CC BY
141
Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 1-2, стр. 59-66 © 2012, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
РО-1/В7-И1-ОПОСРЕДОВАННАЯ ПРО-АПОПТОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК КАК ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ НАРУШЕНИЯ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
Сахно Л.В.1, Тихонова М.А.1, Тыринова Т.В.1, Леплина О.Ю.1, Никонов С.Д.2, Жданов О.А.2, Останин А.А.1, Черных Е.Р.1
1 НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
2 ОГУЗ Новосибирская клиническая туберкулезная больница № 1, г. Новосибирск
Резюме. Целью работы явилось изучение PD-l/87-Ш-сигнального пути индукции апоптоза и анергии Т-клеток, как одного из возможных механизмов снижения антиген-специфического ответа против M. tuberculosis. Было обследовано 76 больных туберкулезом легких (ТБЛ), различающихся по уровню ответа на туберкулиновый очищенный белковый дериват (PPD). Установлено, что у больных ТБЛ дендритные клетки (ДК), генерированные in vitro из моноцитов крови в присутствии GM-CSF+IFNa, характеризуются повышенной экспрессией В7-Н1, высоким уровнем продукции IL-10 и низкой аллостимуляторной активностью в СКЛ. Показано также, что ДК больных ТБЛ усиливают апоптоз и блокируют клеточное деление Т-лимфоцитов в алло-СКЛ. Таким образом, ДК больных ТБЛ обладают повышенным толерогенным потенциалом, поскольку через PD-1/B7-H1-сигнальный путь в комбинации с IL-10 индуцируют апоптоз/анергию отвечающих Т-клеток. Нейтрализующие aнти-PD1-aнтителa частично отменяют про-апоптогенный/толерогенный эффект ДК. Выявленный феномен, очевидно, имеет клиническое значение, поскольку наиболее ярко проявляется у больных ТБЛ с низким антиген-специфическим ответом на PPD.
Ключевые слова: B7-H1, дендритные клетки, PD-1, Т-клетки, апоптоз, туберкулез легких.
Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Tyrinova T.V., Leplina O.Yu., Niconov S.D., Zhdanov O.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.
THE PD-1/B7-H1-MEDIATED PRO-APOPTOTIC ACTIVITY OF DENDRITIC CELLS AS A POSSIBLE
mechanism of antigen-specific response failure in patients with pulmonary TuBERCuLOSIS
Abstract. The aim of present study was to investigate PD-1/B7-H1-mediated induction of T-cell apoptosis/ anergy, a suggested mechanism of reduced antigen-specific immune response against M. tuberculosis. We
Адрес для переписки:
Сахно Людмила Васильевна,
НИИ клинической иммунологии СО РАМН 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. Тел.: (383) 236-03-29.
E-mail: ct lab@mail.ru
examined 76 patients with pulmonary tuberculosis (PT) who differed in levels of proliferative response to specific antigen (purified protein derivative, PPD). It was revealed that in vitro generated dendritic cells (DCs) from the patient’s blood monocytes with GM-CSF+IFNa, were characterized by increased B7-H1 expression, upregulation of IL-10 production, and
59
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
reduced allostimulatory activity in mixed lymphocyte culture (MLC). Moreover, DCs of PT patients were able to enhance T-cell apoptosis, and to block T-cell division in MLC. Thus, the patients’ DCs exhibited the higher tolerogenic potential since these DCs could induce apoptosis/anergy in responsive T-cells via PD-1/ B7-H1-mediated pathway combined with IL-10 effects. It was shown that neutralizing anti-PDl-antibodies partially abolished the pro-apoptogenic/tolerogenic effect of DCs. The revealed phenomenon of PD-1/B7-H1-mediated pro-apoptogenic activity should be of obvious clinical significance, since the cytotoxic/tolerogenic potential of DCs was especially pronounced in the patients with low antigen-specific response to PPD. (Med. Immunol., 2012, vol. 14, N1-2,pp 59-66)
Keywords: B7-H1, dendritic cells, PD-1, Т-cells, apoptosis, pulmonary tuberculosis.
