CC BY
170
Медицинская иммунология 2000, Т 2, № 1, стр 35-42 © 2000, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
РОЛЬ АПОПТОЗА И АНЕРГИИ Т-КЛЕТОК В ПАТОГЕНЕЗЕ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тюрин И.Н., Останин А.А., Черных Е.Р.
Институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
Резюме. В последние годы показано, что развитие гнойно-септических процессов у экспериментальных животных и человека сопряжено с индукцией апоптоза и анергии клеток иммунной системы. Тем не менее, роль (положительная или отрицательная) апоптоза и анергии Т-лимфоцитов в патогенезе бактериальной инфекции остается неясной. В настоящей работе проведен клинико-иммунологический анализ апоптоза и анергии Т-клеток у больных с различным течением и исходом гнойной хирургической инфекции. В результате показано, что тяжесть общего состояния прямо коррелирует с уровнем активационного апоптоза Т-клеток, а также сопряжена с апоптозом свежевыделенных лимфоцитов и анергией Т-лимфоцитов. Повышенный апоптоз активированных Т-клеток на раннем этапе гнойно-септического процесса регистрируется как у пациентов с благоприятным, так и летальным исходом, отражая, по-видимому, универсальный механизм ограничения воспалительной реакции. Действительно, у пациентов с высоким уровнем лейкоцитоза (гиперергический характер системной воспалительной реакции) выраженность активационного апоптоза Т-клеток значимо ниже, чем у пациентов с умеренным лейкоцитозом. На позднем этапе течения инфекции апоптоз активированных Т-клеток становится неблагоприятным фактором, поскольку уровень активационного апоптоза у больных с летальным исходом в 2 раза выше, чем у выживших пациентов. Развитие анергии Т-клеток, как на раннем, так и на позднем этапе, ассоциируется с неблагоприятным исходом гнойносептических заболеваний. Снижение чувствительности Т-клеток к активационному апоптозу и выведение их из состояния анергии в процессе экстракорпоральной иммунотерапии с использованием рекомбинантного интерлейкина-2 Ронколейкин на поздних этапах течения гнойно-септического процесса позволяет повлиять на исход заболевания и снизить летальность с 29% до 13 %.
Ключевые слова: апоптоз, анергия, Т-лимфоциты, гнойно-септические заболевания
Norkin M.N., Leplina O.Y., Tikhonova M.A., Tyurin I.N., Ostanin A.A., Chernykh H.R.
THE ROLE OF T CELL APOPTOSIS AND ANERGY IN PATHOGENESIS OF PURULENT SURGICAL INFECTIONS
Abstract. Based on previous studies, purulent surgical infection in human and clinically relevant experimental models of sepsis has been demonstrated to be associated with cell anergy and apoptosis in immune system. Nevertheless potential beneficial or adverse effects of T cell apoptosis and anergy on bacterial infection pathogenesis are still unknown. The present experiments were performed to determine the relation of T cell apoptosis and anergy to infection course and outcome. It was shown that the severity of illness directly correlated with T cell activation-induced death and associated with apoptosis of fresh isolated lymphocytes as well as T cell anergy. Accelerated T cell apoptosis in the early stage of infection was revealed both in survivors and nonsurvivors, thus reflecting common pathway of systemic inflammation response limitation. In fact, T cell activation apoptosis in patients with high leukocytosis (hyperinflammation) was significantly less pronounced, compare to with patients with moderate leukocytosis. In the late stage of infection activation-induced T-cell death appeared to become detrimental, since was 2-fold higher comparing to survived patients. T cell anergy both in the early and late stages of infectious course was associated with unfavorable outcome of surgical infections. Reduction of T cell sensitivity to activation-induced apoptosis as well as anergy correction due to extracorporal immunotherapy with recombinant IL-2 Roncoleukin could influence infection outcome and reduce mortality rate from 29% to 13%. (Med. Immunol., 2000, vol. 2, M1, pp 35-42)
Адрес для переписки: Черных Елена Рэмовна
6300091, Новосибирск, Ядринцевская ул., 14, ИКИ СО РАМН,
Тел. (3832)-28-21-01; Факс. (3832)-22-70-28; E-mail: ctlab @ drbit.ru
Введение
В последние годы появилось достаточное количество убедительных фактов, свидетельствующих о сопряженности бактериального сепсиса с выраженным апоптозом и анергией клеток иммунной системы. Повышенный апоптоз в различных экспериментальных моделях сепсиса у животных и человека регистрируется в тимусе и костном мозге, лимфоидных клетках слизистой кишечника и селезенки [6,
19, 18]. Феномен усиления апоптоза и развитие анергии зрелых периферических Т-клеток нами также выявлены у хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями (при так называемой гнойной хирургической инфекции) [2, 4].
