CC BY
166
МмРиТмИММГзТбТ Оригинальные статьи
© 2006, СПб РО РААКИ
РЕГУЛЯТОРНЫЕ Т-КЛЕТКИ С СУПРЕССОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ СЕПСИСЕ
Курганова Е.В., Тихонова М.А., Стрельцова Е.И.*, Останин А.А., Черных Е.Р., Козлов В.А.
ГУ НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН, Новосибирск;
Областная клиническая больница г. Новосибирск, Россия
Резюме. Работа посвящена изучению особенностей функционирования регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью при хирургическом сепсисе. Показано, что у больных сепсисом со сниженной Т-клеточной пролиферацией наблюдается увеличение относительного количества CD4+CD25+ лимфоцитов, в том числе CD4 клеток с высокой экспрессией CD25 молекул. При этом между содержанием CD4+CD25+hlgh клеток и пролиферативной активностью мононуклеарных клеток (МНК) больных выявлена обратная корреляционная взаимосвязь. Увеличение доли CD4+CD25+ клеток ассоциируется с появлением супрессорной активности МНК, которая частично отменяется в присутствие экзогенного IL-2. В свою очередь истощение CD25-позитивных клеток приводит к усилению пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Следовательно, снижение Т-клеточной пролиферации при сепсисе сопряжено с накоплением естественных регуляторных Т-клеток (Trn). Наряду с этим получены данные о способности МНК больных опосредовать супрессорную активность через продукцию растворимых факторов, в частности, IL-10. Так, у больных отмечается повышенный уровень продукции IL-10 и увеличение доли CD4 Т-лимфоцитов с внутриклеточным содержанием IL-10, а нейтрализующие антитела к IL-10 частично отменяют супрессорную активность супернатантов МНК. Данные факты позволяют предположить, что наряду с Trn важную роль в иммунопатогенезе сепсиса играют также индуцибельные супрессорные Т-клетки (Tr1).
Ключевые слова: регуляторные Т-клетки, Trn, Tr1, сепсис.
Kurganova E.V., Tikhonova M.A., Streltzova E.I., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kozlov V.A.
REGULATORY T-CELLS WITH SUPPRESSIVE ACTIVITY IN SURGICAL SEPSIS
Abstract. Present work alms to Investigate functioning of the regulatory T-cells with suppressor activity In surgical sepsis. It has been shown that the septic patients with decreased T cell proliferation are characterized by enhanced relative contents of CD4+CD25+ lymphocytes, including CD4+CD25high Moreover, a reverse correlation has been revealed between CD4+CD25high and anti-CD3-induced proliferative response of mononuclear cells (MNC).
Increased ratio of CD4+CD25+ cells is associated with arising suppressive activity of MNC, which is partially abrogated by addition of rIL-2. It should be noted that the depletion of CD25+ subpopulation is accompanied by increased T cell proliferation. Hence, a decrease in T cell proliferative activity in surgical sepsis is coupled with naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T-cells (Trn).
Furthermore, it has been demonstrated that the suppressive activity of MNCs in septic patients is mediated by soluble factors, in particular, IL-10. Indeed, septic patients are characterized by increased level of IL-10 production and enhanced number of CD4+IL-10+ T-cells. Addition of neutralizing anti-IL-10 anti____________________________________________ body partially abrogated the suppressive activity of
Адрес для переписки: MNC supernatants. Thus, our study demonstrated
Черных Е.Р. that inducible regulatory T cells (Tr1) coupled to
630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская 14, the naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T-
НИИклинической иммунологии СО РАМН. cells (Trn) actively contribute to genesis of immune
Тел.: (383) 349-43-29, факс (383) 222-70-28. pathology in sepsis. (Med. Immunol., 2006, vol.8,
E-mail: ct lab @ mail.ru № 1, pp 51-60)
Введение
Течение гнойно-септических заболеваний (ГСЗ) у больных хирургического профиля, особенно на фоне развития синдрома полиорганной недостаточности сопряжено с развитием иммунодепрессии, выраженность которой во многом определяет неблагоприятный исход заболевания [1, 13]. Формирование иммунной недостаточности при ГСЗ может быть обусловлено дисбалансом цитокинов за счет доминирования продукции противовоспалительных/ иммуносупрессорных медиаторов в популяции моноцитов/макрофагов и Th1^Th2 переключения, а также повышенной гибелью иммунокомпетентных клеток вследствие апоптоза [4, 5, 8]. Кроме того, имеются основания полагать, что определенную роль в развитии иммунной недостаточности могут играть регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью. Так, согласно проведенным нами ранее исследованиям и данным литературы пролиферативная активность Т-клеток и продукция IL-2 при стимуляции через Т-клеточный рецептор при ГСЗ существенно снижены, что указывает на состояние анергии Т-лимфоцитов. Причем категория больных с анергией Т-клеток характеризуется более выраженной иммуносупрессией и тяжестью течения бактериальной инфекции по сравнению с оппозитной группой [1, 2, 3, 13]. Характерно, что анергии при ГСЗ подвержены CD4 Т-клетки. Поскольку регуляторные CD4 Т-клетки c супрессорной активностью также характеризуются состоянием анергии [12, 22], можно полагать, что накапливающиеся анергичные Т-лимфоциты при ГСЗ могут включать субпопуляцию регуляторных Т-клеток.
