CC BY
89
Медицинская Иммунология 2003, Т. 5, № 5-6, стр 529-538 © 2003, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ФЕНОМЕН Т-КЛЕГОЧНОЙ АНЕРГИИ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ СЕПСИСЕ
Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Курганова Е.В., Стрельцова Е.И.*, Останин А.А., Козлов В.А.
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск;
* Государственная Новосибирская областная клиническая больница, Россия
Резюме. В работе проведено исследование пролиферативного ответа Т-клеток при хирургическом сепсисе и проанализирована роль анергии как возможного механизма снижения пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Показано, что глубокое (более 50%) угнетение пролиферативного ответа МНК в анти-СБЗ-стимулированных культурах выявляется в 52% случаев и характеризует функциональную ареактивность не вовлеченных в апоптоз Т-клеток. Угнетение пролиферации у 42% больных сопряжено с выраженным снижением продукции IL-2 на фоне умеренного снижения продукции IL-4. При этом добавление экзогенного IL-2 приводит к значимому усилению пролиферативной активности Т-клеток. Анализ содержания ДНК в популяциях Т-клеток у больных со сниженным анти-СБЗ ответом продемонстрировал блок прохождения клеточного цикла в субпопуляции CD4 Т-клеток, что в совокупности с представленными выше данными свидетельствует об анергии Т-лимфоцитов. Анергия Т-клеток у больных с хирургическим сепсисом сопряжена с двукратным возрастанием субпопуляции CD4+CD25+ Т-клеток, количество которых обратно коррелирует с уровнем пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Кроме того, показано, что у пациентов с анергией Т-клеток отмечается перекрестное снижение пролиферативного ответа при стимуляции КонА и SEB. Анализ пролиферативной активности Т-клеток у больных с различной тяжестью и исходом заболевания свидетельствует, что анергия Т-клеток коррелирует с выраженностью СПОН и сопряжена с неблагоприятным/летальным исходом. Следовательно, появление в циркуляции энергичных Т-клеток с супрессорной активностью, в том числе CD4+CD25+ Т-лимфоцитов является одним из механизмов иммунной недостаточности при сепсисе.
Ключевые слова: Т-лимфоциты, анергия, цитокины, С04^СВ25*Т-клетки, сепсис.
Chernykh E.R., Leplina О. Yu., Tihonova М.А., Kurganova C.V., Streltsova E.I., Ostanin A.A., Kozlov V.A.
T CELL ANERGY IN SURGICAL SEPSIS
Abstract. T cell proliferation in 114 patients with surgical sepsis was evaluated and the role of anergy as a possible mechanism of diminished T cell proliferative activity was analyzed. It has been shown that the profound decrease (at least <50% compared to the normal value) of T-cell proliferation in anti-CD3-stimulated cultures is detected in 52% patients with sepsis and reflect the functional unresponsiveness of T cells, which are not involved in apoptosis. The low anti-CD3-induced proliferative response in 42% patients was associated with marked decrease of IL-2 production and moderate reduction of IL-4 level. Patient’s T cell proliferation could be significantly restored by rIL-2 (100 IU/mL) addition. The analysis of DNA content in T cell subsets revealed that CD4+T-cells (but not CD8+T-lympho-cytes) of patients with low anti-CD3 response are blocked in G0/G1. These data additionally indicate the anergic status of T cells in sepsis. T cell anergy was associated with 2-fold increase of CD4+CD25+T-lymphocytes, and the significant reverse correlation between the CD4+CD25+T cell quantity and the level of T-cell proliferation was revealed (r = -0.87, p<0.05). Moreover, it has been shown that the patients with low anti-CD3 response were also characterized by decrease of T cell proliferation upon stimulation with ConA or SEB. The analysis of patients with different sepsis severity and outcome evidence that T cell anergy is directly correlated with MODS score and associ-Адрес для переписки: al:ed with fetal outcome. Therefore the appearance of the
6300099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14, anergic Т cells with suppressive activity, including
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, CD4+CD25+T-lymphocytes, is suggested to be the pos-
Лаборатория клеточной иммунотерапии, sible mechanism of immunodepression in patients with
ЧерныхE.P. Тел.:3832-28-21-01, факс:3832-22-70-28. surgical sepsis. (Med.Immunol., 2003, vol.5, №5-6, pp
E-mail: ctlab@drbit.ru 529-538)
Введение
Течение сепсиса сопряжено с формированием иммунной недостаточности, о чем свидетельствует снижение реакции гиперчувствительности замедленного типа, неспособность организма элиминировать инфекцию и предрасположенность к присоединению нозокомиальной инфекции [19, 23, 26]. Одним из проявлений Т-клеточного дефекта является снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов, которое, по мнению многих авторов, ассоциировано с неблагоприятным течением и исходом заболевания [1,12, 28].
Снижение пролиферативной активности Т-кле-ток связывают с несколькими возможными причинами, и, прежде всего, с действием иммуносупрес-сорных цитокинов. Так, угнетение митогенной реактивности Т-клеток может быть обусловлено повышенной продукцией моноцитами/макрофагами про-стагландина Е (ПГЕ ), трансформирующего рост фактора-Р (ТС^-Р), интерлейкина 10 (1Ь-10). Немаловажную роль играет, по-видимому, ТЬ1/ТЬ2 переключение, поскольку гиперпродукция ТЬ2 цитокинов, таких как 1Ь-4 и 11.-10, приводит к угнетению функций антигенпрезентирующих клеток и подавляет ТЫ ответ [5, 6, 9]. Наряду с активной иммуносупрессией дефект пролиферативной активности Т-клеток может быть обусловлен повышенным апоп-тозом Т-лимфоцитов [14, 10]. Кроме того, полученные нами ранее данные позволили предположить, что выраженное угнетение пролиферации Т-клеток при сепсисе может быть обусловлено анергией Т-лимфоцитов [3].
