GAD (AT-GAD), находящиеся в сыворотке крови пациента (3), связываются с антигеном GAD (1), предварительно иммобилизованным на внутренней поверхности лунок полистиролового планшета для ИФА (2), с образованием иммунокомплекса. Несвя-завшиеся компоненты удаляются путем промывания. На втором этапе к образовавшемуся иммунокомплексу «антиген - антитело» добавляют меченные ферментом (пероксидазой хрена) антивидовые поликлональные антитела, специфичные к IgG человека (4). Индикатором в этом тесте является хромогенный субстрат фермента пероксидазы - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин - ТМБ (5). Добавлением стоп-раствора (4,8% раствор H2SO4) останавливают развитие цветной реакции и спектрофотометрически измеряют ее интенсивность, которая прямо пропорциональна концентрации исследуемых аутоантител в образце.
Изучены основные аналитические характеристики разработанной тест-системы:
■ специфичность (кросс-реактивность GAD65 со структурно-родственными аналогами АТ-GAD - антинуклеарными антителами, ревматоидным фактором и аутоантителами к тиреоперокси-дазе) - менее 1%;
■ чувствительность (минимальная определяемая концентрация АТ^) - 0,11 МЕ/мл;
■ воспроизводимость - 99-100%;
■ коэффициент вариации результатов определений АТ-GAD в образцах сывороток крови - не выше 7%;
■ «тест на открытие» различных известных концентраций АТ-ДГК - 99-105%;
■ диапазон определяемых концентраций AТ-GAD - 0,11-4 МЕ/мл.
Время анализа составляет 2 часа 30 минут.
Разработанный метод иммуноферментного анализа АТ-GAD был апробирован на образцах сыворотки крови больных СД1 с различной степенью выраженности аутоиммунного синдрома, при этом маркером степени поражения инсулинсекре-тирующих клеток поджелудочной железы служила предварительно изученная нами концентрация аутоантител к инсулину (АТ-1п) у этих больных методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы DRG (Германия). У всех обследованных пациентов концентрация АТ-1п была выше нормы (0,95 Ед/мл) и колебалась от 1,15 до 8,50 МЕ/мл. На основе полученных значений было сформировано 3 группы: 1-я - лица, имеющие низкий уровень АТ-1п (1,15-1,85 МЕ/мл); 2-я - средний (2,20-2,80 МЕ/мл); 3-я - высокий (3,5-8,5 МЕ/мл), в которых затем была изучена концентрация АТ-GAD разработанным нами методом «ИФА-АТ-GAD». Значения концентраций АТ-GAD в обследуемых группах больных СД1 с различной степенью поражения инсулинсекретирующих клеток поджелудочной железы представлены на рис. 3. При содержании АТ-GAD в крови выше 1,050 МЕ/мл результат считали положительным, а ниже 1,0 МЕ/мл - отрицательным.
Как видно из рис. 3, у всех пациентов с СД1 наблюдалось повышение концентрации АТ-GAD в крови по сравнению со здоровыми лицами (М ± т - 0,64 ± 0,19 МЕ/мл). При этом обнаружена
Группа 1 - содержание антиинсулиновых антител 1,15-1,85 Ед/мл; группа 2 - содержание антиинсулиновых антител 2,20-2,80 Ед/мл;
группа 3 - содержание антиинсулиновых антител 3,5-8,5 Ед/мл.
Вверху приведены полученные значения концентраций ДТ^О в исследуемых группах
Рис. 3. Концентрация АТ-ОАР в сыворотке крови здоровых лиц и у пациентов на различных стадиях СД1 (М ± т):
Рис. 2. Схема непрямого твердофазного ИФА для определения AT-GAD
зависимость концентраций АТ-GAD от степени выраженности аутоиммунного синдрома: средний уровень АТ-GAD в группе 1 составил 1,46 ± 0,23 МЕ/мл; в группе 2 - 1,6 ± 0,22 МЕ/мл; в группе 3 - 1,8 ± 0,21 МЕ/мл; то есть уровень антител к GAD у 95% пациентов с СД 1 был выше порогового значения (1,050 МЕ/мл), что свидетельствует об аутоиммунной интервенции, сопровождающей развитие СД1 на различных стадиях аутоиммунного процесса. Изученная концентрация АТ-GAD у здоровых лиц составила 0,64 ± 0,2 Ед/мл. При этом у 90% из них результат определения АТ-GAD был отрицательным (ниже 1 Ед/мл), а у 10% - положительным (выше 1,050 Ед/мл), что согласуется с результатами, полученными другими авторами [6]. Таким образом, проведенные исследования подтвердили пригодность разработанного метода для количественного анализа АТ-GAD в сыворотке крови.
Особую значимость представляет возможность определения уровня АТ-GAD на начальных стадиях развития диабета, когда проявления клинической симптоматики практически отсутствуют, так как именно в этот период обнаружение АТ-GAD позволяет оценить риск развития СД1, диагностировать начальные стадии деструкции инсулинпродуцирующих клеток поджелудочной железы и СД1 и тем самым обосновывает необходимость применения соответствующих лечебно-профилактических мероприятий.