Повышенный апоптоз и анергия, как проявления негативного исхода активации клеток иммунной системы выявляются в подавляющем большинстве случаев, что свидетельствует об универсальности механизмов негативного ответа в патогенезе гнойно-септической патологии. Тем не менее, интерпретация роли апоптоза и анергии лимфоидных клеток остается неоднозначной. Поскольку патогенез гнойно-септических заболеваний связан с развитием системной воспалительной реакции, анергия и апоп-тоз могут рассматриваться в качестве важного механизма ограничения системной воспалительной реакции за счет элиминации клеток, продуцирующих провоспалительные цитокины, и в этом случае носят позитивный характер [11, 8]. С другой стороны, анергия и апоптоз иммунокомпетентных клеток могут выступать в качестве негативного фактора, способствуя развитию иммунодепрессии и, соответственно, подавлению защитной реакции организма на внедрение патогена [7, 12].
В настоящей работе предпринята попытка выяснения возможной роли апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний на основании ретроспективного анализа клинико-иммунологических сопоставлений между проявлениями негативного ответа Т-клеток и характером течения и исходом хирургической инфекции.
Материалы и методы
Характеристика больных
В исследование были включены 25 здоровых доноров и 79 больных, оперированных по поводу острых гнойно-воспалительных заболеваний органов брюшной полости и гнойной инфекции мягких тканей. Тяжелые и генерализованные формы хирургической инфекции регистрировались у 84% больных, в том числе хирургический сепсис - у 35,5% больных. Оценка тяжести состояния (ОТС) проводилась по модифицированной шкале APACHE II [3]. В соответствии с балльной оценкой были выделены 3 группы больных - с тяжестью состояния, соответствующему 11-15 баллам (1 группа), 16-20 баллам
(2 группа) и более 20 баллам (3 группа). При значениях ОТС менее 11 баллов прогнозируемая летальность составляла 0%, при значениях более 20 баллов - 100%.
Выделение и культивирование лимфоцитов
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови стандартно в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации 1,0 х 105/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров АВ(^) группы. Для стимуляции клеток использовали конканавалин A (ConA, 15 мкг/ мл, Sigma), моноклональные анти-CD3 антитела (CD3^A^ 1 мкг/мл, “Медбиоспектр”, г. Москва), стафилококковый энтеротоксин В (SEB, 200 нг/мл, Sigma). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/ лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования.
Оценка апоптоза
Процентное содержание апоптотических клеток определяли на проточном цитофлюориметре (FACS, Becton Dickinson). Клетки инкубировали в течение
1 часа с флюоресцеин диацетатом (FDA, 0,2 мкг/мл), после чего добавляли пропидиум иодид (PI, 4 мкг/ мл). Живые клетки, за счет превращения внутриклеточными эстеразами FDA во флюоресцирующий зеленым флюоресцеин, характеризовались как FDA+,PI-. Мертвые клетки, за счет внутриклеточного проникновения PI с последующим связыванием с ДНК или РНК и формированием комплекса с красным флюоресцентным окрашиванием, характеризовались как FDA-,PI+. Клетки в состоянии апоптоза, сохраняющие структурность мембраны, но не гидролизующие FDA, оставались соответственно FDA-, PI- [16].
Статистический анализ
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы “Statistica 4.3”.
Результаты исследования
Исследование апоптоза в культурах МНК в группе из 79 пациентов с различными формами гнойносептических заболеваний выявило существенно повышенный уровень активационного апоптоза периферических Т-клеток по сравнению со здоровыми донорами (рис.1). Усиление гибели клеток отмечалось при активации Т-лимфоцитов как по классическому пути через Т-клеточный рецептор анти-CD3-антителами, так и по альтернативному пути -
Рис. 1. Показатели апоптоза лимфоцитов в культурах МНК здоровых доноров и больных с гнойно-септическими заболеваниями.
Процентное содержание апоптотических клеток определяли методом проточной цитометрии среди свежевыделенных лимфоцитов (1), в 24часовых культурах нестимулированных МНК (2) и культурах, стимулированных СБ3-мАТ (3) или ConA (4). * - pU < 0.01, достоверность различий значений по сравнению с соответствующими показателями апоптоза в группе здоровых доноров. U - критерий Вилкоксона-Ман-на-Уитни.
при стимуляции конканавалином А. Показатели апоптоза в стимулированных культурах больных значимо превышали уровень апоптоза в культурах нестимулированных МНК (PU < 0,05), что указывало на активационно-индуцированную форму гибели Т-лимфоцитов. Характерно, что повышенное содержание апоптотических клеток выявлялось также среди свежевыделенных МНК, что могло свидетельствовать о реализации программы апоптоза лимфоцитов in vivo.
