CC BY
49
Медицинская иммунология 1999, Т. 1, № 5, стр 45-51 © 1999, СПб РО РА АКИ
Оригинальные статьи
АПОПТОЗ И АНЕРГИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ГНОЙНОСЕПТИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ
Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Хонина Н.А., Останин А. А.
Институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
Резюме. В работе исследованы проявления апоптоза и анергии Т-клеток при гнойно-септических заболеваниях и их взаимосвязь с развитием лимфопении. Показано, что у хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями регистрируется существенно повышенный уровень фраписнтации ДНК в культурах ФГА-стимулированных МНК, значительное увеличение относительного содержания апоптотических клеток в культурах M1-IK, стимулированных моноклональными анти-СОЗ-антителами и среди свежевыделенных лимфоцитов. У пациентов с не осложненным послеоперационным периодом, в отличие от больных с хирургической инфекцией, усиления активационного апоптоза не происходит, а возрастание уровня апоптоза свежевыделенных лимфоцитов носит умеренный характер. Наряду с повышенным апоптозом у больных с гнойно-септической патолог ией отмечается существенное угнетение пролиферативного ответа лимфоцитов, стимулированных через Т-клеточный рецептор анти-СОЗ-антителами или стафилококковым энтеротоксином В. Угнетение функциональной активности не связано с усиленным апоптозом, отражает состояние анергии Т-клеток и регистрируется у 59-66 % обследованных больных. У пациентов из фуппы “хирургического контроля” пролиферативная активность Т-клеток снижена в меньшей степени и выявляется значительно реже. Проявления негативного ответа Т-клеток наиболее характерны для больных с лимфопенией. В этой группе высокий уровень активационного апоптоза встречается в 2,5 раза чаще, чем у пациентов оппозитной группы. Аналогичным образом анергия Т-клеток более выражена и чаще регистрируется у больных со сниженным количеством лимфоцитов. Таким образом, течение гнойно-септических заболеваний сопряжено с усилением активационного апоптоза и анергии Т-клеток. Проявления негативного ответа, обусловлено не столько фактором оперативного вмешательства, сколько наличием инфекции и имеют непосредственное отношение к развитию иммунной недостаточности Т-клеток, в частности - Т-лимфоиении.
Ключевые слова: апоптоз, анергия, иммупдепрессия, хирургическая инфекция
PERIPHERAL T-CELL APOPTOSIS AND ANERGY IN PURULENT INFECTIONS AND SEPSIS
Chernykh H.R., Norkin M.N., Leplina O.Yu., Tihonova M.A., Khonina N.A., Ostanin A.A.
Abstract. Peripheral T-cell apoplosis and anergy and their connection with lymphopenia during the coursc of purulent infections and sepsis have been investigated. Our data have shown, that there are both significantly increased DNA fragmentation and apoptotic cell percentage in 24h cultures of mononuclear cclls (MNC) upon PGA and anti-CD3mAb stimulation respectively, along with a marked apoptosis in fresh isolated lymphocytes among surgical patients with postoperative infectious complications. In contrast to purulent infections patients without postoperative complications did not exhibit activation-induced apoptosis enhancement and revealed slight increased apoptosis in fresh isolated lymphocytes. Higher apoptosis in patients with surgery infections was correlated with profound decrease of MNC proliferative response stimulated via T-cell receptor by ant-CD3-mAb or Staphylococcus enterotoxin B. Functional activity suppression is not connected with accelerated apoptosis, reflects T-cell anergy and is registered within 59-66 % of all patients. Functional activity suppression in “surgery control” group was feebly marked and much more occasional. Manifestation of negative T-cell response was more pronounced in patients witli lymphopenia. These patients reveal 2,5 fold more frequency of high activation-induced apoptosis (>40%) comparable with opposite group. Likewise the degree and rate of T cell anergy is remarkably higher under conditions of lymphopenia comparable to those seen in patients with preserved number of lymphocytes. Thus, the course of surgical infections is followed by increase in T-cell activation-induced apoptosis and anergy. Negative response is caused mainly by infection rather than surgical operation factors and involved in pathogenesis of T-cell acquired immunodeficiency, in particular - T-cell lymphopenia. (Med. Immunol., 1999, vol.l, N5, pp.45-51)
Адрес для переписки: Черных Елена Рэмовна
630091, Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14; Лаборатория клеточной иммунотерапии, Институт клинической
иммунологии Сибирского отделения РАМН
Тел.: 3832-28-21-01; факс: 3832-22-70-28; E-mail: [email protected]
Хорошо известно, что течение гнойно-септических заболеваний сопряжено с иммунодеирессией, в том числе снижением абсолютного количества и функциональной активности зрелых Т-клеток периферической крови |3|. Выраженность иммунной недостаточности во многом определяет особенности клинического течения и исход заболевания [1]. Поэтому изучение механизмов развития иммунодеи-рессии представляется чрезвычайно важным для осмысления патогенеза септического процесса и разработки новых терапевтических стратегий.