Введение
Известно, что запуск программы апоптоза Т-лимфоцитов происходит через рецептор программированной клеточной смерти (PD-1), который относится к семейству CD28/CTLA-4 молекул и появляется на мембране CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов после их активации через Т-клеточный рецептор. Идентифицированы два типа лигандов для PD-1, один из которых, обозначенный как PD-L2 (B7-DC или CD273), является индуцибельным и обнаруживается на дендритных клетках (ДК), макрофагах (Мф) и культивированных тучных клетках костномозгового происхождения [12]. Другой лиганд — PD-L1 (B7-H1 или CD274) конститутивно экспрессируется на Т- и В-клетках, ДК и Мф, тем не менее уровень экспрессии B7-H1 может также повышаться на активированных клетках [10, 12].
Многие микроорганизмы, которые вызывают хроническую инфекцию, используют PD-1/ В7-Н1-опосредованный путь индукции апоптоза Т-клеток с целью выключения эффекторных иммунных реакций хозяина [5, 12, 15]. При перси-стирующих инфекциях генерируются толероген-ные ДК/Мф с повышенной экспрессией B7-H1 и низкой экспрессией костимуляторных молекул CD80 и CD86. В свою очередь, на Т-лимфоцитах, активированных антигенами патогенных микроорганизмов, повышается экспрессия рецептора PD-1. Связывание PD-1 с PD-L1 через определенные сигнальные пути может приводить к повышенной гибели антиген-специфических лимфоцитов [7, 12]. Про-апоптогенная/цитоток-сическая функция ДК, особенно генерируемых в присутствии интерферона-а (IFNa), активно обсуждается в последние годы в связи с выявленной способностью ДК лизировать клетки различных опухолевых линий [14]. Однако возможное участие PD-1/B7-H1 сигнального пути в нарушении антиген-специфического ответа у больных туберкулезом легких (ТБЛ) остается практически не изученным.
Многочисленными работами, а также нашими собственными исследованиями показано, что повышенный апоптоз и анергия Т-клеток являются характерным атрибутом туберкулез-
ной инфекции [1, 2, 3, 9]. C другой стороны, ДК больных ТБЛ, генерируемые из моноцитов крови в присутствии IFNa, характеризуются признаками толерогенной активности, в частности повышенной продукцией IL-6 и IL-10 и сниженной аллостимуляторной активностью в смешанной культуре лимфоцитов [1]. Следует отметить, что IL-10 обладает стимулирующим влиянием на экспрессию B7-H1 [6]. Учитывая эти факты, мы предположили, что апоптоз/анергия Т-клеток при туберкулезной инфекции могут быть результатом активации PD-1/B7-H1 сигнального пути при взаимодействии Т-лимфоцитов с ДК. При таком представлении про-апоптогенная/цито-токсическая активность ДК может являться одним из возможных механизмов нарушения анти-ген-специфического иммунного ответа против M. tuberculosis. Настоящая работа была посвящена проверке высказанной гипотезы.
Материалы и методы
В исследование были включены 76 больных туберкулезом легких, в том числе 47 мужчин и 29 женщин в возрасте от 16 до 63 лет, включая 28 пациентов с фиброзно-кавернозной, 38 пациентов с инфильтративной и 10 пациентов с диссеминированной формой ТБЛ. Активное бацилловыделение (БК+) было выявлено у 46 больных, лекарственная резистентность — у 16 пациентов. Обследование больных проводили после получения информированного согласия. Контрольную группу составили 30 здоровых доноров крови, сопоставимых по полу и возрасту.
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фи-колла-верографина и культивировали (0,1 х 106/ лунку) в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров крови IV (АВ) группы при 37 °С в СО2-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали туберкулиновый очищенный белковый дериват (PPD) в дозе 50 мкг/мл. Интенсивность
60
2012, Т. 14, № 1-2
Про-апоптогенная активность дендритных клеток
пролиферации оценивали на 6 сут по включению 3Н -тимидина (1 мкКи/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования. В зависимости от уровня пролиферативного ответа больные были разделены на 2 подгруппы — с сохранным (> 12500 имп/мин; n = 50; подгруппа 1) и сниженным (< 12500 имп/мин; n = 26; подгруппа 2) ответом на PPD.