Т-лимфоциты больных характеризовались не только повышенной готовностью к активационному апоптозу, но и сниженным пролиферативным ответом при стимуляции через Т-клеточный рецептор, что свидетельствовало о развитии состояния анергии Т-лимфоцитов при хирургической инфекции. Так, наиболее выраженное угнетение пролиферации МНК в ответ на CD3^AT или SEB (т.е. пролиферативный ответ выходящий за нижнюю границу диапазона нормативных значений - менее 12.500 имп/ мин при стимуляции CD3^AT и менее 16.500 имп/ мин при стимуляции SEB) было выявлено у 59% и 66% больных соответственно.
Важно отметить, что течение хирургической инфекции характеризуется чрезвычайной клинической разнородностью, которая определяется распространенностью гнойно-воспалительного процесса, продолжительностью течения инфекции, выраженностью эндотоксикоза, а также типом реагирования организма (нормо- гипер- или гипоергическим). Одним из объективных интегральных показателей, отражающих характер течения инфекции, является балльная оценка тяжести состояния пациента. Поэтому на первом этапе работы были исследованы по-
казатели активационного апоптоза и уровень пролиферации Т-клеток в трех группах больных, характеризуемых различной степенью тяжести общего состояния. Первую группу составили пациенты с тяжестью состояния от 11 до 14 баллов по шкале ОТС (соответствует легкой и средней степени тяжести). Этагруппа включала 11 пациентов с локальными формами инфекции. Вторую группу составили 48 пациентов с тяжестью состояния 16-20 баллов (соответствует тяжелому состоянию). Указанная группа включала 26 пациентов с распространенными формами инфекции (разлитой гнойный перитонит, осложненные формы панкреонекроза, обширные флегмоны) и 22 пациента с генерализованными формами инфекции (сепсис). Третью группу составили 18 пациентов с крайней тяжестью общего состояния (более 20 баллов по шкале ОТС). Последняя группа была представлена пациентами реанимационного профиля с осложненным течением распространенных (12 человек) и генерализованных (6 человек) форм инфекции. Показатели апоптоза лимфоцитов в исследуемых группах представлены в таблице 1.
Видно, что процентное содержание апоптотичес-ких клеток при стимуляции МНК CD3-мАТ у больных 2 группы было достоверно выше, чем у пациентов 1 группы, а у больных 3 группы - выше, чем во 2 группе. В итоге показатели апоптоза активированных Т-лимфоцитов у больных 1, 2 и 3 групп превышали аналогичный показатель у здоровых доноров в 1,8, 3,0 и 4,1 раза соответственно. Различия в уровне апоптоза нестимулированных МНК были менее выражены. Процентное содержание апоптотических клеток в культурах нестимулированных МНК у больных 1 и 2 групп было схожим и умеренно возрастало у пациентов 3 группы. Показатели апоптоза в популяции свежевыделенных лимфоцитов у больных 2 группы лишь незначительно превышали аналогичный параметр у пациентов 1-й группы и резко возрастали у пациентов 3-ей группы. Анализ частоты встречаемости пациентов с высоким уровнем апоптоза выявил аналогичную сопряженность между выраженностью активационного апоптоза и тяжестью состояния. Так, если у пациентов 1 группы высокий уровень апоптоза при стимуляции CD3-мАТ (более 40%) не регистрировался вообще, то у больных 2 группы - выявлялся в 31% случаев, а у пациентов 3 группы - в 50% случаев. Частота встречаемости высокого уровня апоптоза свежевыделенных лимфоцитов значимо различалась только между пациентами 1 и 3 групп. Пациенты с высоким уровнем апоптоза в нестимулированных культурах МНК встречались приблизительно с одинаковой частотой. Таким образом, наиболее четко с тяжестью состояния были сопряжены показатели активационного апоптоза. Это подтверждалось также данными корреляционного анализа. Степень тяжести общего
Таблица 1. ПОКАЗАТЕЛИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ В КУЛЬТУРАХ МНК У БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ ТЯЖЕСТИ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ
Тест-культуры Показатели апоптоза
Группа 1 Группа 2 Группа 3
Свежевыделенные МНК 12,3 ± 2,4 16,8 ± 1,6 31,5 ± 5,3*#
9% (1/11) 21% (10/48) 50% (9/18)**
Среда 18,9 ± 2,8 21,1 ± 1,5 27,0 ± 4,6*
36% (4/11) 32% (15/46) 38% (7/18)
CD3-мАТ 17,3 ± 2,5 28,4 ± 2,3* 38,5 ± 3,8*#
0% (0/11) 31% (13/42)* 50% (9/18)*
Примечание: процентное содержание апоптотических лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии среди свежевыделенных МНК, в 24-часовых культурах МНК нестимулированных (среда) и стимулированных анти^З-антителами (СйЗ-мАТ). Данные представлены в виде М ± т. Показана также частота встречаемости (процент и количество случаев) пациентов с высоким (более 25%) уровнем апоптоза среди свежевыделенных и нестимулированных МНК, и высоким (более 40%) уровнем активационного апоптоза в культурах CD3-мАТ-стимулированных МНК.