Исследования последних лет существенно трансформировали наши представления о механизмах развития иммунодефицитных состояний. Стало очевидным, что иммунная недостаточность может быть следствием индукции анергии и апоптоза как проявлений негативного исхода клеточной активации. Роль апоптоза в патогенезе иммунной недостаточности продемонстрирована при некоторых первичных нммунодефицитах, воздействии радиации, старении [17, 4]. Выяснилось также, что повышенная чувствительность к апоптозу может обусловливать делению зрелых Т-клеток при вирусной инфекции, в частности, у ВИЧ-инфицироианных пациентов [19,10]. Причастность анергии и апоптоза в качестве основных проявлений так называемого негативного ответа Т-лимфоцитов к формированию иммуно-депрессии при бактериальной инфекции остается гораздо менее изученной. Способность суперантигенов грампозитивных и грамнегативных бактерий выступать в качестве индукторов апоптоза и анергии, а с другой стороны истощение лимфоидных органов при экспериментальном сепсисе свидетельствуют о возможной роли негативного ответа в патогенезе бактериальной инфекции. Действительно, недавно было убедительно показано, что полимик-робный сепсис у мышей, индуцированный перевязкой и пунктированием слепой кишки, сопровождается массивным апоптозом клеток в первичных и вторичных лимфоидных органах. Однако не ясно, является ли повышенный апоптоз лимфоидных клеток результатом активационно-индуцированной гибели или отражает другие формы апоптоза (деп-ривационный апоптоз, индуцированный глюкокортико идами апоптоз). Крометого, повышенный апоптоз в указанной модели расценивается скорее как механизм ограничения системной воспалительной реакции, чем как фактор развития иммунодепрессии [5, 12].
Проявления негативного ответа при гнойно-септических заболеваниях у человека практически не охарактеризованы. Между тем имеются все основания полагать, что именно при клиническом течении сепсиса, отличающимся по патогенезу от экспериментального сепсиса животных, повышенный апоптоз и анергия Т-клеток могут быть причинны-
ми факторами иммунодепрессии. Это обусловлено тем обстоятельством, что пациенты с гнойно-септической патологией, получающие адекватное медицинское пособие, в большинстве своем успешно переживают фазу системной воспалительной реакции. Поэтому значительная их часть быстро переходит в фазу компенсаторного противовоспалительного ответа - именно тот период развития заболевания, который часто осложняется развитием глубокой иммунодепрессии [9, 2].
В этой связи настоящая работа посвящена исследованию апоптоза и анергии лимфоцитов у больных с гнойно-септической патологией и исследованию взаимосвязи между выраженностью негативного ответа и развитием лимфопении. Поскольку зрелые Т-клетки периферической крови относительно резистентны к апоптогенным стимулам, и приобретают чувствительность к аполтозу только после активации, основным объектом изучения апоптоза Т-клеток при гнойно-септической патологии стало исследование активационно-индуцированной гибели клеток, получившей название активационного апоптоза [13].
Материалы и методы
В исследование были включены 44 хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями мягких тканей и органов брюшной полости, а также 25 здоровых доноров крови. Группу “хирургического контроля”составили 10 пациентов, оперированных по поводу язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки с не осложненным инфекцией течением послеоперационного периода.
Мопонуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической кропи стандартно в градиенте плотности фиколла-верографнпа. Клетки в концентрации 1,0х105/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфсра, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров AB(IY) группы. Для стимуляции клеток использовали фитогемагглютинин (ФГА, Sigma, США) в концентрации 10 мкг/мл, моноклональные апти-СБЗ антитела ICO-90 (анти-СОЗ-мАТ, ТОО “Медбиоспектр", Москва) в концентрации 1 мкг/мл или стафилококковый энтеротоксип В (SEB, Sigma, США) в концентрации 200 нг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина(1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Идентификацию апоптоза в культурах МНК проводили путем оценки фрагментации ДНК колориметрическим методом [16]. Для этого МНК осаждали центрифугированием (400 g, 15 мин). Клеточный осадок лизировали и центрифугировали (12.000 g, 8 мин). Содержание ДНК в
осадке (интактная ДНК) и надосадке (фрагментированная ДНК) определяли с помощью окрашивания дифеииламнновым реагентом. Процент фрагментации ДНК рассчитывался по формуле:
ОРйооСупериатанта__________хюо%
(ОО600супернатанта + ОО600осадка)
Процентное содержание клеток в состоянии апонтоза определяли методом проточной цитофлю-ориметрии (FACScan, ВесЮп Dickinson). Клетки инкубировали в течение 1 часа с флюоресцсин днаце-татом (FDA; 0,2 мкг/мл, Sigma), после чего добавляли пропидиум йодид (PI, 4 мкг/мл, Sigma). Живые клетки, за счет превращения внутриклеточными эстсразами FDA во флюоресцирующий зеленым флюорссцеин, характеризовались как FDA+PI\ Мертвые клетки, за счет внутриклеточного проникновения PI с последующим связыванием с ДНК или РНК и формированием комплекса с красным флюоресцентным окрашиванием, характеризовались как FDA'PГ. Клетки в состоянии апоптоза, сохраняющие структурность мембраны, но не гидролизующие FDA, оставались соответственно FDA', РГ [18].
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы “Statistica 4.3”.
Результаты
На первом этане мы провели сравнительную оценку уровня фрагментированной ДНК в культурах ФГА-стимулированных МНК в группе 24 здоровых доноров и 13 больных с гнойно-септической патологией (рис. 1). Показатель фрагментации ДНК у здоровых доноров варьировал в диапазоне 13,5-30 %. У больных с хирургической инфекцией за исключением 3 пациентов уровень фрагментированной ДНК выходил за верхнюю границу диапазона значений здоровых доноров и в среднем был в 2 раза выше, чем и контрольной группе.
Для более точной количественной оценки апоптоза далее мы исследовали процентное содержание клеток в состоянии апоптоза методом проточной цитометрии. Уровень активационного апоптоза определяли в 24-часовых культурах МНК, стимулированных антителами к Т-клеточному рецептору -анти-СБЗ-мАТ. Контролем служили показатели апоптоза в культурах, нестимулированных МНК, и среди свежевыделенных лимфоцитов. В исследование были включены 3 группы: здоровые доноры, больные с гнойно-септическими заболеваниями и пациенты, прооперированные в плановом порядке и не имеющие инфекционных осложнений в послеоперационном периоде. Последняя группа представ-
Больной N113 Больней N(12 Больной N111 Больной №10 Больной N*9 Больной N*9 Больной М7 Больной Мв Больной Мб Больной №4 Больной №3 Больной N§2 Больной М1
30 40 50 60 70
Уровень фрагментации ДНК (%)
Рис. 1. Уровень фрагментированной ДНК в культурах ФГА-активированных МНК доноров (п=24) и больных (п=13) в целом но группе и на уровне индивидуальных значений.
** - р <0.01, достоверность различий средних значений по сравнению с группой здоровых доноров.
ляла “хирургический контроль” и была сформирована, чтобы отдельно проанализировать роль инфекции ув факторов оперативного вмешательства в индукции негативного ответа Т-лимфоцитов.
Относительное содержание клеток, подверженных апоптозу, в популяции свеженыделенных лимфоцитов здоровых доноров варьировало от 2 до 6 %, составляя в среднем 4,4 % (рис. 2). В культурах, нестимулированных МНК, уровень апоптоза был несколько выше, однако достоверно не отличался от показателей апоптоза свежевыделенных лимфоцитов. В то же время стимуляция анти-СОЗ-мАТ приводила к умеренному, но значимому усилению апоптоза
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Рис. 2. Показатели апоптоза МНК здоровых доноров (группа 1), хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями (группа 2) и пациентов с неосложненным послеоперационным периодом (группа 3).
Уровень апоптоза определяли среди свежепыделен-ных МНК (0), а также среди МНК, культивированных в течение 24 ч в отсутствие (среда) или в присутствии анти-СБЗ-мЛТ стимуляции (а-СЕ)3). Процентное содержание аиоитотическпх клеток оценивали методом проточной цитомстрии. Достоверность различии показателей но сравнению с группой здоровых доноров при
р <0,05 и р <0,01 обозначена соответственно - *, **.