В настоящее время выделяют две категории регуляторных Т-клеток. К первым относят субпопуляцию естественных регуляторных CD4+ Т-клеток (Trn), образующихся в тимусе, характеризующихся высокой экспрессией на своей поверхности рецепторов к a-цепи IL-2 (CD25) и подавляющих иммунный ответ через прямое контактное взаимодействие с клетками-мишенями [6, 9, 7, 28]. Супрессорная активность указанных клеток может быть нивелирована in vitro добавлением больших доз экзогенного IL-2, IL-15 или анти-CD28-антител [9, 26]. Вторая категория представлена индуцибельными регуляторными CD4 Т-клетками, которые формируются на периферии и опосредуют свое действие через продукцию регуляторных факторов. Примером таких клеток являются так называемые регуляторные Т-клетки 1 типа (Tr1). Их супрессорный эффект реализуется через продукцию IL-10 [14, 20]. Повышенный уровень регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью выявлен при онкологических заболеваниях и некоторых формах хронической вирусной инфекции [7, 23, 24, 30]. Однако роль их в патогенезе тяжелых и генерализованных форм внеклеточной бактериальной инфекции остается до сих
пор не изученной. Исходя из вышесказанного, настоящая работа была нацелена на изучение особенностей функционирования естественных и индуци-бельных регуляторных Т-клеток при гнойно-септической патологии.
Материалы и методы
В исследование были включены 54 больных с хирургическим сепсисом (57/43% мужчин и женщин, средний возраст 47,1 ± 3,6 лет). В сформированной группе у 41 пациента (76%) регистрировали абдоминальный, и у 5 (9%) - ангиогенный сепсис. Оставшиеся 8 больных (15%) были оперированы по поводу гнойно-деструктивных заболеваний бронхолегочного аппарата (абсцедирующая пневмония, пиопневмоторакс) и средостения (медиастенит). Диагностика сепсиса в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции основывалась на выявлении 2 и более признаков синдрома системной воспалительной реакции при наличии очага инфекции. Контрольную группу составили 64 здоровых донора крови, сопоставимых по полу и возрасту. Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия.
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верогра-фина. Клетки в концентрации 0,1х106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл ген-тамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров АВ(^) группы крови при 37оС в СО2-инку-баторе. Для стимуляции клеток использовали моноклональные анти-CD3 антитела IC0-90 (анти-CD3, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации
1 мкг/мл или стафилококковый энтеротоксин В (SEB, Sigma, США) в концентрации 200 нг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. В ряде экспериментов культивирование клеток проводили в присутствии IL-2 в указанной концентрации (10, 50 и 100 МЕ/мл «Ронколейкин», «Биотех», СПб). Относительное содержание CD4+CD25+ Т-клеток определяли методом проточной цитофлю-ориметрии на лазерном клеточном сортере-анали-заторе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием FITC-меченных анти-CD4 мАТ («Сорбент-сервис», Москва) и меченных фикоэрет-рином анти-CD25 антител (BD PharMingen, San Diego, США).
Для удаления CD25+ лимфоцитов мононуклеар-ные клетки обрабатывали очищенными мышиными анти-CD25 антителами (Becton Dickinson,
США), затем инкубировали 30 минут с магнитными бусами М-450, нагруженными бараньими IgG антителами против мышиных иммуноглобулинов (Dynal), и далее производили разделение клеток на колонке.
Для оценки супрессорной активности регуляторных клеток их смешивали с МНК доноров (0,1х106/ лунку) в соотношении 1:1 и оценивали пролиферативный ответ последних на анти-CD3 антитела в 3-суточных культурах. Источником регуляторных клеток служили МНК больных сепсисом, преинку-бированные в течение 48 часов в присутствии или отсутствии анти-CD3 (1мкг/мл). Перед добавлением к отвечающим клеткам преинкубированные МНК обрабатывали в течение 45 минут при 37оС митомицином С (40мкг/мл; Serva, Feinbiochemica, Heidelberg, Германия). Индекс супрессорной активности рассчитывали по формуле (1 - А/Б) х 100%, где А - анти-CD3-стимулированный пролиферативный ответ (имп/мин) в опыте (культуры отвечающих клеток, содержащие клетки-регуляторы); Б -анти-CD3-стимулированный пролиферативный ответ в контроле (культуры, содержащие только отвечающие клетки). В этой же серии экспериментов оценивали способность 48 часовых супернатантов больных подавлять пролиферативный ответ отвечающих клеток. Для этого супернатанты стимулированных и нестимулированных МНК больных (50ц1, 30% v/v) добавляли в культуры анти-CD3-стиму-лированных МНК доноров (0,1х106/лунку) и рассчитывали процент супрессии.