Моноциты выделяли в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) путем прилипания к пластику МНК (3 х 106 клеток/мл) в присутствии 5% сыворотки AB(IV) группы. ДК генерировали из моноцитов в течение 4 сут в среде RPMI-1640 с 5% сыворотки плодов коровы (Биолот, СПб) в присутствии GM-CSF (40 нг/мл, Sigma-Aldrich) и IFNa (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария) с последующим дозреванием в течение 24 ч в присутствии 10 мкг/мл липополисахарида (LPS E. coli 0111:B4, Sigma-Aldrich).
Оценку экспрессии B7-H1 на ДК проводили c использованием моноклональных анти-В7-Н1-антител (PharMingen, США), меченных фикоэ-ритрином (PE) методом проточной цитофлюори-метрии (FASC Calibur, Becton Dickinson, США). В культуральных супернатантах генерированных ДК определяли концентрацию IL-10 с помощью наборов для иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией фирмы-производителя («Вектор-Бест», г. Новосибирск).
Аллостимуляторную активность ДК оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании МНК доноров (0,1 х 106/ лунку) в 96-луночных круглодонных планшетах в присутствии аллогенных ДК здоровых доноров или больных ТБ в соотношении 10:1. Интенсивность пролиферации оценивали на 5 сут радиометрически по включению 3Н-тимидина. Индекс влияния ДК (ИВДК) в СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии ДК к уровню спонтанной пролиферации МНК. В дополнительной серии экспериментов уровень апоптоза Т-клеток в 3-суточной алло-СКЛ и пролиферативный ответ в 5-суточной алло-СКЛ оценивали в отсутствие (контроль) и в присутствии (опыт) нейтрализующих антител против PD-1 (5 мкг/мл, J116; eBioscience; Functional Grade Purified). Для оценки эффекта анти-PD1-антител на уровень пролиферативного ответа в СКЛ рассчитывали индекс влияния по формуле ИВАНТИ_рШ = опыт/контроль.
Экспрессию PD-1, уровень апоптоза и распределение Т-лимфоцитов по фазам клеточного цикла оценивали в 3-суточной алло-СКЛ (как описано выше). Культуры дублировали в 12 идентичных повторах, с целью получения клеток в количестве, достаточном для проведения цитофлуо-риметрического анализа. Для оценки экспрес-
сии PD-1 на CD4+ и CD8+(CD4-) Т-лимфоцитах МНК (свежевыделенные или стимулированные в алло-СКЛ) инкубировали с FITC-меченными анти-CD3, PE-меченными анти-CD4 (Сорбент, Москва) и APC-меченными анти-PD-! антителами (Becton Dickinson). Клеточный цикл и уровень апоптоза CD4+ и CD8+(CD4-) Т-клеток оценивали методом трехцветной проточной цитометрии. Для этого, 25 мкл МНК (1,0 х 106), полученные после культивирования в алло-СКЛ, инкубировали в течение 45 мин при 4 °С в темноте с 5 мкл FITC-коньюгированных анти-CD3-антител и 5 мкл PE-коньюгированных анти-CD4 (Сорбент, Москва). После однократной отмывки забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,02% ЭДТА и 1% азида натрия (раствор «А») клетки фиксировали в течение 30 мин холодным 0,5% раствором парафармальдегида. Фиксированные клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в 0,5 мл раствора А, содержащего РНКазу в концентрации 20 мкг/мл, после чего клетки инкубировали в темноте в течение 30 мин при 37 °C. Затем клетки обрабатывали 7-амино-актиномицином D (7-AAD, Calbiochem, Германия) в конечной концентрации 2 мкг/мл в темноте в течение 30 мин при 4 °C.
Анализ клеточного цикла проводили по оценке гистограмм ДНК (красная флуоресценция). Относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в G0/G: фазах клеточного цикла) и гипердиплоидным (клетки в S, G2/M фазах клеточного цикла) набором ДНК определяли гейтах CD3+CD4+ или CD3+CD8+ (CD4-) Т-лимфоцитов (зеленая и оранжевая флуоресценция). Апоп-тотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик. Результаты выражались в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству CD3+CD4+ и CD3+CD8^-лимфоцитов (не менее 10000).