1 и ' и
(РцСО.05). Г1о сравнению со здоровыми донорами у больных гнойно-септическими заболеваниями показатели апоптоза снежевыделенных лимфоцитов были существенно выше. Аналогичный уровень апоптоза регистрировался в культурах нестимулирован-ных Mil К. Стимуляция апти-СБЗ-антителами приводила практически к 2-кратному усилению апоптоза (р <0,01). В результате уровень активационно-индуцированного апоптоза Т-клеток у больных был в 4 раза выше, чем у здоровых доноров.
У пациентов группы “хирургического контроля” показатели апоптоза свежевыделенных лимфоцитов были повышены (р <0,05), однако не достигали таких значений, как у больных гнойно-септическими заболеваниями. При этом стимуляция MIIK анти-СОЗ-мАТ не сопровождалась дополнительным усилением апоптоза по сравнению с аналогичными показателями в культурах свежевыделенных и нестимулированных МНК. Таким образом, среди больных с не осложненным течением послеоперационного периода не наблюдалось усиление активационного апоптоза. Примечательно, что высокий уровень активационно-индуцированного апоптоза (содержание апоптотических клеток более 40 %) регистрировался при гнойно-септической патологии в 40 % случаев и не встречался ни у одного больного из группы “хирургического контроля”.
Для оценки состояния анергии мы исследовали пролиферативную активность Т-клеток, стимулированных через Т-клеточный рецептор анти-СОЗ-мАТ или SEB. Интенсивность пролиферации в культурах анти-СОЗ-мАТ и SEB-стимулированных МНК здоровых доноров варьировала от 12.460 до 44.140 ими/ мин и от 16.313 до 78.420 ими/мип соответственно. Поэтому ответ менее 12.500 имн/мин в аити-СОЗ-сти-мулированных культурах, и менее 16.500 имп/мин в SEB-стимулированных культурах расценивался как сниженный и свидетельствовал об индукции анергии Т-клеток. Состояние полной ареактмвпости, отражающее максимальное проявление анергии, диагностировали при уровне ответа в стимулированных культурах, не превышающем максимальное значение спонтанной пролиферации здоровых доноров (5.300 имп/мин). Анализ показателей пролиферации в исследуемых группах (табл. 1) выявил двукратное угнетение ответа на стимуляцию анти-СБЗ-мАТ и SEB у пациентов с гнойно-септическими заболеваниями и менее выраженное снижение уровня стимулированной пролиферации Т-клеток у пациентов группы “хирургического контроля”. Сниженный ответ при стимуляции анти-СБЗ-мАТ и SEB у больных с хирургической инфекцией выявлялся в 59 и 66 % случаев, в то время как у пациентов из группы “хирургического контроля” - только в 33 и 38 % случаев соответственно. При этом состояние полной аре-активности Т-клеток наблюдалось исключительно у
Таблица 1. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МНК ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ, ХИРУРГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ И ПАЦИЕНТОВ С НЕ ОСЛОЖНЕННЫМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫМ ПЕРИОДОМ
Стимул Группа 1 п=25 Группа 2 п=44 Группа 3 п=10
Среда 2.473 ± 210 1.667 ± 158 2.274 ± 353
анти-СОЗ-мАТ 28.353 ± 1.800 13.274 ±2.018* 18.281 ±3.449**
SEB 36.450 ± 2.770 14.354 ± 1.883* 23.640 ±8.135
Примечание: 0,1 х 105/лунку МНК здоровых доноров (группа 1), хирургических больных с гнойно-септической патологией (группа 2) и не осложненным послеоперационным периодом (группа 3) стимулировали анти-СОЗ-мАТ в дозе 1 мкг/мл (анти-СОЗ-мАТ), стафилококковым энтеротоксином В (БЕВ) в дозе 200 нг/мл, либо культивировали в отсутствии стимуляции в среде ЯРММ640 (среда). Интенсивность пролиферации оценивали на 3 сутки. Достоверность различий по сравнению с группой 1 прири<0,05ири<0,01 обозначена соответственно -*,**.
больных с хирургической инфекцией и регистрировалось при стимуляции аити-СОЗ-мАТ в 29 %, а при стимуляции Б ЕВ - в 27 % случаев.