Для исследования роли IL-10 в реализации супрессорной активности супернатантов в ряде экспериментов оценивали влияние нейтрализующих анти-^-10 антител (20нг/мл, R&D systems, США) на выраженность супрессии в культурах МНК доноров. Уровень продукции IL-10 в 48 часовых супернатантах нестимулированных и анти-CD3 стимулированных МНК оценивали методом проточной флюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (BioPlex Protein Assay System, Bio-Rad, США, определяемый динамический диапазон 2 - 32000 пкг/мл) с использованием коммерческих тест-систем в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Определение экспрессии внутриклеточных ци-токинов (IL-10, IFNy, IL-4) в МНК периферической крови проводили методом проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson). С целью селективной активации Т-клеток и индукции синтеза цитокинов МНК культивировали в 24-луноч-ных планшетах в течение 4 ч в присутствии фор-болмиристатацетата (РМА, 30 нг/мл, ICN) и ионо-мицина (2мкМ, ICN), а также брефелдина А (10мкг/мл, ICN, блокатора транспорта протеинов из аппарата Гольджи), затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к поверхнос-
тным маркёрам (CD3-APC, CD4-PerCP, CD25-FITC). После пермеабилизации клеток c 0,2% раствором Твин-20 их инкубировали с моноклональными анти-^-10 антителами, коньюгированными с фикоэретрином (BD PharMingen, San Diego,CA, США), или с моноклональными анти-IFNy, коньюгированными с FITC, и с анти-IL^ антителами, меченными PE (Becton Dickinson). Образцы анализировали на проточном цитометре с использованием программы Cellquest. Относительное количество клеток с внутриклеточным IL-10 в популяциях CD4+ и CD4- Т-клеток, в субпопуляциях CD4+CD25+ и CD4+CD25-, оценивались по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. Аналогично оценивали относительное количество IL-4 и IFNy экспрессирующих клеток в популяции CD4-Т-лимфоцитов.
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5.0».
Результаты
Пролиферативный ответ МНК на митогенную стимуляцию
Проведенными ранее исследованиями было показано, что у больных сепсисом пролиферативный ответ лимфоцитов при стимуляции через Т-клеточный рецептор анти-CD3 антителами или стафилококковым энтеротоксином B (SEB) снижен. Причем при индивидуальном анализе выделяется группа больных с выраженным угнетением пролиферации (более чем в 2 раза), которая характеризуется более тяжелым течением и менее благоприятным прогнозом [3]. Данная категория больных была отобрана для изучения регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью. Интенсивность пролиферативного ответа на arn^ CD3 в сформированной группе (n=54) варьировала в диапазоне от 309 до 16640 имп/мин, составляя в среднем 9600 ± 700 имп/мин, что указывало на состояние анергии Т-клеток. Поскольку пролиферативная активность анергичных Т-клеток может быть частично или полностью восстановлена в присутствии экзогенного IL-2 [26], мы исследовали влияние рекомбинантного IL-2 на уровень пролиферации у больных со сниженным анти-CD3 ответом. Добавление IL-2 в субоптимальной дозе (25 МЕ/мл) приводило к усилению ответа у 76% (41/54) обследованных пациентов. В результате интенсивность ответа в целом по группе возрастала с 9600±700 до 14640±1170 имп/мин (pU=0,0001). Следовательно, анергия Т-кле-ток у больных сепсисом является обратимым состоянием и может быть преодолена с помощью экзогенного IL-2.
CD4+CD25+ естественные регуляторные клетки у больных сепсисом
Согласно данным литературы состояние анергии является характерным свойством субпопуляции естественных регуляторных СD4-клеток, ко-экспрес-сирующих рецептор к ^-2 (CD4+CD25+). Поэтому представлял большой интерес анализ количественного содержания CD4+CD25+ клеток у больных сепсисом. У здоровых доноров количество CD4+CD25+ клеток варьировало от 1,0% до 10%, составляя в среднем 4,96±0,41% (п=37), что согласуется с данными литературы [9, 31]. В группе «анергичных» больных с хирургическим сепсисом относительное количество CD4+CD25+ клеток в периферической крови варьировало от 3,9 до 20,1%, составляя в среднем 11,6±0,8%, что более чем в 2 раза превышало средний нормативный уровень (Ри=0,0001).
Следует отметить, что субпопуляция CD4+CD25+ клеток является гетерогенной по интенсивности экспрессии CD25 и функциональной активности. Причем супрессорной активностью обладают преимущественно CD4 Т-клетки с высокой экспрессией CD25 - так называемые CD4+CD25hlgh клетки [7]. Поэтому на следующем этапе был проведен сравнительный анализ содержания именно этой субпопуляции клеток. В группе здоровых доноров относительное количество CD4+CD25hlgh варьировали от 0,25 до 1,38%, составляя в среднем 0,88±0,09% (п=12). У больных с анергией Т-клеток содержание данной субпопуляции колебалось от 0,43 до 5,0%, превышая в среднем в 2,5 раза аналогичный показатель у доноров (2,21±0,38%; п=13; ри=0,0019). Интересно, что при проведении корреляционного анализа интенсивность aнти-CD3-идуцированной пролиферации МНК обратно коррелировала только с субпопуляцией CD4+CD25hlgh клеток (г = -0,56; р<0,05), но не с общей субпопуляцией CD4+CD25+ Т-клеток. Таким образом, можно полагать, что угнетение пролиферативного ответа в группе «анер-гичных» больных ассоциируется с накоплением естественных регуляторных клеток.