Индукция анергии ТЫ и ТЬ2 у больных с дефектом пролиферативной активности Т-клеток продемонстрирована при травме [11]. Имеются единичные сообщения о признаках анергии ТЫ у больных с перитонитом [12]. Вто же время прямые данные об анергии Т-клеток при сепсисе до настоящего времени отсутствуют. Между тем, вопрос об анергии Т-клеток при сепсисе представляет большой интерес с точки зрения выяснения механизмов Т-клеточных дисфункций, особенно в контексте регуляторной/иммуно-супрессорной активности энергичных Т-клеток. За последние годы выяснилось, что энергичные С04'Т-клетки включают субпопуляцию «естественных» супрессорных клеток с фенотипом СБ4+СБ25+ и инду-цибельных супрессорных Т-клеток (Тг1), продуцирующих 1Ь-10, способных вызывать развитие иммунной недостаточности [7, 18, 30]. В то же время сведения, характеризующие субпопуляционную принадлежность энергичных Т-клеток, в том числе дэнные о популяции С04+С025+ Т-клеток при сепсисе отсутствуют. Исходя из этого, нэстоящзя рэбота была посвящена более детальному исследованию феномена анергии Т-клеток у больных с хирургическим сепсисом. Для этого мы исследовали свойства энергичных Т-клеток, включэя анализ их субпопуляционной при-
надлежности и оценку количества CD4+CD25+ Т-клеток. Кроме того, для выяснения клинической значимости Т-клеточной анергии была изученз взаимосвязь анергии Т-клеток с исходом заболевэния и выраженностью синдрома полиорганной недостаточности (СПОН), являющегося наиболее частой причиной летального исхода при сепсисе.
Материалы и методы
В исследование были включены 114 хирургических больных с сепсисом: 65 мужчин и 49 женщин в возрасте от 16 до 80 лет (в среднем 45,5 ±1,6 лет). В 67,4% случаев сепсис был вызван гнойно-воспали-тельными заболеваниями органов брюшной полости и в 24,6% - нагноительными заболевэниями органов грудной полости. В остальных случаях (8%) регистрировался ангиогенный сепсис. Диагностика сепсиса в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции основывалась на выявлении двух и более признэков синдромэ системного воспалительного ответа при наличии очага инфекции. Наличие и выраженность СПОН оценивали по шкале SOFA [22]. Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия. Контрольную группу составили 50 здоровых доноров крови.
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови стандартно в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации 0,1 х 106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буферэ, 100 мкг/мл гентэмицинэ и 10% инактивированной сыворотки доноров AB(IV) группы. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, Sigma, США) в концентрации 15 мкг/мл, моноклональные анти-СЭЗ антитела ICO-90 (анти-CD3, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл или стафилококковый энтеротоксин В (SEB, Sigma, США) в концентрации 200 нг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.
Методом электрохемилюминесценции [25] оценивали уровень продукции IL-2 и IL-4 в 48-часовых супернатэнтэх МНК, стимулированных фитогемаг-глютинином (ФГА, Sigma, 5 мкг/мл) в комбинации с форболмиристатэцетзтом (ФМА, Sigma, 20 нг/мл).
Фенотипирование клеток проводили методом проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson) с использованием моноклональных антител («Сорбент», Москвэ). Для определения субпопуляции CD4+CD25+Т-клеток использовали FITC-меченные анти-С04 антитела, конъюгированные с FITC, и анти-С025 энтителэ, меченные РЕ (PharMingen, San Diego, СА).
Относительное количество апоптотических клеток определяли методом проточной цитофлюори-метрии при помощи двойного окрашивания клеток флюоресцеин диацететом (FDA; 0,2 мкг/мл, Sigma) и пропидиумом йодидом (PI, 4 мкг/мл, Sigma) в соответствии с ранее описанным протоколом [3, 29]. Живые клетки, за счет превращения внутриклеточными эстеразами FDA во флюоресцирующий зеленым флюоресцеин, характеризовались как FDA+PI\ Мертвые клетки, за счет внутриклеточного проникновения PI с последующим связыванием с ДНК или РНК и формированием комплекса с красным флюоресцентным окрашиванием характеризовались как FDA'PI+. Клетки в состоянии апоптоза, сохраняющие структурность мембраны, но не гидролизующие FDA, оставались соответственно FDA' РГ.
Оценку апоптоза лимфоцитов проводили также цитометрически с помощью окрашивания пропидиумом йодидом [4]. В этом случае процентное содержание апоптотических лимфоцитов рассчитывалось по одномерной гистограмме красной флюоресценции клеток, отнесенных к лимфоцитарному облаку. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподип-лоидный пик. Анализ клеточного цикла проводили цитометрически на основании измерения содержания ДНК с помощью окрашивания клеток пропидиумом йодидом. Процентное содержание клеток с различным содержанием ДНК оценивали по одномерной гистограмме красной флюоресценции клеток лимфоцитарного облака. Для оценки апоптоза и анализа клеточного цикла в различных субпопуляциях лимфоцитов использовали метод проточной двуцветной цитофлюориметрии.