Поскольку снижение пролиферативного ответа МНК при гнойно-септических заболеваниях в целом ио группе было сопряжено с повышенным уровнем активационного апоптоза, оставалось неясным, отражает ли угнетение пролиферативной активности состояние анергии Т-лимфоцитов или является результатом гибели значительной части клеток при их активации. Сопоставление показателей апоптоза и пролиферативного ответа в анти-СОЗ-мАТ и БЕВ-сти-мулированных культурах МНК не выявило значимой корреляционной связи между исследуемыми параметрами. Коэффициент корреляции в 8ЕВ-стимулирован-ных культурах составил -0,25 (ри>0.05), в анти-СОЗ-стимулированных культурах -0,1 (ри>0.05). Это позволило предположить, что угнетение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов связано ие столысо с гибелью Т-клеток, сколько с их анергией. Действительно, сравнение пациентов, оппозитных по реактивности'Г-клеток, не выявило достоверных различий в уровне апоптоза (табл. 2). Показатели апоптоза в культурах анти-СОЗ-мАТ и БЕВ-стимулированных МНК были одинаково высокими как в группе с относительно сохранным уровнем пролиферации, так и в группе пациентов с полной ареактивностыо Т-лимфоцитов. Причем у 5 из 18 пациентов с функциональной ареактивностыо (27,8 % случаев) содержание клеток в состоянии апоптоза было увеличено незначительно, не превышая 20 %. Следовательно, можно полагать, что ареактивность Т-клеток в ответ на стимуляцию анти-
Таблица 2. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АКТИВАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО АП0ПТ03А ЛИМФОЦИТОВ В ГРУППАХ БОЛЬНЫХ С НАЛИЧИЕМ И ОТСУТСТВИЕМ АНЕРГИИ Т-КЛЕТОК
Группа анти-СОЗ-мАТ ЭЕВ
больных Пролиферация (имп/мин) Апоптоз (%) Пролиферация (имп/мин) Апоптоз (%)
Анергия (-) п=18 24.578 ±2.979 28 ± 4,0 29.094 ±2.596 29 ± 3,5
Анергия(+) п=18 2.757 ± 432** 36 ±3,9 3.182 ±455” 35,4 ±4,3
Примечание: 0,1 х 105/лунку МНК хирургических больных с гнойно-септической патологией стимулировали анти-СйЗ-антителами в дозе 1 мкг/мл (анти-СОЗ-мАТ), стафилококковым энтеротоксином В (ЭЕВ) в дозе 200 нг/ мл. Уровень активационно-индуцированного апоптоза и интенсивность пролиферации оценивали через 24 и 72 ч культивирования соответственно, п - количество наблюдений, **- ри<0.01, достоверность различий показателей между группами больных с наличием (анергия +) и отсутствием анергии Т-клеток (анергия -).
СОЗ-мАТ и БЕВ, отражает анергию не вовлеченных в апоптоз Т-лимфоцитов и может проявляться изолированно в отсутствии усиленного апоптоза.
Хорошо известно, что клиническое течение гнойносептических заболеваний часто сопровождается снижением абсолютного количества Т-лимфоцитов, что проявляется лимфопенией [3]. Чтобы убедиться, что выявленные нами повышенный апоптоз и анергия Т-клеток не являются исключительно витральными феноменами и имеют отношение к развитию иммунодепрессии, на следующем этапе работы было проведено
сравнительное исследование уровня апоптоза и пролиферативной активности Т-клеток у пациентов с наличием и отсутствием абсолютной лимфопении. Группа больных с лимфопенией включала 17 пациентов с абсолютным количеством лимфоцитов менее 1,0 х 109/Ь. Оппозитную группу составили 25 больных с сохранным количеством лимфоцитов. Из данных табл. 3 видно, что пациенты с лимфопенией характеризовались тенденцией к более высокому уровню активационного апоптоза, хотя достоверных различий с оппозитной группой больных не выявлялось. Тем не менее высокий (более 40 %) уровень активационного апоптоза в анти-СЮЗ-стимулированных культурах, достоверно чаще регистрировался среди пациентов с лимфопенией. Между тем различий между группами в частоте встречаемости высокого уровня апоптоза среди свежевыделенных лимфоцитов или в культурах нестимули-рованных лимфоцитов не выявлялось.