Для выяснения причастности CD25-позитивных регуляторных Т-клеток к негативной регуляции ответа на анти-CD3 было исследовано влияние истощения CD25+ клеток на уровень анти-CD3-инду-цированной пролиферации в культурах МНК здоровых доноров и больных сепсисом (рис.1). Эффективность деплеции CD25 клеток оценивалась по относительному количеству CD4+CD25+ клеток до и после разделения МНК на колонке с магнитными бусами. Количество CD4+CD25+ клеток после удаления фракции CD25-позитивных лимфоцитов снижалось с 9,62±2,46% до 2,4±0,76% (п=4; р<0,05) в группе больных и с 3,86±0,39% до 0,99±0,43% (п=5; р<0,001) в группе здоровых доноров. Известно, что максимальный ответ при стимуляции анти-CD3
регистрируется на 3 сутки, в то время как к 6 суткам уровень пролиферации снижается, что может быть связано с активацией регуляторных Т-клеток. Поэтому анализ пролиферативного ответа проводили в 3- и 6-суточных культурах МНК. Истощение CD25-позитивных клеток у здоровых доноров сопровождалось тенденцией к увеличению пролиферативного ответа МНК на 3 сутки, однако наиболее выраженное и значимое усиление ответа по сравнению с культурами несепарированных МНК отмечалось на 6 сутки. Так, пролиферативный ответ МНК после удаления CD25-клеток возрастал в 3 раза (р=0,0006). В то же время интенсивность пролиферации в культурах, обогащенных CD25+ лимфоцитами (клетки, элиюрованные с колонки) была практически полностью ингибирована как на 3, так и на 6 сутки.
У больных сепсисом с исходно низким пролиферативным ответом на 3 сутки истощение CD25-по-зитивных клеток во всех 4 экспериментах приводило к достоверному усилению анти-CD3-стимулиро-ванной пролиферации, которая в культурах СD25-истощенных клеток была в среднем в 3,5 раза выше по сравнению с пролиферативным ответом несепа-рированных МНК (ри=0,049). Следовательно, можно предположить, что анти-CD3-стимулированный ответ находится под контролем регуляторных Т-клеток, ко-экспрессирующих CD25 молекулы. У здоровых доноров эти клетки принимают участие в ограничении ответа Т-клеток при стимуляции через Т-клеточный рецептор, а у больных сепсисом в силу увеличения их численности детерминируют подавление пролиферации Т-клеток.
Поскольку МНК больных являются источником повышенного содержания CD4+CD25+ клеток, в следующей серии экспериментов была также исследована супрессорная активность МНК «анергичных» больных в сравнении с таковой у здоровых доноров. Для этого оценивали влияние нестимулированных и активированных анти-CD3 в течение 48 ч МНК больных на интенсивность aнти-CD3-стимулиро-ванной пролиферации МНК здоровых доноров. Нестимулированные и активированные анти-CD3 МНК больных перед внесением в культуры МНК доноров обрабатывали митомицином С. Как следует из данных рис.2, нестимулированные МНК доноров практически не обладали супрессорной активностью, в то время как МНК больных подавляли интенсивность пролиферации МНК доноров в среднем на 42%. Индивидуальный анализ данных показал, что супрессорная активность более 20% выявлялась у 8 из 9 (89%) больных, тогда как в группе доноров (п=8) не встречалась ни у одного индивидуума. После активации анти-CD3-антителами супрессорная активность МНК больных возрастала с 42% до 54%, (п=7, р=0,04) и была достоверно выше, чем у здоровых доноров (ри=0,015). Характерно, что
супрессорная активность анти-CD3-стимулирован-ных МНК, проанализированная в группе 15 больных сепсисом (в том числе 8 «ареактивных» и 7 «реактивных» пациентов), коррелировала с относительным содержанием CD4+CD25+ клеток (г = 0,55; р=0,03).
Известно, что супрессорная активность, опосредованная Тгп клетками, может нивелироваться при добавлении экзогенного ^-2. Поэтому следующим этапом нашей работы стало исследование влияния ^-2 на супрессорную активность МНК анергичных больных. Как следует из данных рис. 3, добавление в тест культуры ^-2 уменьшало супрессорную активность нестимулированных и aнти-CD3-активи-рованных МНК в среднем на 14-36% и 25-45%, соответственно. Подавление супрессорной активности МНК наблюдалось уже при добавлении ^-2 в концентрации 10 МЕ/мл, и было максимальным при использовании ^-2 в дозе 50 МЕ/мл. Следовательно, добавление экзогенного ^-2 частично уменьшает супрессорную активность МНК, но не отменяет ее полностью. Полученные результаты о повышенном содержании CD4+CD25+ Т-клеток, наличии супрессорной активности МНК у этих пациентов и ее снижение в присутствии экзогенного ^-2 свидетельствуют о возможной роли Тгп в угнетении пролиферативной активности Т-клеток у больных хирургическим сепсисом с Т-клеточной анергией.
^1 клетки у больных сепсисом
Наряду с Тгп супрессорной активностью среди анергичных CD4 Т-клеток могут обладать индуци-бельные регуляторные Т-клетки - Тг1. Супрессорная активность указанных клеток реализуется через продукцию растворимых факторов, в частности ^-10. Поэтому далее мы исследовали, может ли супрессорная активность МНК «анергичных» больных реализоваться через продукцию растворимых факторов, для чего проанализировали влияние супернатантов (30%, v/v) МНК больных на анти-CD3-индуцированную пролиферацию Т-клеток здоровых доноров. Оказалось, что в преобладающем большинстве случаев (у 8 из 9 пациентов) супрессорной активностью обладали не только сами клетки больных, но и полученные от них 48-часовые супернатанты. При этом выраженность супрессорной активности растворимых факторов, продуцируемых нестимули-рованными и анти-CD3-активированными МНК больных, варьировала от 35 до 58%, что более чем в
2 раза превышало аналогичные показатели у здоровых доноров (16 - 22%, ри<0,01).