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, парамет-
рической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5.0».
Результаты
Анергия представляет состояние функциональной неотвечаемости на антигенную стимуляцию и проявляется снижением пролиферативной активности и продукции цитокинов при стимуляции лимфоцитов через Т-клеточный рецептор. Поэтому на первом этапе мы сравнили уровень пролиферативного ответа при стимуляции анти-СБЗ и SEB в культурах МНК больных сепсисом и здоровых доноров. В целом у больных сепсисом ответ на анти-СБЗ и SEB был снижен практически в 2 раза. При этом снижение пролиферативного ответа на 50% и менее по сравнению со средним нормативным уровнем, выявлялось соответственно в 52 и 68% случаев (табл. 1). Таким образом, более чем у половины больных сепсисом пролиферативная реактивность Т-клеток была резко угнетена, что может свидетельствовать о пребывании их в состоянии анергии.
Поскольку угнетение пролиферации могло быть также результатом активационно-индуцированной гибели Т-клеток, мы сравнили показатели апоптоза лимфоцитов в группах пациентов со сниженным и относительно сохранным ответом на анти-СБЗ и SEB. Как следует из данных таблицы 2, уровень активационного апоптоза был повышен у пациентов обеих групп. Несмотря на тенденцию к более высоким показателям апоптоза у больных со сниженной пролиферацией, достоверных различий между значениями активационного апоптоза в оппозитных группах выявлено не было. Кроме того, следует отметить, что у 9 из 41 пациента с SEB-ареактивнос-
Табл. 1. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ В ГРУППАХ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ХИРУРГИЧЕСКИМ СЕПСИСОМ
Доноры Больные
Стимул Пролиферация (имп/мин) Пролиферация (имп/мин) Частота больных со сниженным (<17000 имп/мин) пролиферативным ответом
анти-СОЗ 3473011950 (п=50) 1864511300** (п=114) 52% (59/114)
SEB 36449 ± 2770 167421 1876** 68%
(п=26) (п=60) (41/60)
Примечание: 0,1 х 106/лунку МНК здоровых доноров и больных хирургическим сепсисом стимулировали анти-СОЗ-антителами в дозе 1 мкг/мл (анти-СОЗ) или стафилококковым энтеротоксином В (БЕВ) в дозе 200 нг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч культивирования, п - количество наблюдений, **- ри<0,01, достоверность различий по сравнению со здоровыми донорами, и- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни
тью и 15 из 59 пациентов со сниженным ответом на анти-СБЗ, показатели активационного апоптоза сохранялись в границах диапазона нормативных значений. Следовательно, можно полагать, что угнетение пролиферации в анти-СБЗ и БЕВ-стимулиро-ванных культурах МНК обусловлено анергией не вовлеченных в апоптоз Т-клеток.
Наряду с угнетением пролиферации классическим проявлением анергии является также снижение продукции 1Ь-2. Оценка уровня секреции 1Ь-2 у 19 пациентов со сниженным анти-СОЗ ответом показала, что угнетение продукции 1Ь-2 в культурах МНК, стимулированных ФГА и ФМА, выявлялось в 42% случаев (у 8 из 19 больных). Продукция П.-2 у этих пациентов выходила за нижнюю границу квартильного диапазона нормативных значений и составляла в среднем 413 ± 70 пг/мл (га 1087 ± 109 пг/мл у здоровых доноров, п=16;р<0,01). Важно отметить, что снижение продукции 1Ь-2 не сопровождалось усилением продукции 1Ь-4. Так, у больных со сниженной продукцией 11.-2 уровень 1Ь-4 в культуральных супернатантах был также снижен, однако в меньшей степени (762 ± 66 га 1045 ± 53 пг/мл у здоровых доноров, п=16; р<0,01). Следовательно, можно полагать, что снижение пролиферативной активности Т-клеток при сепсисе не связано с ТЫ/ТЬ2 переключением и отражает анергию Т-клеток.
Поскольку пролиферативная активность энергичных Т-клеток может быть частично или полностью восстановлена экзогенным 1Ь-2, мы исследовали эффект 1Ь-2 на уровень пролиферэции у больных со сниженным анти-СБЗ ответом. Усиление анти-
CD3 ответа в присутствии IL-2 в дозе 100 ЕД/мл регистрировалось у 7 из 8 обследованных пациентов и проявлялось 2-кратным усилением интенсивности анти-СБЗ-индуцированной пролиферации в целом по группе с 10883 ± 2094 до 19091 ± 5566 имп/ мин (п=8, Р =0,025). Таким образом, снижение продукции IL-^ и частичное восстановление пролиферативной активности в присутствии экзогенного IL-2 является дополнительным аргументом в пользу анергии Т-клеток у больных с хирургическим сепсисом.