Значения концентрации АТ-GAD в крови, определенные с помощью нового разработанного высокочувствительного метода иммуноферментного анализа, являются информативными клинико-диагностическими и патогенетическими маркерами СД1, что предоставляет исследователям возможность использования точного количественного критерия (значение концентрации АТ-GAD) для диагностики СД1 на ранних стадиях развития деструктивных процессов поджелудочной железы в организме, оценки степени выраженности патологического процесса, контроля эффективности проводимой терапии и прогнозирования течения заболевания.
Внедрение в медицинскую практику отечественного набора реактивов для иммуноферментного анализа аутоантител к декар-боксилазе глютаминовой кислоты позволит:
■ с высокой точностью и специфичностью обнаруживать наличие даже следовых количеств АТ-GAD и тем самым диагностировать начальные доклинические стадии поражения поджелудочной железы и СД1 типа;
■ предоставить исследователям точный количественный критерий для оценки и контроля степени выраженности патологического процесса, эффективности проводимой терапии и прогнозирования развития болезни;
■ дифференцировать диабет 1-го и 2-го типов;
■ проводить скрининг родственников (недиабетиков) - потенциальных доноров для трансплантации;
■ выявлять группы риска в отношении СД1 среди лиц детского и подросткового возраста, что имеет большое социальное значение;
■ проводить скрининг женщин с гестационным диабетом с целью оценки риска патологии беременности;
■ использовать в педиатрической диабетологии при выборе адекватной терапии для детей, больных диабетом;
■ обеспечить отечественное здравоохранение современными наборами реактивов для иммуноферментного анализа аутоантител к gAd - прогностическому маркеру СД1 в требуемых объемах и тем самым устранить зависимость от импорта дорогостоящих иммунодиагностикумов. ■
Summary
The data about glutamic acid decarboxylase autoantibodies - highly informative clinical and diagnostic marker of insulin-dependent diabetes mellitus, the presence of which in the blood could be revealed months and years before the appearance of the first clinical symptoms of the disease are presented in the article. A new enzyme-linked immunosorbent assay and science methodology of its use in medical practice have been elaborated. The use of glutamic acid decarboxylase autoantibodies concentration as quantitative clinical-diagnostics, pathogenetic and prognostic criterion of autoimmune aggression in both adults and children suffering from type I diabetes has been validated. The developed technology will be used as a basis for industrial production of local diagnostic kit reagents for glutamic acid decarboxylase autoantibodies enzyme-linked immunosorbent assay.
Литература
1. Мохорт Т.В. Сахарный диабет 1 типа: эпидемиология, основы этиопатогенеза и профилактики. - Мн., 2004. С. 6-50.
2. Гусакова Н. С диабетом можно жить полноценно // Наука и инновации. 2011, №5(99). С. 5-6.
3. Данилова Л.И. Аутоантитела к глютаматгидрогеназе и инсулину у больных с различной длительностью инсулинозависимого сахарного диабета // Мед. новости. 1999, №1-2. С. 27-31.
4. Yoon J.-W., Jun H.-S. Autoimmune destruction of pancreatic beta cells // Am. J. Ther. 2005, №12(6). P. 580-91.
5. Хаитов Р.М., Ярилин А.А., Пинегин Б.В. Иммунология: атлас. - М., 2011.
6. Gilliam L.K., Palmer J.P., Lernmark А. Autoantibodies and the disease process of type 1 diabetes mellitus. In Diabetes Mellitus: A Fundamental and Clinical Text. Philadelphia: Lippincott, 2004. P. 499-518.
7. Achenbach P., Bonifacio E., Koczwara K., Ziegler A.-C. Natural history of type 1 diabetes // Diabetes. 2005. №54. Suppl. 2. P. 25-31.
8. Buzzetti R., Di Pietro S., Giaccari A. et al. High titer of autoantibodies to GAD identifies a specific phenotype of adult-onset autoimmune diabetes // Diabetes Care. 2007. № 30(4). P. 932-938.
9. Winter W.E., Harris N., Schatz D. Type 1 diabetes islet autoantibody markers // Diabetes Technol. Ther. 2002. №4(6). P. 817-839.
10. Pihoker C., Gillian L.K., Hampe C.S., Lernmark A. Autoantibodies in diabetes // Diabetes. 2005. №54. Suppl. 2. P. 52-61.
11. Пивень Н.В., Гончарик А.В., Шкуматова Г.А. Радиоиммунологическая тест-система для определения противоинсулиновых антител // Мед. радиология и рад. безопасность. 1998. Т. 3. №4. С. 37-40.
12. Полетаев А.Б. Физиологическая иммунология (естественные аутоантитела и проблемы наномедицины). - М., 2010.
13. Пивень Н.В., Орлова Е.Е. Аутоантитела к декарбоксилазе глютаминовой кислоты как маркер развития сахарного диабета // Сборник науч. трудов «Биорегуляторы: исследование и применение», под ред. академика Ф.А. Лахвича. Вып. 2. - Мн., 2008. С. 78-83.
14. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М., 2002.
15. Пивень Н.В., Лухверчик Л.Н., Бураковский А.И., Карпович М.В., Полегенькая Н.В. Аутоантитела к декарбоксилазе глютаминовой кислоты как патогенетический маркер сахарного диабета 1 типа // Медицинская иммунология. 2010. Т. 5(1). С. 243-254.