Чтобы выяснить, связана ли супрессорная активность супернатантов с ^-10, на следующем этапе исследовали уровень спонтанной и анти-CD3-сти-мулированной продукции ^-10 в группе «анергичных» больных и здоровых доноров. Анализ получен-
ных данных (табл. 1) показал, что спонтанная продукция ^-10 у здоровых доноров практически соответствовала пороговым значениям метода. У больных концентрация ^-10 в нестимулированных культурах МНК была выше, однако не достоверно. Стимуляции анти-CD3 сопровождалась усилением продукции ^-10. При этом уровень стимулированной продукции ^-10 у больных был в 2 раза выше, чем у доноров. Важно отметить, что увеличение уровня ^-10 у больных сепсисом не было связано с ТЫ^^2 переключением. Так, исследование относительного количества СD4 Т-клеток с внутриклеточной экспрессией №N7 и ^-4 показало, что по сравнению с донорами у больных сепсисом регистрировалось одновременное снижение CD4 клеток с внутриклеточной экспрессией №N7 (14,8±4,1 vs 23,4±1,9% у доноров, р<0,05) и ^-4 (0,93±0,3 vs
3,2±0,35% у доноров; р<0,05). Следовательно, увеличение продукции ^-10 у анергичных больных могло быть обусловлено увеличением доли Тг1 клеток. Чтобы оценить возможную роль ^-10 в реализации супрессорной активности, в следующей серии экспериментов исследовали влияние нейтрализующих анти-^-10 антител на супрессорную активность супернатантов, полученных от нестимулиро-ванных МНК больных. Добавление анти-^-10 антител в концентрации 20 мкг/мл снижало супрессорную активность анализируемых супернатантов в среднем с 55±6 до 44±6% (п=7; р<0,05). Следовательно, ^-10 играет, по-видимому, существенную роль в опосредовании супрессорной активности МНК больных, хотя является не единственным медиатором супрессии.
Чтобы убедиться, что супрессорная активность, опосредованная ^-10, связана именно с субпопуляцией Тг1 клеток, далее мы исследовали относительное количество CD4 Т-клеток с внутриклеточной экспрессией ^-10. У здоровых доноров относительное содержание CD4+IL-10+ клеток составляло в среднем 0,61±0,09% (п=15). Доля указанной субпопуляции у больных варьировала от 0,21 до 5,66%, и в среднем в 3 раза превышала аналогичный показатель доноров (2,11±0,23%; п=13, ри=0,0005). Следовательно, можно полагать, что Тг1 клетки принимают участие в ^-10-опосредованной супрессии у больных сепсисом с Т-клеточной анергией. Следует отметить, что до настоящего времени не определены специфические фенотипические маркеры, позволяющие идентифицировать регуляторные Т-клетки, в том числе дифференцировать Тгп и Тг1 клетки. Молекула CD25 не является специфичной молекулой для Тгп клеток и служит одновременно маркером клеточной активации. В этой связи до сих пор не ясно, являются ли Тг1 CD25-позитивными клетками или они не несут указанный антиген [17]. Исследование ^-10 продуцирующих клеток в субпопуляциях CD4+CD25+ и CD4+CD25- показало,
Рис. 1. Влияние истощения/обогащения CD25+ лимфоцитов из популяции МНК здоровых доноров и анергичных больных сепсисом на уровень анти-CD3-стимулированного пролиферативного ответа. Несепарированные (белые), истощенные по 0025 (серые) и обогащенные 0025+ (черные столбики) популяции МНК здоровых доноров и больных стимулировали анти-003 антителами (1мкг/мл). Интенсивность пролиферации оценивали на третьи (3) и шестые (6) сутки по включению 3Н-тимидина. Результаты представлены в виде средних значений, полученных от пяти доноров (А) и четырех больных (Б) в отдельных экспериментах.
50 -
40 -
30 -
20 -
10 -
□ доноры
□ больные
МНК-0
МНК-антиОР3
Рис. 2. Супрессорная активность нестимулированных (МНК-0) и анти^3-активированных МНК (МНК-антиCD3) доноров и больных сепсисом. МНК больных и доноров культивировали в течение 48 ч в отсутствии и в присутствии анти-003 (1мкг/мл), отмывали RPMI, обрабатывали митомицином С (40мкг/мл) и добавляли в соотношении 1:1 в культуры МНК здоровых доноров, стимулированных анти-003-антителами. Интенсивность пролиферации оценивали на 3 сутки. Данные представлены в виде процента супрессии.
*
*
0
Рис. 3. Влияние ^-2 на супрессорную активность нестимулированных МНК (МНК-0) и активированных анти^3 МНК (МНК-антиCD3) анергичных больных сепсисом. При совместном культивировании нестимулированных (или активированных) МНК больных с МНК доноров (в соотношении 1:1) добавляли 1Ь-2 в разных концентрациях (10, 50 и 100 МЕ/мл) и оценивали пролиферативный ответ на стимуляцию анти-СОЗ антителами.