* - достоверность различий значений (ри < 0,05) и частоты встречаемости (рТМф < 0,05) в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1;
# - ри < 0,05, достоверность различий значений апоптоза у больных группы 2 и 3.
состояния достоверно коррелировала только с уровнем активационного апоптоза (г = 0,4 p<0,05), в то время как с показателями апоптоза в культурах не-стимулированных МНК и среди свежевыделенных лимфоцитов такой связи не выявлялось.
Оценка пролиферативной активности в культурах МНК, стимулированных CD3^AT и SEB (табл. 2), показала различия пролиферативного ответа Т-лимфоцитов в исследуемых группах пациентов. Однако достоверной корреляционной взаимосвязи между тяжестью общего состояния больных и уровнем ответа на CD3^AT (г = 0,2 p>0,05) или SEB (г = 0,1 p>0,05) выявлено не было. Тем не менее, пролиферация МНК в CD3-мАТ-сти-мулированных культурах у больных 3 группы была достоверно ниже, чем у пациентов 1 группы. Схожая тенденция выявлялась при анализе SEB-стимулиро-ванного ответа. Нарастание степени тяжести общего состояния сопровождалось не только снижением средних показателей пролиферативной активности Т-лимфоцитов, но и увеличением частоты развития анергии Т-клеток. Так, состояние полной ареактив-ности Т-клеток, при которой их пролиферативная активность в CD3^AT или SEB стимулированных культурах не превышала верхней границы спонтанной пролиферации (< 5.300 имп/мин), у больных 2 и 3 групп отмечалось достоверно чаще, чем у пациентов 1 группы.
Чтобы оценить возможную роль негативного ответа Т-клеток в патогенезе хирургической инфекции, мы провели ретроспективный анализ выраженности апоптоза и проявлений анергии Т-лимфоцитов в группе выживших и умерших пациентов. В исследование вошли 58 пациентов с тяжелыми и генерализованными формами инфекции. Учитывая, что развитие системной воспалительной реакции и им-
мунного ответа имеет фазный характер, анализ исследуемых параметров проводился отдельно в группе пациентов с давностью инфекционно-воспалительного процесса до 7 суток (ранний период, n=37) и свыше 7 суток (поздний период, n=21).
Как следует из данных таблицы 3, в раннем периоде показатели активационного апоптоза Т-кле-ток при стимуляции через Т-клеточный рецептор (CD3^AT, SEB), а также содержание апоптотичес-
Таблица 2. ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ Т-КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ ТЯЖЕСТИ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ
Стимул Показатели пролиферации
Группа 1 Группа 2 Группа3
Среда 1.751 ± 180 1.484 ± 145 1.904 ± 386
CD3-мАТ 18.234 ± 3.863 36% (4/11) 15.331 ± 2.293 53% (23/43) 8.247 ± 1.660*# 77% (14/18)*
SEB 18.971 ± 2.703 21% (3/14) 16.646 ± 2.813 77% (20/26)* 12.979 ± 3.352 84% (11/13)*
Примечание: интенсивность пролиферации (имп/мин) оценивали радиометрически в 72-часовых культурах МНК нестимулированных (среда) и стимулированных анти^З-антителами (CD3-мАТ) или стафилококковым энтеротоксином В (SEB). Данные представлены в виде M ± m. Показана также частота встречаемости (процент и количество случаев) пациентов с полной аре-активностью Т-лимфоцитов.
* - достоверность различий значений (ри < 0,05) и частоты встречаемости (рТМф < 0,05) в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1;
# - ри < 0,05, достоверность различий значений пролиферативного ответа у больных группы 2 и 3.
ких клеток среди свежевыделенных лимфоцитов были повышены в равной степени в группах выживших пациентов и больных с летальным исходом. В то же время пролиферативный ответ Т-клеток на стимуляцию CD3-мАТ в группе умерших пациентов был в 4 раза ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом. Состояние полной ареактивности Т-клеток (пролиферативный ответ ниже 5.300 имп/ мин) в группе умерших больных выявлялось значительно чаще, чем у больных с благоприятным исходом (70% vs 17%, рТМф = 0,009). Ответ на SEB в группе пациентов с летальным исходом был относительно сохранен и не отличался от уровня SEB-индуцирован-ной пролиферации у выживших пациентов.