Поскольку снижение in vitro пролиферативной активности при анергии обусловлено блоком в G0/ G1 фазе клеточного цикла [17], прямым доказательством анергии Т-клеток могло бы быть выявление блока клеточного цикла. При этом анализ распределения клеток по циклу во фракциях CD4+ и CD8+T-клеток позволил бы уточнить субпопуляционную принадлежность энергичных Т-клеток. Сравнительное исследование клеточного цикла во фракции CD4 и CD8 клеток в группе 8 здоровых доноров и 5 пациентов со сниженным анти-СБЗ ответом (табл. 3) показзло, что у больных сепсисом регистрируется блок прохождения клеточного циклз среди CD4 клеток, тогда как в популяции CD8 лимфоцитов нэру-шений клеточного цикла не выявлялось. Так, у здоровых доноров стимуляция МНК знти-СБЗ-знти-телами приводит к достоверному снижению доли клеток в G0/G1 и возрастанию числа клеток в S,G2/ М фазах клеточного цикла. При этом увеличение циклирующих клеток через 24 часа после стимуляции регистрируется в популяции как CD4+, так и СБ8+Т-лимфоцитов. В то же время у больных сеп-
Табл.2. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АКТИВАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ В ГРУППАХ БОЛЬНЫХ С НАЛИЧИЕМ И ОТСУТСТВИЕМ АНЕРГИИ Т-КЛЕТОК
анти-СОЗ SEB
Группы Пролиферация (имп/мин) Апоптоз (%) Пролиферация (имп/мин) Апоптоз (%)
Больные с наличием анергии 7325 ± 724 ** п=59 31 ± 2,4# п=59 8207 ± 773 ** п=41 30,5 ± 2,7# п=41
Больные с отсутствием анергии 28650 ±1924 п=55 26 ± 2,7# П=55 34726 ±2815 п=19 22,8 ±3,1# п=19
Здоровые доноры 34730 ±1950 (П=50) 8,1 ±1,1 (п=13) 36449 ± 2770 (п=26) 7,8 ±1,3 (п=12)
Примечание: культивирование клеток и оценку пролиферативной активности проводили, как описано в табл. 1. Уровень апоптоза определяли в 24-часовых культурах цитометрически с помощью окрашивания клеток РРА и Р1. п - количество наблюдений, **- ри<0,01, достоверность различий показателей меаду группами больных с наличием и отсутствием анрегии. # - ри<0,01, достоверность различий показателей апоптоза у больных и доноров.
сисом стимуляция анти-СОЗ сопровождалась достоверным увеличением числа циклирующих клеток только в популяции СБ8+Т-лимфоцитов, тогда как увеличения доли клеток в 8,С2/М фазах клеточного цикла среди С04+Т-лимфоцитов не выявлялось.
Выявление анергии в популяции СБ4 Т-клеток представляет особый интерес, поскольку согласно появившимся в последние годы данным популяция энергичных С04 клеток обладает регуляторной/ супрессорной активностью. Указанную активность могут проявлять индуцибельные энергичные С04 Т-клетки (Тг1), продуцирующие 1Ь-10 [18]. Кроме того,
супрессорная активность может опосредоваться субпопуляцией энергичных Т-лимфоцитов, хэрзктери-зующихся ко-экспрессией на CD4 клетках а-цепи рецептора IL-2 (CD25). Т-клетки с фенотипом CD4+CD25+, получившие название естественных регуляторных Т-клеток, обладают контэкт-опосре-дованной неспецифической супрессорной активностью и при стимуляции через Т-клеточный рецептор способны ингибировать пролиферацию CD4+CD25' клеток, а также CD8 лимфоцитов [17, 32]. В этой связи представлялось интересным выяснить, ассоциирована ли Т-клеточная анергия при
Н с»)
о х со
а
о
■
S
I-
X
го
X
S
S
"с
5
S
60
40
20 -
Г = - 0,87 р<0.05
10
CD4+CD25+(%)
15
—і 20
Рис. 1. Корреляционная взаимосвязь между относительным количеством CD4+CD25fТ-клеток и уровнем анти-СОЗ-стимулиро-ванного пролиферативного ответа у больных с хирургическим сепсисом. 0,1x106/лунку МНК больных с сепсисом стимулировали анти-СРЗ-антителами (1 мкг/мл). Уровень пролиферации оценивали через 72 часа. Относительное содержание CD4+CD25+ Т-клеток оценивали во фракции свежевыделенных МНК больных.
Табл. 3. АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В СУБПОПУЛЯЦИЯХ CD4 И CD8 Т-КЛЕТОК У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ С ХИРУРГИЧЕСКИМ СЕПСИСОМ
Субпопуляции Т-клеток Доноры (п=8) Больные (п=5)
G0/G1 (%) S.G2/M (%) G0/G1 (%) S.G2/M (%)
CD4 (0) 91,7 ±1,3 4,1 ±0,9 90,4 ± 4,4 3,8 ±1,3
CD4 (анти-СОЗ) 83,9 ± 3,5* 12,0 ±2,7* 84,1 ± 5,7 5,8 ±1,0*
CD8 (0) 87,6 ±4,1 4,1 ±1,3 90,3 ± 3,5 2,4 ±0,8
CD8 (анти-СОЗ) 82,4 ± 3,4 10,8 ±2,7* 82,7 ± 5,5 13,7 ±4,7*
Примечание: распределение CD4 и CD8 Т-лимфоцитов по клеточному циклу оценивали в 24-часовых культурах нестимулированных (0) и анти-С03-стимулированных (анти-СОЗ) МНК.
* - достоверность различий в нестимулированных и стимулированных культурах при ри<0,05; # - достоверность различий между донорами и больными при ри<0,05.
