Результаты иммунопрофилактики метастазов меланомы кожи рекомбинантным гранулоцитарномакрофагальным колониестимулирующим фактором после хирургического иссечения первичной опухоли: Динамика иммунологических и гематологических показателей Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ADJUVANT IMMUNOTHERAPY OF STAGE П MELANOMA PATIENTS WITH LOW DOSE OF RGM-CSF: DYNAMICS OF IMMUNOLOGICAL AND HEMATOLOGICAL VALUES

L. V. Demidov, G. Y. Harkevich, I. V. Timofeev N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS

ABSTRACT

We evaluated granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in adjuvant postoperative setting, its drug toxicity, and the dynamics of the immunological and hematological values in patients with skin melanoma. Thirty patients with stage of skin melanoma (pT4N0M0) were treated with low-doses of GM-CSF for 1 year after surgical resection of the primary one. The GM-CSF (Leukomax™) was administered subcutaneously three days per week (1 mkg/kg). The patients were evaluated for toxicity, time to progression, overall survival and immune system activity. Despite the fact that both groups developed regional and distant metastasis, the survival of the study group patients was higher. The immunological and hematological values reflected involving of specific antitumor immune response.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ МЕТАСТАЗОВ МЕЛАНОМЫ КОЖИ РЕКОМБИНАНТНЫМ ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНЫМ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИМ ФАКТОРОМ ПОСЛЕ ХИРУРГИЧЕСКОГО ИССЕЧЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ ОПУХОЛИ: ДИНАМИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

Л. В. Демидов, Г.Ю. Харкевич, И. В. Тимофеев Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

РЕЗЮМЕ

В работе проведена оценка применения гранулацитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) в качестве адъювантной иммунотерапии у больных с хирургически излеченной меланомой кожи II стадии, а также токсичность длительного применения малых доз ГМ-КСФ, динамику иммунологических и гематологических показателей. В исследование включено 30 пациентов, которым подкожно в дозе 1 мкг/ кг веса после хирургического иссечения первичной опухоли (pT4N0M0) вводился ГМ-КСФ (Лейкомакс™) 3 раза в неделю на протяжении 1 года. Несмотря на недостоверное различие в частоте прогрессирования болезни у пациентов контрольной и лечебной групп, выживаемость больных лечебной группы была выше. Иммунологические и гематологические показатели свидетельствуют об активации специфического звена иммунного ответа в рамках противоопухолевого иммунитета у пациентов, получавших ГМ-КСФ. Переносимость длительного применения малых доз ГМ-КСФ - удовлетворительная.

Введение. Меланома - злокачественная пигмент- исследования in vitro показывают, что моноциты пери-ная опухоль, относительно хорошо реагирующая на им- ферической крови, культивируемые в среде с ГМ-КСФ, мунотерапию, поэтому в настоящее время все чаще становятся цитотоксическими по отношению к клеткам для лечения меланомы используется интерферон-а2и человеческой меланомы. Важнейшим свойством ГМ-интерлейкин-2. КСФ является медиаторное воздействие на пролифе-

К сожалению, рекомбинантный гранулоцитарно- рацию, созревание и миграцию дендритных клеток, в макрофагальный колониестимулирующий фактор результате чего антигенпрезентирующая способность (ГМ-КСФ) в терапии меланомы не нашел широкого последних возрастает, соответственно, усиливается распространения. Между тем, ГМ-КСФ является мощ- индукция первичного и вторичного Т-клеточного им-ным биологическим модификатором иммунного отве- мунного ответа. Использование ГМ-КСФ в адъювант-та при злокачественных заболеваниях. Главная функ- ной терапии меланомы по классификации S .Rosenberg ция ГМ-КСФ - усиление пролиферации предшествен- относится к методам активной неспецифической биоников гранулоцитов, макрофагов и их активности. Так, терапии опухолей.