На позднем этапе течения инфекции (табл. 3) больные с летальным исходом отличались от группы выживших пациентов более высоким уровнем апоптоза в культурах МНК, стимулированных CD3-мАТ или SEB. Так, уровень активационного апоп-тоза в группе умерших больных был практически в
2 раза выше показателей апоптоза у больных с благоприятным исходом. Различия в содержании апоп-тотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов и в нестимулированных культурах МНК не были столь выражены и статистически не различались. Пролиферативный ответ Т-клеток был снижен в обеих исследуемых группах. При этом более выраженное угнетение пролиферативного ответа Т-кле-ток в группе умерших пациентов выявлялось при стимуляции как CD3-мАТ, так и SEB, однако достоверные различия регистрировались только в SEB-стимулированных культурах. Состояние полной ареактивности Т-клеток при стимуляции CD3-мАТ и SEB регистрировалось у больных с летальным исходом - в 80% и 100 %, в то время как у выживших пациентов - только в 31% и 20 % случаев соответственно (достоверность различий для CD3-мАТ -ответа рТМФ = 0,08; для SEB-ответа рТМФ = 0,04).
Полученные данные позволяют предположить важную роль апоптоза и анергии Т-клеток в предопределении характера течения инфекции. Поскольку в раннем периоде показатели апоптоза в популяции МНК больных были повышены в равной степени как в группе умерших, так и выживших пациентов, можно полагать, что усиленный апоптоз на этом этапе выступает в качестве механизма ограничения системной воспалительной реакции. Известно, что одним из критериев системной воспалительной реакции является увеличение абсолютного количества лейкоцитов более 12,0 х 109/л [9]. Поэтому для выяснения роли апоптоза в ограничении воспалительной реакции мы сравнили показатели апоптоза у пациентов с уровнем лейкоцитоза ниже и выше 12,0 х 109/л. Для исследований было отобрано З0 больных с острыми гнойновоспалительными процессами органов брюшной полости, которые обследовались в 1-2 сутки послеоперационного периода. Абсолютный лейкоцитоз ниже
12.0 х 109/л (в среднем 7,6 ± 0,5 х 109/л) регистрировался у 27 % больных. Количество лейкоцитов свыше
12.0 х 109/л (в среднем 22,0 ± З,6 х 109/л) - у 7З % пациентов. На рисунке 2 видно, что относительное содержание апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов и в культурах нестимулиро-ванных МНК в исследуемых группах не различалось, в то время как уровень активационного апоптоза при стимуляции CD3-мАТ у больных с высоким лейкоцитозом был значимо ниже, чем в оппозитной группе. Обратная взаимосвязь между выраженностью активационного апоптоза и количеством лейкоцитов в крови на ранних этапах заболевания может свидетельствовать, таким образом, об участии апоптоза в ограничении системного воспаления.
Тем не менее, ретроспективный анализ проявлений апоптоза и анергии Т-лимфоцитов у больных с различными исходами заболевания позволяет заключить, что проявления негативного ответа
Таблица 3. ПОКАЗАТЕЛИ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В КУЛЬТУРАХ МНК БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ИСХОДАМИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Показатель/стимул Ранний период Поздний период
Выжившие (n=29) Умершие (n=8) Выжившие (n=15) Умершие (n=6)
Апоптоз (%)
Свежевыделенные 23,5 ± 3,5 26,5 ± 5,8 14,4 ± 3,3 19,5 ± 3,4
Среда 25,5 ± 2,7 26,8 ± 4,0 20,7 ± 2,5 20,5 ± 2,7
CD3-мАТ 34,3 ± 3,6 39,9 ± 4,5 25,0 ± 4,2 43,0 ± 7,1*
SEB 33,2 ± 4,3 37,4 ± 3,7 25,0 ± 4,2 50,3 ± 6,4*
Пролиферация (имп/мин)
Среда 1.637 ± 246 1.552 ± 722 1.253 ± 189 3.707 ± 2.513
CD3-мАТ 19.572 ± 3.247 4.842 ± 1.263* 13.059 ± 3.214 7.757 ± 4.409
SEB 13.199 ± 2.419 12.152 ± 4.564 14.780 ± 3.127 4.472 ± 1.039*
Примечание: * - достоверность различий в группах больных с летальным исходом и исходом в выздоровление при ри < 0,05.
Рис. 2. Показатели апоптоза лимфоцитов у больных с различным уровнем абсолютного лейкоцитоза.
Процентное содержание апоптотических лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии среди свежевыделенных МНК, в 24часовых культурах нестимулированных (среда) и стимулированных анти-CD3-антителами ^3-мАТ) у больных с уровнем лейкоцитоза ниже (1) или выше (2) 12,0 х 109/л. * - PU < 0,05, достоверность различий апоптоза лимфоцитов в оппозитных группах больных.