сепсисе с увеличением количества С04+СБ25+ клеток и обладают ли энергичные Т-клетки супрессорной активностью.
Сравнительный анализ относительного содержания СБ4+СВ25+Т-клеток в группе 16 здоровых доноров и 11 больных с сепсисом выявил достоверное увеличение доли СЭ4+СБ25+ Т-клеток при сепсисе. Так, у здоровых доноров относительное количество СБ4+СБ25+ Т-клеток составляло в среднем 5,3 ±
0,5%, варьируя от 1 до 10%. В то же время у больных с сепсисом процентное содержание СБ4+СБ25+ Т-клеток варьировало от 2 до 20% и составляло в среднем 12,8 ± 1,7% (Р =0,001). Помимо 2-кратного увеличения доли С04+СБ25+ Т-клеток у больных отмечалась тенденция к более высокому уровню экспрессии СБ25 молекул на СБ4 Т-клетках (54,4 ± 6,9 га 41,1 ± 4,2 усл.ед. у здоровых доноров). При этом у 50% больных уровень экспрессии СБ25 молекул превышал верхнюю границу квартильного диапазона нормативных значений. Особого внимания заслуживает тот факт, что между количеством С04+СБ25+ Т-клеток и уровнем анти-СОЗ-индуци-рованного пролиферативного ответа выявлялась сильная обратная корреляционная связь (рис.1). Следовательно, можно заключить, что энергичные Т-клетки у больных с хирургическим сепсисом вклю-
чают субпопуляцию С04+СБ25+ Т-лимфоцитов и увеличение их количества сопряжено со снижением пролиферативной реактивности Т-клеток. Обратнэя корреляция с уровнем пролиферэтивного ответа может быть обусловлена, по-видимому, двумя причинами - увеличением в структуре Т-клеток доли ареактивных лимфоцитов и супрессорной активностью последних. При этом, учитывая неспецифический характер супрессорной активности естественных (СБ4+С025+) и индуцибельных (Тг1) энергичных СБ4 Т-клеток можно ожидать, что в последнем случае больные со сниженным анти-СБЗ ответом будут характеризоваться перекрестным снижением ответа и на другие стимулы. Действительно, сравнительный анализ пролиферативного ответа на КонА и ЗЕВ в группах больных со сниженным (<17000 имп/мин; п=59) и относительно сохранным (>17000 имп/мин; п=55) анти-СБЗ-стимулированным ответом показал, что у пациентов с анергией Т-клеток уровень КонА-индуцированной пролиферации был значимо ниже (10720 ± 1323 га 32506 ± 3266 имп/мин; р <0,01). Аналогичным образом, пролиферативный ответ на БЕВ у больных с анергией Т-клеток был также достоверно ниже, чем в оппозитной группе (12329 ± 2151 га 23098 ± 2985 имп/мин; ри<0,01). Причем, между уровнем анти-СБЗ-индуцированной проли-
Табл. 4. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ СЕПСИСОМ, 0ПП03ИТНЫХ ПО УРОВНЮ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА НА АНТИ-С03
Параметры Больные со сниженным анти-СИЗ ответом (п=59) Больные с сохранным анти-СБЗ ответом (п=55) Р
Анти-СЭЗ ответ (имп/мин) 7293 ± 606 30823±1478 Ри<0,01
Возраст 49,5 ±2,1 41,3 ±2,2 Ри<0,01
Пол: - мужчины (%) - женщины (%) 52.5 47.5 61,0 39,0 Р%2 >0,05
Количество пациентов (%), обследованных в - ранний период (<5 дней) - поздний период (>5 дней) 83.0 17.0 76.0 24.0 РХ2 >0,05
Локализация очага инфекции (% больных) - брюшная полость - грудная клетка - мягкие ткани 71,2 22,0 6,8 63,6 27,3 9,1 Рх2 >0,05 РХ2 >0,05 РХ2 >0,05
Тяжелый сепсис/СПОН (%) 67,8 44,5 Рх2 =0,02
Летальный исход (%) 47,5 12,4 РХ2 =0,0006
ферации и ответом на КонА или SEB выявлялась достоверная прямая корреляционная связь (г = 0,8; р<0,01 и г = 0,58; р<0,01, соответственно).
В заключении, чтобы выяснить клиническую значимость анергии Т-клеток у больных хирургическим сепсисом, мы сравнили клинические параметры в группах пациентов со сниженным и сохранным пролиферативным ответом на анти-СБЗ. В качестве клинических критериев оценивали 28-суточная летальность, а также тяжесть полиорганной недостаточности. Как следует из данных таблицы 4, частота развития тяжелого сепсиса с формированием СПОН у больных с анергией Т-клеток была достоверно выше. Практически у половины пациентов этой группы регистрировался летальный исход. В то же время у пациентов с относительно сохранным уровнем пролиферации Т-клеток летальность составила 12,4% (Рс2 =0,0006). Различия в уровне летальности не были связаны с клинической разнородностью сравниваемых групп, поскольку за исключением незначительной разницы в возрасте больные были однородны по полу, локализации первичного очага инфекции и срокам наблюдения.