Эффективность применения ГМ-КСФ как адъювантного агента в комбинированном лечении меланомы оценена в нескольких мультицентровых исследованиях. Так, в одном из них, пациенты с меланомой III-IV стадий после хирургического лечения получали ГМ-КСФ подкожно, в дозе 125 (р,/т2, ежедневно, в течение 14 дней с 14-ти дневным перерывом на протяжении года. Контрольная группа больных не получала ГМ-КСФ. Только у двух больных отмечена эритема на месте введения препарата, как побочный эффект. Медиана выживаемости лечебной группы составила 37,5 месяцев, контрольной -12,2 месяца (Lynn Е. Spitler).

Каковы иммунологические механизмы действия ГМ-КСФ в таких группах, обеспечивающие пролонгирование выживаемости больных меланомой?

Целью настоящего исследования явилось изучение динамики иммунологических и гематологических показателей больных меланомой II а и II b стадий на фоне адъювантной иммунотерапии ГМ-КСФ; оценка результатов иммунотерапии ГМ-КСФ по частоте метастазирования и прогрессирования меланомы, а также оценка выраженности побочных реакций и качества жизни больных на фоне проводимой иммунотерапии ГМ-КСФ.

Материалы и методы. В исследование было включено 15 больных меланомой кожи с хирургически излеченной первичной опухолью в стадии pT4NQM0 (за исключением двух больных со стадией pT3,N0,M0), получавших в послеоперационном периоде рекомбинантный ГМ-КСФ (Лейкомакс™- подкожно, в дозе 1 мкг/кг веса, 3 раза в неделю на протяжении 1 года), и 15 больных контрольной группы, не получающих ГМ-КСФ после иссечения первичной опухоли в РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина.

Критериями отбора больных были: 1) уровень инвазии первичной опухоли по Clark > III2) толщина опухоли по Breslow> 4 мм; 3) локализация первичного очага на коже туловища и конечностей; 4) отсут-

ствие метастазов; 5) отсутствие специфического противоопухолевого лечения в анамнезе; 6) возраст больных до 65 лет; 7) отсутствие сердечно-сосудистой патологии и аллергических реакций в анамнезе. Контрольная группа больных была составлена по принципу подбора пар, схожих с больными лечебной группы по полу и порядку толщины опухоли.

Соотношение мужчин и женщин в обеих группах было одинаковым - 5:10. Средний возраст больных лечебной группы - 41,2 лет, в контрольной - 47,1 лет.

В лечебной группе меланома локализовалась на туловище у 11 больных и на конечностях - у 4 больных. В группе контроля первичный очаг опухоли располагался на туловище у 8 больных и на конечностях - у 7 больных.

В послеоперационном периоде после заживления операционной раны начинался курс иммунотерапии ГМ-КСФ по указанной схеме.

В течение первого месяца лечения больные обследовались 1 раз в неделю. Обследование включало в себя общий осмотр, измерение артериального давления, частоты сердечно-сосудистых сокращений и дыхания, а также общий и биохимический анализы крови. При оценке побочных эффектов использовались рекомендации ВОЗ и Международного противоракового союза.

В последующие 11 месяцев больные проходили обследование 1 раз в месяц. Флюорография легких и УЗИ зон регионарного метастазирования производились 1 раз в 3 месяца.

Иммунологический статус до лечения, в процессе и после терапии оценивался на основании количественного определения популяций, субпопуляций и фракций Т-лимфоцитов с использованием реакции непрямой иммунофлюоресценции, цитофлюорометрия (Гавсап). В работе использованы моноклональные антитела серии ИКО, полученные в лаборатории клинической иммунологии РОНЦ.