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05. Для исследования корреляционных взаимосвязей между признаками использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена
Результаты
Для того чтобы оценить участие PD-1/B7-Н1-сигнального пути, как одного из возможных механизмов снижения антиген-специфического ответа против M. tuberculosis, нами был проведен сравнительный анализ относительного содер-
61
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
жания PD-1+Т-клеток среди свежевыделенных МНК периферической крови доноров и больных ТБЛ, оппозитных по уровню пролиферативного ответа на PPD (табл. 1). Видно, что именно у больных с PPD-анергией (подгруппа № 2) относительное содержание PD-1+CD4 и PD-1+CD8 Т-лимфоцитов было достоверно выше, чем у здоровых доноров. Тогда как у больных ТБЛ с сохранным ответом на PPD увеличение количества CD4 и CD8 Т-клеток, экспрессирующих PD-1, не было статистически значимым.
При исследовании ДК, генерированных in vitro в присутствии IFNa, было установлено, что PPD-анергичные больные характеризовались наиболее высоким содержанием B7-H1+ДК (68,8±3,9 против 42,3±4,4% у доноров, pu < 0,05). В подгруппе PPD-реактивных пациентов также отмечалось достоверное, но не такое выраженное, увеличение относительного количества B7-H1+ДК (в среднем до 58,0±3,6%, pu < 0,05). ДК больных ТБЛ в отличие от здоровых доноров активно секретировали IL-10 (табл. 1), при этом уровень продукции IL-10 был максимально высоким у PPD-анергичных пациентов. Важно отметить, что и в группе больных ТБЛ, и в группе здоровых доноров между интенсивностью продукции IL-10 и уровнем экспрессии B7-H1 на ДК обнаруживалась прямая корреляционная взаимосвязь (г = 0,51 и r = 0,82 соответственно; p < 0,0001). Наличие такой тесной сопряженности свидетельствует, очевидно, об участии ау-токринных механизмов регуляции экспрессии молекулы B7-H1 на ДК через эндогенную продукцию IL-10.
Сравнительная оценка функциональной активности ДК по их способности стимулировать
пролиферацию Т-клеток в ответ на аллоантигены в СКЛ, выявила снижение аллостимулятор-ной активности ДК больных ТБЛ (табл.1), которое у пациентов с PPD-анергией было более значимым.
Известно, что активация Т-клеток сопровождается увеличением экспрессии PD-1. Действительно, в алло-СКЛ после со-культивирования МНК с ДК доноров или больных ТБЛ, относительное количество PD-1+CD4 Т-лимфоцитов увеличивалось соответственно до 5,5±0,5 и 9,2±1,2%, а содержание PD-1+CD8 Т-клеток до 8,3±1,3 и 7,8±0,6% (pU < 0,05). Таким образом, низкий пролиферативный ответ Т-клеток в алло-СКЛ может быть обусловлен повышенным то-лерогенным потенциалом ДК больных ТБЛ, которые через PD-1/B7-H1-сигнальный путь в комбинации с IL-10 могут индуцировать апоп-тоз/анергию отвечающих Т-лимфоцитов. Выявленный феномен, очевидно, имеет клиническое значение, поскольку наиболее ярко проявляется у больных ТБЛ с низким антиген-специфиче-ским ответом на PPD.