Для оценки сопряженности анергии Т-клеток с выраженностью СПОН (рис.2) сравнили уровень анти-СБЗ-стимулированного пролиферативного ответа в 4 подгруппах больных. Первую группу составили 9 пациентов с минимальными проявлениями СПОН (2-4 балла по шкале SOFA). В три другие группы вошли пациенты с выраженным СПОН (SOFA>6 баллов) различной степени тяжести (7-8 баллов - 11 пациентов; 9-10 баллов - 9 пациентов; 11 и более баллов 6 пациентов). Как видно, утяжеление синдрома полиорганных нарушений сопровождается прогрессирующим снижением анти-СБЗ-ин-дуцированного пролиферативного ответа. При этом между уровнем пролиферации и степенью тяжести
СПОН по шкале SOFA выявлялась достоверная обратная корреляционная связь (г = -0,45; р=0,02). Таким образом, развитие Т-клеточной анергии у больных с хирургическим сепсисом может играть значительную роль в развитии и прогрессии СПОН и определять неблагоприятный исход.
Обсуждение
Снижение пролиферативного ответа Т-клеток при сепсисе является известным феноменом и рассматривается в качестве неблагоприятного прогностического фактора. Heidecke C.D. с соавт. обнаружили, что угнетение пролиферативной активности Т-клеток при абдоминальном сепсисе развивается с первых дней септического процесса и наиболее выражено в группе больных с летальным исходом [12,13]. Проведенные нами ранее исследования также указывают на выраженное угнетение пролиферативной активности Т-клеток у больных с гнойновоспалительными заболеваниями брюшной и грудной полости, осложненными сепсисом [1, 27]. Этот же факт подтверждается и настоящим исследованием, в котором продемонстрировано, что в 52% случаев пациенты с хирургическим сепсисом имеют выраженное угнетение пролиферативной активности лимфоцитов при стимуляции через Т-клеточный рецептор анти-СБЗ антителами.
Резкое снижение пролиферативной активности Т-клеток при их поликлональной стимуляции может быть обусловлено запуском активационно-индуци-рованной гибели. Действительно, нами и другими авторами продемонстрировано выраженное усиление активационного апоптоза периферических Т-клеток при сепсисе [10, 15]. Тем не менее, в настоящей работе показано, что усиление апоптоза Т-клеток регистрируется как у больных со сниженным, так
25
SOFA (0-4) SOFA (7-8) SOFA (9-10) SOFA (11-17)
Рис. 2. Интенсивность анти-СОЗ-индуцированного пролиферативного ответа у больных с хирургическим сепсисом на фоне прогрессии СПОН. * - достоверность различий по сравнению с группой 1, ри<0,05; U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. В скобках - балл по шкале SOFA
и относительно сохранным уровнем анти-СБЗ ответа. Кроме того, имеются пациенты, у которых глубокое угнетение пролиферативного ответа не связано с повышенным апоптозом. Эти факты склоняют к мысли, что запуск программированной гибели не является ведущей причиной снижения пролиферации Т-клеток.
Угнетение пролиферативной активности Т-кле-ток может быть также обусловлено повышенным уровнем иммуносупрессорных медиаторов, в том числе за счет смещения баланса в сторону ТЬ2 цито-кинов. Известно, что уровень 1Ь-2 при сепсисе снижен [2]. Более того, в модели полимикробного абдоминального сепсиса на мышах показано, что снижение продукции 1Ь-2 и 1РЫ-у сопряжено с усилением продукции 1Ь-4 и 1Е-10 в популяции спленоцитов, что прямо указывает на смещение баланса в сторону ТЬ2 [6, 31]. Смещение баланса в сторону ТЬ2 цито-кинов при системной воспалительной реакции продемонстрировано у больных с травмой, включая ожоговую травму [33,24]. В то же время прямые доказательства ТЬ1 /ТЬ2 переключения у больных сепсисом до настоящего времени отсутствуют. С другой стороны, угнетение продукции 1Ь-2 и пролиферативной активности Т-лимфоцитов может отражать анергию Т-клеток. С этой точки зрения одновременное снижение продукции ТЫ и ТЬ2 цитокинов у больных с травмой [ 11 ], а также данные о снижении функции ТЫ клеток на фоне сохранной функции ТЬ2 при абдоминальном сепсисе [13] являются аргументом в пользу анергии Т-клеток.
Проведенные нами исследования показали, что глубокое угнетение продукции 1Ь-2, которое выявлялось у 42% больных со сниженным анти-СБЗ ответом, не связано с повышением продукции 1Ь-4. При этом добавление экзогенного П.-2 приводит к значимому усилению пролиферативной активности в анти-СБЗ-стимулированных культурах МНК. Кроме того, анализ клеточного цикла в субпопуляциях Т-клеток прямо свидетельствует о блоке в СО/ 01 фазе в субпопуляции С04+Т-лимфоцитов. Полученные факты прямо указывают на анергию не вовлеченных в апоптоз Т-клеток и свидетельствуют о том, что анергии при сепсисе подвержены именно СБ4 Т-клетки.