Т-клеток в большей степени являются неблагоприятными факторами развития гнойно-септических заболеваний, поскольку анергия Т-клеток на ранних, а апоптоз - на поздних этапах хирургической инфекции достоверно выше в группе умерших пациентов. Логично предположить, что если это не случайная связь, снижение чувствительности Т-клеток к активационному апоптозу и выведение их из состояния анергии позволит повлиять на исход хирургической инфекции. Известно, что состояние анергии Т-клеток отчасти преодолевается после их культивирования с экзогенным ^-2 [15]. Предобработка клеток с ^-2 также протектирует индукцию активационного апоптоза Т-лимфоцитов [10]. Нами было установлено, что включение рекомбинантного ^-2 (Ронколейкина в режиме экстракорпоральной иммунотерапии) в программу комплексного лечения больных с хирургической инфекцией приводит к значительному снижению летальности с 29% (п=21; группа больных с базисной терапией) до 13% (п=17; группа больных, получавших ронколейкин). Характерно, что положительная клиническая динамика сопровождалась ослаблением проявлений негативного ответа Т-кле-ток. Так, проведение экстракорпоральной иммунотерапии приводило к снижению процентного содержания апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов и в культурах МНК, стимулированных CD3-мАТ, и усилению пролиферативного ответа Т-клеток (рис.3).
Обсуждение
С тех пор, как было показано участие апоптоза и анергии в гибели и инактивации лимфоидных кле-
ток при сепсисе и эндотоксикозе, закономерно возник вопрос о роли этих феноменов в патогенезе бактериальной инфекции. Является ли повышенный апоптоз и анергия Т-клеток благоприятными факторами или детерминирует осложненный характер гнойно-септического процесса [12]. Основным итогом наших исследований являются данные, свидетельствующие о важной и неоднозначной роли проявлений негативного ответа Т-клеток в патогенезе хирургической инфекции. Прежде всего, показана прямая сопряженность между выраженностью анергии и апоптоза Т-клеток и состоянием общей тяжести больных с гнойно-септической патологией. Среди всех анализируемых параметров наиболее четкая взаимосвязь прослеживается между тяжестью состояния и показателями апоптоза в культурах МНК, стимулированных CD3-мАТ. Поскольку отвечающей популяцией в данном случае являются исключительно Т-клетки, процентное содержание апоптотических лимфоцитов в данной тест-системе отражает уровень активационного апоптоза Т-лимфоцитов. Утяжеление состояния сопряжено с нарастанием средних значений активационного апоптоза и частоты встречаемости пациентов с высоким уровнем апоптоза. Более того, между тяжестью общего состояния и показателями активационного апоптоза Т-клеток имеется достоверная корреляционная связь. Взаимосвязь между тяжестью состояния и проявлениями анергии Т-клеток имеет менее выраженный характер. Так, нам не удалось выявить значимой корреляционной связи между уровнем пролиферативного ответа Т-клеток, стимулированных CD3-мАТ или SEB и тяжестью состояния. Тем не менее, в группе больных с тяжестью состояния более 20 баллов средний уровень проли-
50 т -24
■о
о
/I Ь С
Рис. 3. Показатели апоптоза и пролиферативной активности в культурах МНК больных до и после проведения экстракорпоральной иммунотерапии с ^-2.
Процентное содержания апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов (А), а также уровень апоптоза (Б) и пролиферативной активности (С) в культурах МНК, стимулированных CD3-мАТ, исследовали до начала проведения (черные столбики) и после завершения (белые столбики) экстракорпоральной иммунотерапии с ^-2.
* - ри < 0,05, достоверность различий показателей до и после проведения иммунотерапии.
феративной активности Т-клеток был достоверно ниже, а частота встречаемости анергии Т-клеток -достоверно выше чем у пациентов с тяжестью состояния до 14 баллов по шкале ОТС.