Чтобы проверить, действительно ли увеличение количества PD-1-позитивных Т-лимфоцитов в присутствии ДК в алло-СКЛ сопряжено с клеточной гибелью, провели сравнительную оценку уровня апоптоза и количества пролиферирующих Т-лимфоцитов. Из данных таблицы 2 видно, что среди свежевыделенных МНК периферической крови здоровых доноров содержание апоп-тотических и делящихся CD3+CD4 и CD3+CD8 Т-клеток сбалансировано между собой и не превышает в среднем 3%. Активация Т-клеток аллоантигенами, представленными на ДК доноров, сопровождается увеличением относительного
ТАБЛИЦА 1. СВОЙСТВА ДК, ГЕНЕРИРОВАННЫХ IN VITRO, И КОЛИЧЕСТВО PDI+Т-КЛЕТОК IN VIVO В ГРУППАХ ЗДОРОВЫХ Доноров и больных Тбл, различающихся по уровню ответа на PPD (IW±SE)
Показатель Здоровые доноры Больные ТБЛ
Подгруппа № 1 (PPD ответ > 12500 имп/мин) Подгруппа № 2 (PPD ответ < 12500 имп/мин)
Ответ на PPD (имп/мин) 26944±3393 (30) 33700±1540 (50) 9340±670*#(26)
1. Количество PDI+Т-клеток in vivo
РD1+CD4 T-клетки (%) 3,2±0,7 (7) 4,8±1,2 (4) 6,6±1,6 * (5)
PD1+CD8 T-клетки (%) 2,5±0,5 (7) 3,8±1,1(4) 4,3±0,2 * (5)
2. Свойства ДК in vitro
B7-H1+ДК (%) 42,3±4,4 (19) 58,1±3,6 * (32) 68,8±3,9 * (12)
Продукция IL-10 (пкг/мл) 347±92 (20) 797±70 * (25) 921±95 * (6)
Аллостимуляторная активность ДК в СКЛ (имп/мин) 12113±1263 (24) 6173±1126 * (32) 1983±366 * # (12)
ИВДК в алло-СКЛ (расч. ед) 11±0,8 (24) 8,6±1,2 * (32) 4,0±0,7 * # (12)
Примечание. В скобках - количество наблюдений. * - pu < 0,05 - достоверность различий показателей по сравнению с донорами. # - pu < 0,05 - достоверность различий показателей по сравнению с подгруппой № 1. Здесь и далее в таблицах: U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
62
2012, Т. 14, № 1-2
Про-апоптогенная активность дендритных клеток
количества как апоптотических, так и пролиферирующих CD4 и CD8 Т-лимфоцитов до 10 и 13%, соответственно (pU < 0,05). Но и в этом случае, процессы позитивной (индукция пролиферации) и негативной (индукция апоптоза) активации Т-клеток протекают с примерно равной интенсивностью.
По сравнению с донорами дендритные клетки PPD-анергичных пациентов (подгруппа № 2) индуцировали более выраженный апоптоз CD3+CD4 и CD3+CD8 Т-лимфоцитов (соответственно 19,3±2,9 и 34,9±5,0%, pu < 0,05). Про-апоптогенная активность дендритных клеток PPD-реактивных пациентов была менее выраженной, и проявлялась преимущественно в отношении CD3+CD8+Т-клеток, тогда как в отношении CD3+CD4+Т-лимфоцитов не была статистически значимой (ри = 0,061). Следует отметить, что усиление апоптоза Т-клеток в присутствии ДК больных ТБЛ происходило на фоне незначительного прироста активно пролиферирующих Т-лимфоцитов (менее 10%). Видно, что в этом случае баланс между процессами апоптоза и клеточного деления в CD3+CD4 и CD3+CD8 популяциях сдвигается в негативную сторону, поскольку количество апоптотических Т-лимфоцитов в алло-СКЛ с ДК больных ТБЛ (особенно в группе PPD-анергичных пациентов) существенно превышает число пролиферирующих Т-клеток.
Чтобы убедиться, что апоптоз Т-клеток при их взаимодействии с ДК опосредуется непосредственно через B7-H1/PD-1 сигнальный путь, была проведена дополнительная серия экспериментов с использованием блокирующих анти-PD-1 антител (рис. 1). Добавление нейтрализующих анти-PD-! антител в 3-суточной СКЛ,
стимулированной ДК здоровых доноров, сопровождалось снижением апоптоза CD3+CD4+ и CD3+CD8+Т-клеток на 49 и 44%, соответственно (рис. 1А). В культурах, стимулированных ДК больных ТБЛ, эффект был несколько менее выраженным (снижение в среднем на 35%), но также статистически значимым (рис. 1Б).
Следует отметить, что блокирование B7-H1/ PD-1 сигнального пути не приводило к достоверному увеличению числа CD3+CD4+ и CD3+CD8+Т-клеток, находящихся в S,G2/M фазах клеточного цикла (данные не представлены). Тем не менее, анализ влияния анти-PD-! антител на пролиферативный ответ Т-клеток здоровых доноров в 5-суточной СКЛ показал, что эффект нейтрализующих антител прямо зависел от уровня экспрессии B7-H1 на ДК больных ТБЛ (г = 0,65; p < 0,05; n = 10). Так, у пациентов, у которых среди генерированных in vitro ДК количество В7-Н1+клеток выходило за верхнюю квартильную границу нормативного диапазона (> 67%) и составляло в среднем 81±6%, добавление анти-PD-1 антител сопровождалось 2-кратным усилением пролиферации отвечающих Т-клеток (ИВАНТИ_рШ = 1,8±0,2 расч. ед.). В свою очередь, в оппозитной группе больных ТБЛ, у которых количество генерированных В7-Н1+ДК было достоверно меньше и составляло в среднем 49±5%, нейтрализующие антитела не влияли на уровень пролиферативного ответа Т-клеток в СКЛ (ИВАНХИ_РШ= 0,92±0,06 расч. ед.; pU = 0,016).