Анергия С04 Т-клеток привлекает в последние годы повышенное внимание в связи с наличием среди СБ4+Т-лимфоцитов естественных и индуцибель-ных регуляторных клеток с супрессорной активностью [20]. С повышенной активностью естественных регуляторных СБ4+СБ25+Т-клеток связывают развитие иммунной недостаточности при злокачественном росте и вирусной инфекции [16, 21, 30]. Участие ин-дуцибельных энергичных СБ4 Т-клеток (Тг1), продуцирующих 1Ь-10 продемонстрировано при хронической бактериальной инфекции [8]. В представленной работе впервые проанализировано содержание
CD4+CD25+ Т-клеток при сепсисе, показано увеличение данной популяции Т-клеток и выявлена обратная корреляционная связь между долей CD4+CD25+ Т-клеток и уровнем анти-СБЗ стимулированного ответа. Эти факты позволяют полагать, что энергичные Т-клетки у больных с хирургическим сепсисом включают субпопуляцию естественных регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью. В пользу такого предположения свидетельствуют также данные о том, что у пациентов с Т-клеточной анергией отмечается выраженное угнетение митогенной реактивности при стимуляции КонА, а также снижение ответа на SEB. Не исключено, что супрессорная активность энергичных Т-клеток обусловлена не только субпопуляцией CD4+CD25+ Т-клеток, но и генерацией CD4 Т-клеток, продуцирующих IL-10. Выяснение этого и других вопросов, связанных с механизмами супрессорной активности энергичных Т-клеток, представляется достаточно актуальным, поскольку анергия Т-клеток имеет важное знэчение в пэтогенезе сепсисэ. Это под-тверждэется выявленной нэми обрэтной корреляционной взаимосвязью между уровнем пролиферативной активности Т-клеток и выраженностью полиор-ганной недостаточности, а также сопряженностью анергии с летальным исходом. Особого внимания в этом направлении заслуживэет выяснение мехзниз-мов формирования анергии при сепсисе, поскольку их раскрытие может способствовать разработке новых иммунотерапевтических подходов.
Благодарности
Авторы выражают признательность Региональному общественному фонду содействия отечественной медицине за поддержку в проведении исследований.
Список литературы
1. Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тюрин И.Н., Останин А.А., Черных Е.Р. Роль апоп-тоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний // Мед. Иммунология,- 2000,-Т. 2, № 1,- с. 35-42.
2. Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Юдина Т.И. Иммунодиагностика и иммунотерапия хирургических инфекций // Int. J. Immunorehabilitation.- 1998,-№ 10.-С.86-99.
3. Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Хонина Н.А., Останин А.А. Апоптоз и анергия периферических Т-лимфоцитов при гнойно-септической патологии // Мед. Иммунология,-1999.-Т.- 1, № 5,- С. 45-51.
4. Черных Е.Р., Сахно Л.В., Хонина Н.А., Тихонова М.А., Кожевников B.C., Никонов С.Д., Жданов
О.А., Останин А.А. Субпопуляционная принадлежность Т-клеток, подверженных анергии и апоптозу
у больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза,- 2002,- № 7,- С. 43-48.
5. Astiz М., Saha D., Lustbader D„ Lin R., Rackow
E. Monocyte response to bacterial toxins, expression of cell surface receptors, and release of anti-inflammatory cytokines during sepsis // I. Lab. Clin. Med.-1996.-Vol. 128, N.6.-P.594-600.
6. Ayala A., Deol Z.K., Lehman D.L., Herdon C.D., Chaudry I.H. Polymicrobial sepsis but not low-dose endotoxin infusion causes decreased splenocyte IL-2/ IFN-g release while increasing IL-4/IL-10 production //J. Surg. Res.-1994.-Vol.56.-P. 579-585.
7. Baecher-Allan C., Brown J.A., Freeman G.J., Hafler D.A. CD4CD25l,jgl' regulatory cells in human peripheral blood //J. Immunol.- 2001.-Vol.167.-P. 1245—1253.
8. Boussiotis V.A., Tsai E.Y., Yunis E.J., Thim S., Delgado J.C., Dascher C.C., Berezovskaya A., Rousset D., Reynes J.M., Goldfeld A.E. IL-10-producingT cells suppress immune responses in anergic tuberculosis patients //J. Clin. Invest.-2000.- Vol. 105.- P.1317—1325.
9. Brandtzaeg P., Osnes L., Ovstebo R., Joo G.B., Westvik A.B., Kierulf P. Net inflammatory capacity of human septic shock plasma evaluated by a monocyte-based target cell assay: identification of interleukin-10 as a major functional deactivator of human monocytes //J. Exp. Med.- 1996.-Vol.184, N.1.-P.51-60.
10. Chernykh H.R., Norkin M.N., Leplina O.Yu., KhoninaN.A., Tihonova M.A., Ostanin A.A. Peripheral T cell apoptosis and its role in generalized bacterial infection (mini-review). // Russian J. Immunology.-2001,-Vol. 6, N2,- P. 131-146.
11. De A.K., Kodys K.M., Pellegrini J., Yeh B., Furse R.K., Bankey P., Miller-Graziano C.L. Induction of global anergy rather than inhibitory Th2 lymphokines mediates posttrauma T cell immunodepression // Clin. Immunol- 2000,- Vol. 96,- P.52-66.
12. Heidecke C.D., Hensler Т., Weighardt H. Selective defects of T lymphocyte function in patients with lethal intraabdominal infection // Am. J. Surg.- 1999.-Vol. 178.-P.288-292.
13. Heidecke C.D., Weighardt H., Hensler Т., Bartels H., Holzmann B. Immune paralysis of T-lympho-cytes and monocytes in postoperative abdominal sepsis. Correlation of immune function with survival // Chirurg.- 2000.-Vol.71.-P. 159-165.