что ^-10+-клетки выявлялись в равной степени как среди СD4+CD25+, так и среди СD4+CD25- клеток. Однако количество их у больных сепсисом было достоверно выше, чем у доноров. Так, относительное количество ^-10+ клеток во фракции СD4+CD25+ составило соответственно 0,95±0,26% (п=13) vs
0,19±0,07% (п = 7, ри=0,007), а во фракции CD4+CD25- клеток 1,0 ± 0,23% (п=13) vs 0,16 ± 0,06% (п=6, ри=0,01). Следовательно, CD4+ ^-10 продуцирующие клетки, увеличение которых регистрируется при сепсисе, могут быть представлены как СD25+, так и CD25- Т-клетками.
Обсуждение
Полученные в целом данные впервые демонстрируют, что угнетение пролиферативной активности Т-клеток при сепсисе ассоциировано с накоплением регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью. Согласно данным литературы регуляторные Т-клетки представлены гетерогенной популяцией, среди которой выделяют, по меньшей мере, естественные и индуцибельные регуляторные Т-клетки. Одним из фенотипических признаков Тгп является экспрессия CD25 маркера, на основании чего данную субпопуляцию идентифицируют как CD4+CD25+ [15, 27]. Причем в отличие от активированных Т-клеток, которые также экспрессируют CD25, супрессорной активностью у человека обла-
дают CD4+ клетки, характеризующиеся высокой экспрессией CD25 - так называемые CD4+CD25+hlgh [7]. Согласно полученным нами данным относительное количество CD4+CD25+ лимфоцитов, в том числе с высокой экспрессией CD25 молекул, у больных с хирургическим сепсисом в группе ареактивных пациентов значимо выше, что ассоциировано с появлением выраженной супрессорной активности МНК при их сокультивировании с клетками здоровых доноров. Кроме того, удаление CD25-позитив-ных лимфоцитов приводит к усилению пролиферативной активности Т-клеток, а между содержанием CD4+CD25+hlgh клеток и пролиферативной активностью в культурах анти-CD3-стимулированных МНК у больных выявляется достоверная обратная корреляционная связь. Все эти факты указывают на то, что супрессорная активность МНК при сепсисе реализуется с участием Тгп. Как известно, супрессорная активность CD4+CD25+ клеток связана с их способностью подавлять продукцию ^-2 отвечающими клетками. Поэтому в присутствии экзогенного ^-2 супрессорная активность CD4+CD25+ нивелируется [9]. Проведенные нами исследования показали, что добавление экзогенного ^-2 снижает супрессорный эффект МНК больных, но не отменяет его полностью, что с одной стороны указывает на вовлечение Тгп, а с другой - возможное присутствие наряду с Тгп других типов супрессорных клеток, например Тг1.
Табл.1. УРОВЕНЬ ПРОДУКЦИИ 1Ы0 В КУЛЬТУРАХ НЕСТИМУЛИРОВАННЫХ И АНТИ-СОЗ-АКТИВИРОВАННЫХ МНК БОЛЬНЫХ СЕПСИСОМ И ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ
Г руппы Концентрация 11_-10 (пг/мл)
0 Aнти-СD3-антитела
Доноры (п=8) 1,9 ± 0,95 32 ± 7,9
Больные (п=7) 11,6 ± 6,8 61,4 ± 10,9*
Примечание: * -Ри<0,05 - достоверность различий по сравнению с донорами, и - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
Как известно, значительную роль в генерации и реализации супрессорной активности Тг1 играет ^-10 [20]. Поэтому добавление анти-^-10 антител в культуру блокирует генерацию Тг1 клеток и отменяет их супрессорный эффект. При этом подобно Тгп-клеткам Тг1 характеризуются состоянием анергии, т.е. не отвечают пролиферацией в ответ на стимуляцию через Т-клеточный рецептор [21, 25]. В настоящей работе показано, что супрессорной активностью у больных сепсисом со сниженной пролиферативной активностью Т-клеток обладают не только сами МНК, но и полученные от них супернатанты. Причем добавление нейтрализующих антител к ^-10 снижает супрессорную активность, опосредуемую растворимыми факторами. Эти факты указывают на возможное участие Тг1 в реализации иммуносупрессии при сепсисе. Подтверждением данного предположения являются полученные нами данные о повышенном уровне продукции ^-10 и увеличением доли CD4 Т-клеток с внутриклеточной экспрессией ^-10. Усиление продукции ^-10 Т-клетками может быть результатом ТЫ/^2 переключения. Однако проведенные в работе исследования количественного содержания CD4 Т-клеток с внутриклеточной экспрессией ^-4 и №N7 показали, что анергии в группе аре-активных больных сепсисом подвержены как ТЫ, так и ^2 клетки. В этом случае CD4 Т-лимфоциты с внутриклеточным содержанием ^-10 можно расценивать как Тг1 клетки.