Полученные в целом данные подтверждают предположение о том, что ДК, генерируемые in vitro в присутствии IFNa, способны индуцировать апоптоз/анергию Т-клеток через B7-H1/ PD-1 сигнальный путь. При этом усиление экспрессии B7-H1 на ДК больных ТБЛ обуслов-
ТАБЛИЦА 2. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО АПОПТОТИЧЕСКИХ И ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ CD4+ И CD8+T-ЛИМФОЦИТОВ среди мнк здоровых Доноров
Показатель Свежевыделенные МНК (n = 7) МНК, стимулированные в алло-СКЛ
МНК+ДК доноров (n = 11) МНК+ДК больных ТБЛ (подгруппа № 1, n = 21) МНК+ДК больных ТБЛ (подгруппа № 2, n = 13)
1. Количество апоптотических Т-клеток (%)
CD3+CD4+T-i^e™ 2,8±0,4 10,5±2,2 14,7±2,8 19,3±2,9 *
CD3+CD8+T-i^e™ 3,0±0,5 10,3±2,6 21,6±3,3 * 34,9±5,0 * #
2. Количество пролиферирующих (в S,G2/M фазе цикла) Т-клеток (%)
CD3+CD4+Т-клетки 2,2±0,4 12,9±2,0 8,7±1,5 7,9±1,1
CD3+CD8+Т-клетки 2,4±0,9 12,9±2,6 9,6±1,8 7,3±3,0
Примечание. Представлено относительное (%) содержание апоптотических и пролиферирующих CD3+CD4+ и CD3+CD8+Т-клеток среди свежевыделенных МНК здоровых доноров, а также среди МНК, активированных в течение 3 сут в алло-СКЛ в присутствии ДК доноров или больных ТБ в соотношении 10:1. * - pu < 0,05 - достоверность различий показателей по сравнению с ДК доноров. # - pu < 0,05 - достоверность различий показателей между группами больных ТБ со сниженным (подгруппа № 2) и сохранным ответом на PPD (подгруппа № 1).
63
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
а
□ МНК + ДК □ МНК + ДК + aPD -1
Б
□ МНК + ДК □ МНК + ДК + aPD -1
Рисунок 1. Влияние нейтрализующих анти^1-антител на уровень апоптоза Т-клеток (M±SE)
Примечание. Представлены средние значения относительного количества апоптотических CD3+CD4+ и CD3+CD8+T-i^eTOK в алло-СКЛ в присутствии ДК здоровых доноров (n = 12, рис. 1А) и больных ТБЛ (n = 10, рис. 1Б) в отсутствие и в присутствии нейтрализующих анти-PDI-антител (5 мкг/мл).
* pu < 0,05 - достоверность различий показателей.
ливает их повышенную про-апоптогенную активность, что может являться одной из причин снижения антиген-специфического ответа при туберкулезной инфекции.
Обсуждение
Усиление апоптоза Т-клеток при туберкулезе легких является известным фактом [3, 9]. Недавно Jurado J.O. с соавт. показали, что этому может способствовать увеличение в периферической крови и в плевральной жидкости больных CD3^-лимфоцитов, экспрессирующих PD-1 [10]. Дан-
ный рецептор «смерти» взаимодействует с 2 лигандами, одним из которых является молекула B7-H1, которая экспрессируется на поверхности лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток [7, 12]. Участие PD-1/B7-H1 сигнального пути в развитии Т-клеточных дисфункций (апоптоза, анергии) обсуждается при ряде иммунопатологических процессов инфекционной и аутоиммунной природы [7, 11, 12]. Усиление экспрессии молекулы В7-Н1 на опухоль-инфильтрирующих миелоидных ДК рассматривается в качестве механизма подавления противоопухолевого иммунного ответа [6].