14. Hotchkiss R.C., Swanson P.E., Freeman B.D. Apoptotic cell death in patients with sepsis, shock and multiple organ dysfunction // Crit. Care Med.-1999.-Vol.27.-P. 1230-1250.
15. Hotchkiss R.C., Karl I.E. The Pathophysiology and treatment of sepsis // N.Engl.T.Med.-2003.-Vol. 348.-P.138-150.
16. Iwashiro М., Messer R.J., Peterson K.E., Stromnes
I.М., Sugie Т., Hasenkrug K.J. Immunosuppression by CD4 regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. // PNAS.- 2001.-Vol.98.-P.9226-9230.
17. Jonuleit H., Schmitt E., Stassen M, Tuettenberg A., Knop J., Enk A.H. Identification and functional characterization of human CD4CD25 T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood // J.Exp.Med.- 2001.-Vol. 193.-P. 1285-1294.
18. Jonuleit H., Schmitt E., Schuler G., Knop J., Enk A.H. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4+T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells//J. Exp. Med.-2000,-Vol. 192.-P. 1213-1222.
19. Lederer J.A., Rodrick M.L., Mannick J.A. The effects of injury on the adaptive immune response // Shock.- 1999.-Vol.l 1.-P.153-159.
20. Levings M.K., Sangregorio R., Sartirana C, Moschin A.L., Battaglia M„ Orban P.C., Roncarolo M-G. Human CD25+CD4+T suppressor cell clones produce transforming growth factor {beta}, but not interleukin
10, and are distinct from type 1 T regulatory cells // J.Exp.Med.-2002.-Vol.l96, N10.-P.1335 - 1346.
21. Liyanage U.K., Moore T.T., Joo H.-J., Tanaka Y., Herrmann V., Doherty G„ Drebin J.A., Strasberg S.M., Eberlein T.J., Goedegebuure P.S., Linehan D.C. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma // J. Immunol.- 2002.-Vol.l69.-P.2756-2761.
22. Marshall J.C., Cook D.J., ChristouN.V., Bernard G.R., Sprung C.L., Sibbald W.J. Multiple organ dysfunction score: A reliable descriptor of a complex clinical outcome // Crit. Care Med.-1995.-Vol. 23.-P. 1638-1652.
23. Meakins J.L., Pietsch J.B., Bubenick O. Delayed hypersensitivity: indicator of acquired failure of host defenses in sepsis and trauma. // Ann Surg.- 1977.-Vol.l86.-P.241-250.
24. O ’Sullivan S.T., Lederer J.A., Horgan A.F., Chin D.H.L., Mannick J.A., Rodrick M.L. Major injury leads to predominance of the T helper-2 lymphocyte phenotype and diminished interleukin-12 production associated with decreased resistance to infection // Ann. Surg.- 1995.-Vol.222.-P.482-492.
25. Obenauer-Kutner L.J., Jacobs S.J., Klolz K., Tobias L.M., Bordens R.W. A highly sensitive electrochem-iluminescence immunoassay for interferon alpha-2b in human serum //J. Immunol. Methods.- 1997,- Vol. 206, N 1-2,- P. 25-33.
26. Oberholzer A., Oberholzer C., Moldawer L.L. Sepsis syndromes: understanding the role of innate and acquired immunity // Shock.- 2001.-Vol.l6.-P.83-96.
27. Ostanin A.A., Nikonov S.D., Chernykh H.R. Cytokine-based immunotherapy of severe and generalized surgical infections // Crit. Care International.-1996, N11-12,-P. 13-16.
28. Pellegrini J.D., De A.K., Kodys K., Puyana J.C., Furse R.K., Miller-Graziano C. Relationships between T lymphocyte apoptosis and anergy following trauma. //J. Surg. Res.- 2000,-Vol. 88.-P.200-206.
29. Ross D.D., Joneckis C.C., Ordonez L.V. Estimation of cell survival by flow cytometric quantification of fluorescein diacetate/propidium iodide viable cell number. // Cancer res.- 1989.- Vol.49.- P.3776-3881.
30. Somasundaram R., Jacob L„ Swoboda R, Caputo L., Song H., Basak S., Monos D., Peritt D., Marincola
F., Cai D., Birebent B„ Bloome E„ Kim J., Berencsi K„ Mastrangelo M., Herlyn D. Inhibition of cytolytic T lymphocyte proliferation by autologous CD4+/CD25+ regulatory T cells in a colorectal carcinoma patient is mediated by transforming growth factor-(31. // Cancer Res.-2002.-Vol. 62.-P.5267-5272.
31. Song G.Y., Chung C.S., Chaudry I.H., Ayala A. IL-4-induced activation of the Stat6 pathway contributes to the suppression of cell-mediated immunity and death in sepsis. // Surgery.- 2000,-Vol. 128, N.2.-P.133-138.
32. Thornton A.M., Shevach E.M. CD4+CD25+ im-munoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. / / J. Exp. Med. - 1998.-Vol.l88.-P.287-296.
33. Zedler S., Bone R.C., Baue A.E., Donnersmarck
G.H., Faist E. T-cell reactivity and its predictive role in immunosupression after burns. // Crit. Care Med.-1999.- Vol. 27., N.1-P.66- 73.
поступила в редакцию 08.04.2003 принята к печати 02.07.2003