Одновременное увеличение естественных и ин-дуцибельных регуляторных Т-клеток представляется вполне вероятным, поскольку указанные субпопуляции Т-клеток находятся в тесных взаимоотношениях [18]. Так, известно, что Тгп способствуют развитию анергии в популяции CD4+CD25- клеток [11] и индуцируют генерацию регуляторных Т-кле-ток, опосредующих свою активность через продукцию ^-10 (Тг1) и TGF-P (Тг2) [10, 11, 16]. Какой из типов регуляторных Т-клеток будет генерироваться, в определенной степени зависит от экспрессии интегринов на CD4+CD25+ регуляторных клетках [17, 19]. Тот факт, что индуцированная супрессорная активность может опосредоваться через TGF-p, заслуживает на наш взгляд особого внимания [16]. Возможно именно этим обстоятельством объясняется неполное подавление супрессорной активности Т-клеток больных сепсисом в присутствие нейтрализующих антител к ^-10.
Одной из серьезных проблем являются трудности в дифференцировании естественных и индуцированных регуляторных клеток. Обе субпопуляции представлены CD4 Т-клетками, находящимися в состоянии анергии. В отношении экспрессии CD25 Тг1 клетками данные противоречивы. Некоторые авторы полагают, что CD25 экспрессируется на естественных регуляторных Т-клетках и не экспрессируется на Тг1 [27], тогда как другие полагают, что
CD25 молекулы могут присутствовать на Тг1 клетках [17]. Согласно полученным нами данным СD4 Т-клетки с внутриклеточной экспрессией ^-10 обнаруживаются как среди CD4+CD25+, так и CD4+CD25- клеток. Таким образом, маркер СD25 не может использоваться для идентификации этих субпопуляций. Одним из характерных признаков Тгп является экспрессия фактора транскрипции FoxP3 [29]. Однако проведенные впоследствии исследования показали, что FoxP3 также выявляется и в субпопуляции индуцибельных регуляторных Т-клеток
и, следовательно, не может быть использован для разграничения указанных субпопуляций регуляторных клеток. Таким образом, прямых маркеров, позволяющих точно разграничить количественное соотношение естественных и индуцибельных регуляторных Т-клеток на сегодняшний день не существует. Наиболее приемлемым подходом к идентификации Тгп, исходя из результатов наших исследований, может быть подсчет CD4 Т-клеток с высокой экспрессией CD25 в случае, если имеются прямые или косвенные подтверждения их супрессорной активности. В свою очередь Тг1 можно идентифицировать по количеству CD4 Т-клеток с внутриклеточной экспрессией ^-10, если при этом Т-клетки характеризуются выраженным угнетением пролиферативной активности при стимуляции через Т-кле-точный рецептор, и их супрессорная активность реализуется через растворимые факторы. Однако и эти подходы, по-видимому, не позволяют однозначно судить о количестве Тгп и Тг1.
Вместе с тем можно с уверенностью утверждать, что при сепсисе угнетение пролиферативного ответа Т-клеток при стимуляции анти-CD3 антителами сопряжено с накоплением регуляторных Т-клеток, обладающих свойствами как Тгп, так и Тг1 клеток.
Список литературы
1. Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тюрин И.Н., Останин А.А., Черных Е.Р. Роль апоп-тоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний // Медицинская иммунология.-
2000.- Т. 2, № 1.- С. 35-42.
2. Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Хонина Н.А., Останин А.А. Апоп-тоз и анергия периферических Т-лимфоцитов при гнойно-септической патологии. // Медицинская иммунология.- 1999.- Т. 1, № 5.- С. 45-51.
3. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Курганова Е.В., Стрельцова Е.И., Останин А.А., Козлов В.А. Феномен Т-клеточной анергии при хирургическом сепсисе. // Медицинская иммунология.-
2003.- Т.- 5, № 6.- С. 529-538.
4. Astiz M., Saha D., Lustbader D., Lin R., Rackow
E. Monocyte response to bacterial toxins, expression
of cell surface receptors, and release of anti-inflammatory cytokines during sepsis. // J. Lab. Clin. Med.-1996.- Vol. 128, № 6.- P. 594-600.
5. Ayala A., Deol Z.K., Lehman D.L., Herdon C.D., Chaudry I.H. Polymicrobial sepsis but not low-dose endotoxin infusion causes decreased splenocyte IL-2/ IFN-y release while increasing IL-4/IL-10 production../ / J. Surg. Res.- 1994.- Vol. 56.- P. 579-585.
6. Baecher-Allan C., Brown J.A., Freeman G.J., Hafler D.A. CD4+CD25hlgh regulatory cells in human peripheral blood. // J. Immunology.- 2001.- Vol. 167.-P. 1245-1253.
7. Baecher-Allan C., Hafler D.A. Suppressor T cells in human diseases. // J. Exp. Med.- 2004.- Vol. 200, №
3.- P. 273-276.
8. Chernykh H.R., Norkin M.N., Leplina O.Yu., Khonina N.A., Tihonova M.A., Ostanin A.A. Peripheral T cell apoptosis and its role in generalized bacterial infection (mini-review) // Russian J. Immunology.-2001.- Vol. 6, № 2.- P. 131-146.
9. Dieckmann D., Ploettner H., Berchtold S., Berger T., Schuler G. Ex vivo isolation and characterization of CD4+CD25+ T cells with regulatory properties from human blood. // J. Exp. Med.- 2001.- Vol. 193, № 11.-P. 1303-1310.