64
2012, Т. 14, № 1-2
Про-апоптогенная активность дендритных клеток
Полученные нами данные впервые демонстрируют, что ДК больных ТБЛ, генерируемые in vitro в присутствии GM-CSF+IFNa, характеризуются повышенной экспрессией В7-Н1 и высоким уровнем продукции IL-10. Curiel T.J. с соавт., а также другие исследователи показали, что экспрессия B7-H1 на ДК может усиливаться под действием IL-10 (например, в опухолевом микроокружении) [6], или под влиянием IFNa и IFNy [5]. При исследовании ДК здоровых доноров и больных ТБЛ нами также была выявлена прямая сопряженность между интенсивностью продукции IL-10 и уровнем экспрессии B7-H1, что указывает на участие IL-10 в аутокринных механизмах регуляции экспрессии молекулы B7-H1 на ДК.
Вторым важным моментом, который следует из полученных результатов, является тот факт, что описанная нами ранее и другими авторами сниженная аллостимуляторная активность ДК больных ТБЛ в СКЛ ассоциирована с более высоким уровнем апоптоза и блоком клеточного цикла Т-лимфоцитов [1, 8, 13]. Это позволяет предположить, что более высокая экспрессия B7-H1 на ДК больных ТБЛ сопряжена с усилением про-апоптогенной/толерогенной активности ДК. Подтверждением тому служат данные об усилении экспрессии PD-1 на Т-клетках в ответ на активацию аллоантигенами в СКЛ, а также то, что нейтрализующие анти-PD-! антитела, блокируя PD-1/B7-H1 сигнальный путь, частично отменяют про-апоптогенный/толерогенный эффект ДК. Причем поскольку ДК доноров и больных ТБЛ практически в равной степени индуцируют экспрессию PD-1 на CD4+ и CD8+Т-лимфоцитах, то усиление апоптоза Т-клеток в СКЛ, индуцированной ДК больных, очевидно, связано именно с повышенным уровнем экспрессии B7-H1. Участие миелоидных ДК с повышенной экспрессией B7-H1 в супрессии Т-клеточных иммунных реакций отмечается у больных с хроническим гепатитом В [5]. Причем блокирование B7-H1-опосредуемого сигнала приводит к снижению продукции IL-10 дендритными клетками и усилению их аллостимуляторной активности и секреции IL-12.
Важно также отметить, что, несмотря на более высокий уровень про-апотогенной активности ДК больных туберкулезом, ДК доноров также индуцируют апоптоз Т-клеток, который значимо снижался в присутствии нейтрализующих анти-PD-1 антител. Можно полагать, что цитотоксическая активность ДК имеет определенное значение и в физиологических условиях, например при ограничении иммунного ответа.
Однако чрезмерно высокий уровень экспрессии В7-Ш на ДК четко ассоциируется с усиле-
нием их про-апоптогенной активности, а также индуцирует появление толерогенных свойств в виде способности блокировать прохождение Т-лимфоцитами клеточного цикла. В целом, взаимодействие Т-клеток с такими ДК может приводить к нарушению антиген-специфического ответа. Действительно, полученные нами данные свидетельствуют что, ДК PPD-анергичных больных, имеющих наиболее высокий уровень экспрессии B7-H1, характеризуются в СКЛ более низкой способностью стимулировать пролиферацию Т-клеток и более высокой способностью индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов по сравнению с ДК пациентов с сохранным ответом на PPD.
В заключении следует отметить, что анти-PD1 антитела не полностью отменяют апоптоз Т-клеток, индуцированный ДК доноров и больных ТБЛ. Это указывает на возможное участие и других механизмов апоптоза, которые могут опосредоваться, например, через Fas-L, TRAIL/ TNFa или перфорин. Роль указанных молекул в запуске программированной клеточной гибели продемонстрирована при исследовании цитотоксической активности ДК против клеток опухолевых линий [4]. Возможно, что этим фактом (т.е. вовлечением других механизмов) объясняется и различная чувствительность CD4+ и CD8+^ клеток к апоптогенному эффекту ДК больных ТБЛ, несмотря на сопоставимый уровень экспрессии молекулы PD-1 на указанных субпопуляциях Т-лимфоцитов.
Благодарности
Работа поддержана грантом РФФИ № 10-0400280.