Важным результатом работы представляется результат ретроспективного анализа выраженности апоптоза и анергии Т-лимфоцитов в группах выживших и умерших пациентов, который позволил сделать ряд интересных заключений о роли апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе хирургической инфекции. Оказалось, что на ранних этапах течения инфекции (давность не более 7 суток) высокий уровень активационного апоптоза характерен для всех больных независимо от исхода заболевания. Усиленный апоптоз в этот период инфекции, по-видимому, выступает фактором негативной регуляции системной воспалительной реакции и таким образом играет благоприятную роль. Мысль о позитивной роли апоптоза как механизма ограничения системной воспалительной реакции при сепсисе высказывалась и ранее. Наиболее активно с этой точки зрения обсуждается феномен “деактивации” моноцитов, который обусловлен ЛПС-анергией и повышенным апоп-тозом клеток моноцитарно-макрофагальной природы и сопряжен со смещением баланса в сторону преобладания противовоспалительных цитокинов [5, 1]. Т-клетки также могут принимать участие в регуляции воспалительной реакции через баланс ци-токинов 1-го и 2-го типов [14]. Однако на сегодняшний день ясности в отношении позитивной роли анергии и апоптоза Т-клеток как механизмов feedback регуляции воспалительного ответа пока не существует. Известно, что Th1 лимфоциты обладают повышенной чувствительностью к активационному апоптозу [17]. Также показано, что развитие сепсиса у человека сопряжено со смещением баланса в сторону преобладания регуляторных клеток, продуцирующих цитокины 2 типа [20]. Не исключено, что усиленный апоптоз активированных Т-клеток в ранние сроки течения хирургической инфекции является одной из причин, способствующих смещению баланса в сторону преобладания ^2-цитокинов. Косвенным аргументом в пользу такого предположения могут являться полученные нами данные об обратной взаимосвязи между уровнем апоптоза и абсолютного лейкоцитоза как одного из критериев системной воспалительной реакции. Действительно, больные с высоким уровнем лейкоцитоза (гиперер-гический характер системной воспалительной реакции) характеризовались существенно более низким уровнем апоптоза Т-клеток по сравнению с пациентами с умеренным лейкоцитозом (нормоергический характер воспаления).
На поздних этапах течения хирургической инфекции сохранение повышенного апоптоза активированных Т-клеток сопряжено с неблагоприятным исходом. Это проявляется в практически 2-кратном превыше-
нии уровня апоптоза Т-клеток в группе больных с летальным исходом. Таким образом, на данном этапе развития инфекции усиленный апоптоз выступает в качестве неблагоприятного фактора. Негативная роль апоптоза в литературе рассматривается в контексте развития иммунодепрессии вследствие делеции лимфоидных клеток и, соответственно, ослабления защитных сил организма [7, 12]. Основные данные в пользу этого предположения получены на моделях сепсиса у экспериментальных животных. Например показано, что мыши линии Rag-1-/-, лишенные зрелых Т- и В-лимфоцитов, характеризуются более высоким уровнем летальности в модели CLP (cecal ligation puncture) сепсиса у мышей [11]. Еще более убедительные результаты получены у bcl-2 трансгенных мышей. Гиперэкспрессия bcl-2 гена в Т-клетках предупреждала развитие апоптоза тимоцитов и Т-клеток селезенки и ассоциировалась с повышенной выживаемостью животных в модели CLP-сепсиса [1З]. К сожалению, данные, полученные на экспериментальных моделях у животных, далеко не всегда можно экстраполировать на клиническую ситуацию у человека. Отчасти это обусловлено отсутствием моделей, полностью воспроизводящих условия клинического течения сепсиса, отчасти - особенностями ответа иммунной системы у мыши и человека. Полученные нами данные впервые демонстрируют негативную роль апоптоза в патогенезе гнойной хирургической инфекции у человека и свидетельствуют о том, что повышенный апоптоз Т-клеток выступает в роли неблагоприятного фактора именно на поздних этапах течения гнойно-септического процесса.
Развитие анергии Т-клеток как на раннем, так и на позднем этапе ассоциировалось с неблагоприятным исходом гнойно-септических заболеваний. Наиболее ярко это проявлялось на раннем этапе, когда уровень пролиферации у выживших пациентов оставался относительно сохранным, в то время как в группе умерших впоследствии пациентов регистрировалось катастрофическое снижение пролиферативного ответа при стимуляции через Т-клеточный рецептор. В более поздние сроки снижение пролиферативной активности Т-клеток при стимуляции CD3-мАТ или SEB наблюдалось как в группе выживших, так и умерших пациентов, хотя было более выражено у больных с летальным исходом.
Важно отметить, что проведение иммунотерапии с использованием рекомбинантного интерлейкина-2 (Ронколейкин) в поздние сроки течения хирургической инфекции приводило к ослаблению активационного апоптоза Т-клеток и усилению их пролиферативной активности. Снижение уровня летальности в этой группе по сравнению с группой пациентов, не получавших иммунотерапию (1З% vs 29%), на наш взгляд, еще раз подтверждает важную роль апопто-за и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септичес-
ких заболеваний. Кроме того, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что анергия и апоптоз Т-лимфоцитов могут быть мишенью для новых терапевтических стратегий при лечении гнойно-септических заболеваний.
Список литературы
1. Козлов В.А., Останин А.А. Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Пальцев А.В., Черных Е.Р.. Экстракорпоральная иммунотерапия в коррекции состояния иммунопарализиса у больных с хирургической инфекцией // Int. J. Immunorehabilitation.- 1997.- № 6.-С.135-138.