Больные с лимфопенией отличались более выраженным угнетением пролиферативного ответа при стимуляции анти-СБЗ-мАТ по сравнению с оппозитной группой. При этом анергия Т-клеток в анти-СБЗ-стимулированных культурах у пациентов с лимфопенией наблюдалась в 2 раза чаще, чем у пациентов с сохранным количеством лимфоцитов. Характерно, что на ранних этапах хирургической инфекции (длительность до 7 суток) больные с лимфопенией по сравнению с оппозитной группой характеризовались одинаково высокими показателями активационного апоптоза (38,3 ± 5,7 % 35,3 ±
4,2 %), однако отличались более выраженным угнетением пролиферативного ответа при стимуляции анти-СБЗ-мАТ (6.889 ± 2.021 имп/мин уя 20.063 ± 4.403 имп/мин, ри<0.05). В свою очередь, на поздних этапах течения инфекции (более 7 суток) развитие
Таблица 3. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ В ГРУППАХ БОЛЬНЫХ С НАЛИЧИЕМ И ОТСУТСТВИЕМ ЛИМФОПЕНИИ
Группа больных Апоптоз лимфоцитов среди МНК Пролиферация
Свежевыделенных Нестимулированных Стимулированных Анти-СОЗ-мАТ
Лимфопения (-) М ± т 20,3 ± 3,4 21,7 ±2,6 30,2 ±3,5 16.810 ±3.040
п=25 %*> 24 % (6/25) 36% (9/25) 20% (5/25) 20 % (5/25)
Лимфопения (+) М ± т 21,0 ±3,7 23,6 ±3,5 37,0 ±3,4 8.730 ± 1.950**
п=17 % 29% (5/17) 41% (7/17) 53% (9/17)# 53% (9/17)#
Примечание: процентное содержание лимфоцитов в состоянии апоптоза в группах больных с наличием (лимфопения +) и отсутствием лимфопении (лимфопения -) определяли среди свежевыделенных МНК, а также среди МНК, культивированных в течение 24 ч в отсутствии или в присутствии анти-СОЗ-мАТ стимуляции. Интенсивность анти-С03-индуцированной пролиферации (имп/мин) оценивали на 3 сутки. Данные представлены в виде М ± т.
А) - частота встречаемости пациентов с высоким уровнем апоптоза и полной ареактивностью Т-клеток, т.е. апоптоз среди свежевыделенных и нестимулированных МНК - более 25%; среди МНК, стимулированных анти-СОЗ-мАТ - более 40%; интенсивность пролиферации в ответ на анти-СОЗ-мАТ стимуляцию - менее 5.300 имп/мин.
** - ри<0.01, достоверность различий средних значений показателей между группами.
# - рш=0.029, достоверность различий частоты встречаемости показателей между группами, рассчитанная точным метод ом Фишера.
лимфопении в большей степени было сопряжено с повышенным уровнем активационного аноптоза (36,5 ± 4,5 % в группе с лимфопении и 22,5 ± 4,3 % в отсутствии лимфопении, pL,<0.05), чем со степенью угнетения пролиферативной активности Т-клеток (9.703 ± 2.830 ими/мин vs 11.390 ± 3.280 имп/мин у пациентов с сохранным количеством лимфоцитов).
Обсуждение
Полученные нами результаты четко демонстрируют, что течение гнойно-воспалительных заболеваний сопряжено с усилением активационного аноптоза зрелых Т-клеток периферической крови. Это подтверждается значительно повышенным уровнем фрагментированной ДНК в культурах МНК, стимулированных фитогемагглютинином, а также увеличением содержания апоптотических клеток среди МНК, стимулированных анти-СБЗ-мАТ илиБЕВ. Повышенное содержание клеток в состоянии апоптоза регистрируется также в популяции свежевыделенных лимфоцитов, что, по-ввдимому, отражает реализацию программы активационного апоптоза in vivo.
Следует отметить, что работы, посвященные исследованию апоптоза при генерализованной бактериальной инфекции, в подавляющем большинстве проводятся на моделях сепсиса у экспериментальных животных. Полученные данные однозначно свидетельствуют о сопряженности сепсиса с массивным аиоптозом в первичных лимфоидных органах - тимусе и в меньшей степени костном мозге. Данные о проявлениях апоптоза зрелых Т- и В-клеток достаточно противоречивы. Ayala А. с соавт. не выявил усиления апоптоза среди спленоцитов, однако обнаружил повышенное содержание апоптотических клеток в популяции CD8* и В220+ лимфоцитов слизистой кишечника [6]. В то же время Hotchkiss R.S. с соавт. удалось выявить повышенный апоптоз лимфоидных клеток в селезенке [12J, однако при этом не анализировалось, какие популяции лимфоцитов были подвержены аиоптозу. В этом свете представленные в настоящей работе данные, по сути, впервые характеризуют апоптоз зрелых рециркулирующих Т-клеток при бактериальной инфекции у человека.