Список литературы
1. Сахно Л.В., Распай Ж.М., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Дефект антигенпрезентирующих клеток у больных туберкулезом легких // Мед. иммунология. - 2009. - Т. 11, № 2-3. - С. 245-254.
2. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Останин А.А., Никонов С.Д., Жданов О.А., Черных Е.Р. Интерлейкин-2 в коррекции анергии Т-клеток у больных туберкулезом легких // Пробл. туб. — 2006. — № 1. - С. 48-52.
3. Черных Е.Р., Сахно Л.В., Хонина Н.А., Тихонова М.А., Кожевников В.С., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А. Субпопуляционная принадлежность Т-клеток, подверженных анергии и апоптозу, у больных туберкулезом легких // Пробл. туб. - 2002. - № 7. - С. 43-48.
4. Chauvin C., Josien R. Dendritic cells as killers: mechanistic aspects and potential roles // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181. - P 11-16.
65
Сахно Л.В. и др.
Медицинская Иммунология
5. Chen L., Zhang Z., Chen W., Zhang Z., Li Y, Shi M., Zhang J., Chen L., Wang S., Wang F.-S. B7-H1 up-regulation on myeloid dendritic cells significantly suppresses T cell immune function in patients with chronic hepatitis B // J. Immunol. — 2007. - Vol. 178. - P 6634-6641.
6. Curiel TJ., Wei S., Dong H., Alvarez X., Cheng P, Mottram P, Krzysiek R., Knutson K.L., Daniel B., Zimmermann M.C. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity // Nat. Med. — 2003. — Vol. 9. — P 562567.
7. Dong H., Chen X. Immunoregulatory role of B7-H1 in chronicity of inflammatory responses // Cell. Mol. Immunology. — 2006. — Vol. 3. — P. 179187.
8. Hanekom WA., Mendillo M., Manca C., Haslett P, Siddiqui M., Barry C., Kaplan G. Mycobacterium tuberculosis inhibits maturation of human monocyte-derived dendritic cells in vitro // J. Infect. Diseases. — 2003. — Vol. 188. — P. 257-266.
9. Hirsch C.S., Johnson J.L., Okwera A., Kanost R.A., Wu M., Peters P, Muhumuza M., Mayanja-Kizza H., Mugerwa R.D., Mugyenyi P., Ellner J.J., Toossi Z. Mechanisms of apoptosis of T-cells in human tuberculosis // J. Clin. Immunol. — 2005. — Vol. 25. — P. 353-364.
10. Jurado J.O., Alvarez I.B., Pasquinelli V.,
Martinez G.J., Quiroga M.F., Abbate E.,
Musella R.M., Chuluyan H.E., Garcia V.E. Programmed death (PD)-1:PD-Ligand 1/PD-Ligand 2 pathway inhibits T cell effector functions
during human tuberculosis // J. Immunol. — 2008. — Vol. 181. — P. 116-125.
11. Selenko-Gebauer N., Majdic O., Szekeres A., Hofler G., Guthann E., Korthauer U., Zlabinger G., Steinberger P., Pickl WF., Stockinger H., Knapp W., Stockl J. B7-H1 (Programmed death-1 ligand) on dendritic cells is involved in the induction and maintenance of T cell anergy // J. Immunol. — 2003. — Vol. 170. — P 3637-3644.
12. Sharpe A.H., Wherry E.J., Ahmed R., Freeman G.J. The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection // Nature Immunology. — 2007. — Vol. 8. — P. 239-245.
13. Stenger S., Niazi K.R., Modlin R.L. Down-regulation of CD1 on antigen-presenting cells by infection with Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol. — 1998. — Vol. 161. — P 3582-3588.
14. Wesa A.K., Storkus WJ. Killer dendritic cells: mechanisms of action and therapeutic implications for cancer // Cell Death and Differentiation. — 2008. — Vol. 15. — P 51-57.
15. Ye P, Weng Z.-H., Zhang S.-L. Zhang J.-A., Zhao L., Dong J.-H., Jie S.-H., Pang R., Wei R.-H. Programmed death-1 expression is associated with the disease status in hepatitis B virus infection // Word J. Gastroenterol. — 2008. — Vol. 14. — P 551-4557.
поступила в редакцию 13.04.2011 принята к печати 25.04.2011
66