2. Останин А.А. Иммунопатогенетические аспекты и цитокинотерапия хирургических инфекций.: Автореф. дис. ... доктора мед. наук. Новосибирск.-1999.-с. 44.
3. Руднов В.А., Беляев С.В., Николаев Э.К. Оценка тяжести состояния при сепсисе и септическом шоке // Анестезиология и реаниматология.-
1995.- № 6.- C. 9-11.
4. Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Хонина Н.А., Останин А.А. Апоптоз и анергия периферических Т-лимфоцитов при гнойно-септической патологии // Мед. Иммунология.-1999.- Т.1, № 5.- С.
5. Ayala A., Chaudry I.H. Immune dysfunction in murine polymicrobial sepsis: mediators, macrophages, lymphocytes and apoptosis // Shock.-1996.- Vol. 6.- P. 27-38.
6. Ayala A., Herdon C.D., Lehman D.L., Ayala
C.A., Chaudry I.H. Differential induction of apoptosis in lymphoid tissues during sepsis: variation in onset frequency, and the nature of the mediators // Blood.-
1996.- Vol.5.- P. 4261-4175.
7. Bone C.R., Grodzin C.J., Balk R.A. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of the disease process // Chest.- 1997.- Vol. 112.- P. 235-242.
8. Bone R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS // Crit. Care Med.-1996.- Vol. 24.-P. 1125-1129.
9. Bone R.C., Sprung Ch.L., Sibbald WJ. Definitions for sepsis and organ failure // Crit. Care Med.-1992.- Vol. 20.- P. 724-726.
10. Groux H., Monte D., Plouvier B., Carpon A., Ameisen J.-C. CD3-mediated apoptosis of human medullary thymocytes and activated peripheral T cells:
respective roles of interleukin-1, interleukin-2, interferon-y and accessory cells // Eur. J. Immunol.-1991.-Vol. 23.- P. 1623-1629.
11. Hotchkiss R.S., Swanson P.E., Cobb J.P., Jacobson I., Buchman T.G., Kari I.E. Apoptosis in lymphoid and parenchymal cells during sepsis: findings in normal and T- and B-cell-deficient mice // Crit. Care Med.-1997.- Vol. 25.- P. 1298-1307.
12. Hotchkiss R.S., Swanson P.E., Freeman B.D., Tinsley K.W., Cobb J.P., Matuschak G.M., Buchman T.G., Karl I.E. Apoptotic cell death in patients with sepsis, shock, and multiple organ dysfunction // Crit. Care Med..-1999.- Vol. 27.- P. 1230-1242.
13. HotchkissR.S., Swanson P.E., Knudson C.M., Chang K.C., Cobb J.P., Osborne D.F., Zollner K.M., Buchman T.G., Korsmeyer S.J., Karl I.E. Overexpression of Bcl-2 in transgenic mice decreases apoptosis and improves survival in sepsis // J. Immunol.- 1999.- Vol. 162.- P. 4148-4156.
14. Poll T., Deventer S.J.H. Cytokines and anticytokines in the pathogenesis of sepsis// Infectious Disease Clinics of North America.- 1999.- Vol. 13.- P. 413-422.
15. Quill H. Anergy as a mechanism of peripheral T cell tolerance //J. Immunol.-1996.-Vol. 155.- P. 1325-1327.
16. Ross D.D., Joneckis C.C. Ordonez L.V. Estimation of cell survival by flow cytometric quantification of fluorescein diacetate/ propidium iodide viable cell number // Cancer res.- 1989.- Vol. 49.- P. 3776-3881.
17. Varadhachary A.S., Perdow S.N., Hu C., Ramanarayanan M., Salgame P. Differentional ability of T cell subsets to undergo activation-induced cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- Vol. 94.-P. 5778-5783.
18. Volk H.-D., Reinke P., Krausch D., Zuckermann H., Assadulah K., Muller J.M., Docke W.-
D., Kox W.J. Monocyte deactivation - rationale for a new therapeutic strategy in sepsis // Int. Care Med. -
1996.- Vol. 22.- P. 274-481.
19. Wang S.D., Huang K.J., Lin Y.S., Lei H.Y. Sepsis-induced apoptosis of the thymocytes in mice // J. Immunol.-1994.- Vol. 152.- P. 5014-5021.
20. Zedler S., Bone R.C., Baue A.E., Donnersmarck G.D., Faist E. T-cell reactivity and its predictive role in immunosuppression after burns // Crit. Care Med.-1999.- Vol. 27.- P. 66-73.
поступила в редакцию 21.01.2000 принята к печати 02.02.2000