10. Dieckmann D., Bruett C.H., Ploettner H., Lutz M.B., Schuler G. Human CD4+CD25+ regulatory, contact-dependent T cells induce interleukin 10-produc-ing, contact-independent type 1-like regulatory T cells. // J. Exp. Med.- 2002.- Vol. 196, № 2.- P. 247-253.
11. Ermann J., Szanya V., Ford G.S., Paragas V., Fathman C.G., Lejon K. CD4+CD25+ T cells facilitate the induction of T cell anergy. // J. Immunology.-
2001.- Vol. 167, № 8. - P. 4271 - 4275.
12. Fehervari Z., Sakaguchi S. CD4+ Tregs and immune control. // J. Clin. Invest.- 2004.- Vol. 114, № 9.- P. 1209-1216.
13. Heidecke C.D., Hensler T., Weighardt H., Zantl N., Wagner H., Siewert J.R., Holzmann B. Selective defects of T lymphocyte function in patients with lethal intraabdominal infection. // Am. J. Surg.- 1999.-Vol. 178.-P. 288-292.
14. Jonuleit H., Schmitt E., Schuler G., Knop J., Enk
A.H. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4+ T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. // J. Exp. Med.- 2000.- Vol. 192.- P. 1213-1222.
15. Jonuleit H., Schmitt E., Stassen M., Tuerren-berg A., Knop J., Enk A.H. Identification and functional characterization of human CD4+CD25+ T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood. // J. Exp. Med.- 2001.- Vol. 193, № 11.- P. 1285-1294.
16. Jonuleit H., Schmitt E., Kakirman H., Stassen M., Knop J., Enk A.H. Infectious tolerance: human CD25+ regulatory T cells convey suppressor activity
to conventional CD4+ T helper cells. // J. Exp. Med.-
2002.- Vol. 196, №2.- P. 255-260.
17. Jonuleit H., Schmitt E. The regulatory T cell family: distinct subsets and their interrelations. // J. Immunology.- 2003.- Vol. 164.- P. 6323-6327.
18. Karim M., Kingsley C.I., Bushell A.R., Sawitzki
B.S., Wood KJ. Alloantigen-induced CD25+CD4+ regulatory T cells can develop in vivo from CD25-CD4+ precursors in a thymus-independent process. // J. Immunology.- 2004.- Vol. 172.- P. 923-928.
19. Lehmann J., Huehn J., de la Rossa M., Maszyna
F., Kretschemer U., Krenn V., Brunner M., Scheffold A., Hamann A. Expression of the integrin aEP7 identifies unique subsets of CD25+ as well as CD25- regulatory T cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002.- Vol. 99.- P. 13031-13036.
20. Levings M.K., Roncarolo M.G. T-regulatory 1 cells: a novel subset of CD4 T cells with immunoregu-latory properties. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2000.-Vol. 106.- P. 109-112.
21. Levings M.K., Sangregorio R., Sartirana C., Moschin A.L., Battaglia M., Orban P.C., Roncarolo M.G. Human CD4+CD25+T suppressor cell clones produce transforming growth factor p, but not Il-10, and are distinct from type 1 T regulatory cells. // J. Exp. Med.- 2002.- Vol. 196, № 10.- P. 1335-1346.
22. Maloy K.J., Powrie F. Regulatory T cells in the control of immune pathology. // Nature.- 2001.- Vol.
2, № 9.- P. 816-822.
23. Mittrtcker H.-W., Kaufmann S.H.E. Regulatory T cells and infection: suppression revisited. // Eur. J. Immunology.- 2004.- Vol. 34.- P. 306-312.
24. Rouse B.T., Suvas S. Regulatory cells and infectious agents: dfttentes cordiale and contraire. // J. Immunology.- 2004.- Vol. 173.- P. 2211-2215.
25. Schwartz R.H. T cell anergy. // Annu. Rev. Immunol.- 2003.- Vol. 21.- P. 305-334.
26. Shevach E.M. Certified professionals: CD4+ CD25+ suppressor T cells. // J. Exp. Med.- 2001.- Vol. 193, N 11.- P. 41-45.
27. Shevach E.M. CD4+CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. // Nature Reviews Immunology.- 2002.- Vol. 2, № 6.- P. 389-400.
28. Thornton A.M., Shevach E.M. Suppressor effector function of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific. // J. Immunology.- 1999.- Vol. 164.- P. 183-190.
29. Yagi H., Nomura T., Nakamura K., Yamazaki S., Kitawaki T., Hori S., Maeda M., Onodera M., Uchiya-ma T., Fujii S., Sakagushi S. Crucial role of FOXP3in the development and function of human CD4+CD25+ regulatory T cells. // International Immunology.-2004.- Vol. 16.- P. 1643-1656.
30. Wolf A.M., Wolf D., Steurer M., Gastl G., Gun-silius E., Grubeck-Loebenstein B. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients. // Clin. Canser Research.- 2003.- Vol. 9.- P. 606-612.
31. Zou L., Barnett B., Safah H., LaRussa V.F., Ev-domon-Hogan M., Mottram P., Wei S., David O., Cu-riel T.J., Zou W. Bone marrow is a reservoir for
CD4+CD25+ regulatory T cells that traffic through CXCL12/CXCR4 signals. // J. Canser Research.-
2004.- Vol. 64.- P. 8451-8455.
поступила в редакцию 25.10.2005 принята к печати 18.11.2005