Другим важным результатом проведенных исследований являются данные, свидетельствующие об анергии Т-клеток при гнойно-септической патологии. Если вопросам апоптоза в патогенезе инфекционно-воспалительных процессов бактериальной этиологии уделено достаточное внимание, то состояние анергии Т-клеток в контексте развития гнойно-септических заболеваний исследовано в значительно меньшей степени. Известно, что рестимуляция лимфоцитов стафилококковым энтеротоксином В приводит не только кделецииЗЕВ-реак-тивных Vb8* Т-клеток, но и к индукции анергии оставшихся Vb8+ Т-лимфоцитов [7, 14]. Однако проявления
анергии Т-лимфоцитов при полимикробпом сепсисе у .'жепериментальных животных и тем более при гнойно-септической патологии у человека - остаются не исследованными. В то же время данные о де<|>е1<те антигенп-резентирующей функции моноцитов при сепсисе, в частности снижении экспрессии ПЬА-ОЯ-молекул [20] теоретически обосновывают вероятность развития анергии Т-клеток в ответ на практически любой антигенный стимул. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что Т-клетки больных с хирургической инфекцией характеризуются низким уровнем пролиферативного ответа при стимуляции анти-СОЗ-мАТ и БЕВ в 59 и 66 % случаев соответственно. 1 [ричем снижение пролиферации не обусловлено повышенным апоптозом и отражает состояние анергии Т-лимфоцитов.
Проведенные нами сравнительные исследования показали, что высокий уровень активационного апоптоза Т-клеток характерен для больных с гнойно-септическими заболеваниями и не выявляется у пациентов с не осложненным течением послеоперационного периода. В то же время повышенный апоптоз свежевыделенных лимфоцитов регистрируется в обеих анализируемых группах, хотя существенно более выражен при гнойно-септической патологии. Можно полагать, что повышенная готовность клеток к активационному апоптозу детерминирована наличием инфекции, в то время как апоптоз свежевыделенных лимфоцитов может быть отчасти обусловлен иными механизмами, связанными с факторами оперативного вмешательства, в том числе медиаторами стресса. Так, известно, что зрелые Т-клетки при активации приобретают чувствительность к апоптозу, индуцированному глюкокортико-идами [15). Кроме того, известна способность медиаторов симпатической нервной системы прямо или через стимуляцию продукции 1Ь-10 индуцировать апоптоз иммунокомпстентных клеток [11,8].
Выяснение роли негативного ответа Т-клеток в патогенезе иммунодепрессии показало, что высокий уровень активационного апоптоза достоверно чаще встречается у больных с лимфопенией. Аналогичным образом частота развития анергии и степень ее проявления были более выражены у больных со сниженным количеством лимфоцитов. Таким образом, можно заключить, что одним из механизмов развития иммунодепрессии при хирургической инфекции может быть повышенная готовность Т-клеток к негативному ответу. Характерно, что в зависимости от этапа (раннего или позднего) гнойно-воспалительного процесса “долевое участие” анергии и апоптоза в развитии лимфопении может различаться. Так, на раннем этапе течения инфекции снижение абсолютного количества сопряжено не столько с активационным апоптозом, сколько с индукцией анергии Т-клеток. На позднем этапе лимфопения в большей степени обусловлена активационным апоптозом.
Выявление повышенного апоптоза и анергии Т-клеток у большинства больных с гнойно-септическими заболеваниями свидетельствует об универсальности механизма негативного ответа в патогенезе гнойно-сентической патологии. По-видимому, аноп-тоз и анергия иммунокомпетентиых клеток при бактериальной инфекции играют двойственную роль -с одной стороны, ограничивают системный воспалительный ответ, с другой - обусловливают формирование иммунодепрессии. Можно полагать, что раскрытию истинного значения апоптоза и анергии Т-клеток во многом будет способствовать скрупулезный анализ проявлений негативного ответа при различных формах течения и исходах гнойно-воспалительного процесса, благодаря которому в руках клиницистов появится новый инструмент прогнозирования течения и, возможно, терапевтического воздействия при лечении сепсиса.
Список литературы
1. Брискнн Б.С., Савченко З.И. Иммунная недостаточность у больных с хирургической инфекцией.// Врач,- 1994.-№ 12.-С.5-8.
2. Козлов В.Л., Останин А.А. Леплина О.Ю., Шеве-ла Е.Я., Пальцев А.В., Черных Е.Р.. Экстракорпоральная иммунотерапия в коррекции состояния иммунопарализиса у больных с хирургической инфекцией. // Int. J. Immunorehabilitation.- 1997.-N» 6,- С. 135-138.
3. Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Юдина Т.И. Иммунодиагностика и иммунотерапия хирургических инфекций.// Int. J. Immunorehabilitation.- 1998.-№ 10.-С.86-99.
4. Ярилип А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах.// Иммунология,- 199fi.-№ 6.-С.10-23.
5. Ayala A., Chaudry I.H. Immune dysfunction in murine polymicrobial sepsis: mediators, macrophages, lymphocytes and apoptosis.//Shock.- 1996.-Vol.6(supl 1).-P 27-38.
6. Ayala A., Herdon C.D., Lehman D.L., Ayala C.A., Chaudry I.H. Differential induction of apoptosis in lymphoid tissues during sepsis: variation in onset frequency, and the nature of the mediators.// Blood.-1996.- Vol.5,-P.4261-4175.
7. Bashieri S., Lees R.K., Lussow A.R. Clonal anergy to staphylococcal enterotoxin В in vitro: selective effects on T cell subsets and lymphokines.// Eur. J. Immunol.-1993,- Vol.23,- P.2661-2666.
8. Bergquist J., Josefsson E„ Tarkowski A., Ekman R„ Ewing A. Measurement of catecholamin-mediated apoptosis of immunocompetent cells by capillary electrophoresis // Electrophoresis.-1997,- Vol.18.- P.1760-1766.
9. Bone C.R., Grodzin C.J., Balk R.A. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of the disease process.// Chest.-1997,- Vol. 112.- P.235-242.
10. Clerici М., Sarin A., Coffman R.L., Wynn T.A., Blatt
S.P., Hendrix C.W., Wolf S.F., Shearree G.M., Henkart P.A. Type 1/type 2 cytokine modulation of T cell programmed cell death as a model for human immunodeficiency virus pathogenesis.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.-Vol.91,- P.l 1811-11815.
11. Docke W.-D,, Jacobi C., Eberhardt B., Sabat R„ Stosslein R„ Volk H.-D. Rapid systemic IL-10 release after major trauma and stress may contribute to post-injury immunodepression.//The immune consequences of trauma, shock and sepsis.- 1997.- P. 177-182.
12. Hotchkiss R.S., Swanson P.E., Cobb J.P, Jacobson I., Buchman T.G., Kari I.E. Apoptosis in lymphoid and parenchymal cells during sepsis: findings in normal and T-and B-cell-deficient mice.//Crit. Care Med.-1997.- Vol.25.-P. 1298-1307.
13. Kabelitz D., Janssen O. Antigen-induced death of T-lymphocytes. // Frontiers in bioscience.- 1997,- Vol.2.-P.61-77.
14. KuschnarolTL.M., Valckh D., Goebels G. Effect of treatments with cyclosporin A and anti-interferon-gamma antibodies on the mechanisms of immune tolerance in staphylococcal enterotoxin В primed mice // Scand. J. Immunol.- 1997.-V.46,- P.459-468.
15. Lanza L., Scudelleti М., Puppo F. Prednison increases apoptosis in vitro activated human peripheral blood T lymphocytes.// J. Exp. Immunology.-1996.-Vol.103.- P.482-490.
16. McConkey D.J., Chandra J., Wright S., Plunkett W., McDonnell J.T., Reed J.C., Keating M. Apoptosis sensitivity in chronic lymphocytic leukemia is determined by endogenous content and relative expression of BCL-2 BAX.//J. Immunology 1996,-Vol.156,- P.2G24-2630.
17. Pignata C., Fiore М., Scotese I.. Combined immunodeficiency phenotype associated with inappropriate spontaneous and activation-induced apoptosis.// Clin. Exp. Immunology.- 1997.-Vol.108.-P.484-489.
18. Ross D.D., Joneckis C.C. Ordonez L.V. Estimation of cell survival by flow cytometric quantification of fluorescein diacetate/ propidium iodide viable cell number./ / Cancer res.- 1989,- Vol.49.- P.3776-3881.
19. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease.// Science.- 1995,- Vol.267.- P. 1456-1461.
20. Volk H.-D., Reinke P., Krausch D., Zuckermann H„ Assadulah K., Muller J.M., Docke W.-D., Kox W.J. Monocyte deactivation - rationale for a new therapeutic strategy in sepsis.// Intensive Care Med. -1996.- Vol.22.-P.274-481.
поступила в редакцию 22.11.99 пришта к печати 06.12.99