Статистическая обработка цифровых данных про-

Таблица1

Динамика показателей иммунитета больных в процессе иммунотерапии ГМ-КСФ

Антигены лимфоцитов Доноры До лечения Лечебная группа в процессе терапии ГМ-КСФ (по месяцам)

п=20 п=15 2 месяца п=13 3 месяца п=3 6 месяцев п=10 12 месяцев п=9

% + т % + т % + т % + т % + т % 1 т

CD3 67.0+2.4 63.1+4.5 55.7±8.1 61.0+7.5 61.215.4 61.515.5

CD5 б5.0±2.0 64.6+7.5 60.814.4 59.2+5.0 53.6+9.6 49.6+5.3

CD7 67.0±2.6 71.3±0.2 58.219.9 61.1+4.0 71.415.7 78.3+0.0

CD4 38.9±1.5 30.8±3.7 38.115.6 42.7+9.0 34.613.8 32.515.1

CD8 28.0±1.8 32.7±3.7 29.4+6.9 29.915.3 22.414.8 21.4+4.6

NK 16.6+1.1 29.3±1.4 12.216.7 11.7+2.1 12.414.7 12.1+9.1

HLAI 94.0+1.3 87.8±3.5 93.418.9 89.319.8 91.711.3 92.814.1

CD22 5.6+2.3 2.3+0.7 5.912.1 4.611.6 3.111.0 4.9+1.4

CD45 95.0+3.1 86.4+3.5 87.718.5 95.7+4.2 94.5+1.1 91.4+6.3

CD45RA 56.0+4.9 54.4+6.2 43.916.9 65.215.2 28.816.5 29.812.2

CD38 38.0+3.1 20.2±4.0 27.713.2 29.817.6 30.9+2.5 32.1+5.1

CD71 6.0±2.0 5.0±3.9 2.811.8 6.112.6 1.410.4 3.512.3

CD25 3.0±1.5 5.0+1.3 3.812.6 4.911.1 4.412.4 2.611.6

Таблица 2

Динамика гематологических показателей в первый месяц лечения ГМ-КСФ

Формула крови Норма До лечения п=15 1 неделя п=13 2 неделя п=13 3 неделя п=13 4 неделя п=13

% + т %±т % 1 m % im % 1 m

лейкоциты 4,0-8,8х109 6.710.3 10.7+1.3 14.0+1.8 13.111.5 12.911.5

нейтрофилы 45-70 60.212.8 59.012.0 65.512.2 63.012.1 66.012.3

палочки 1-5 4.310.6 10.1+1.6 11.2+1.8 9.111.5 8.011.0

лимфоциты 20-40 27.012.2 18.912.1 12.2+1.7 14.712.6 15.212.4

моноциты 2-10 6.110.8 8.511.1 4.910.6 5.310.9 5.310.9

эозинофилы 0-5 2.210.4 2.810.6 5.511.2 6.510.8 4.811.0

базофилы 0-1 0.310.2 0.210.1 0.010.0 0.210.1 0.110.1

водилась с помощью специализированного компьютерного пакета программ «Аста» и «STATISTICА».

Результаты и обсуждение. В иммунном статусе 15 больных лечебной группы на протяжении иммунотерапии ГМ-КСФ был выявлен ряд изменений (табл. 1).

В исходном иммунном статусе больных лечебной группы регистрируется увеличение количества NK-клеток по сравнению со здоровыми донорами. Наблюдается достоверное снижение количества NK-клеток в процессе лечения в сравнении с показателями тех же больных до лечения (t > 2, р J 0,05) и группой доноров (t>2, р J 0,05).

Кроме того, при статистической обработке полученных данных выявлена сильная отрицательная корреляционная взаимосвязь между значениями NK-клеток и молекул HLAI типа (г = -0,74; р< 0,05). Это свидетельствует о том, что снижение NK-клеток в процессе лечения гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором сопровождается повышением уровня молекул HLA I типа.

На фоне незначительного снижения CD3+, CD5+, CD7+лимфоцитов происходила нормализация показателей Т-хелперов (CD4+) и цитотоксических лимфоцитов (CD8+). Также получена корреляционная зависимость между NK-клетками и CD4, CD8 - лимфоцитами (г = -0,6 и г = -0,58 соответственно; р<0,05). Увеличение Т-лимфоцитов (особенно CD4+) отмечается при снижении NK-клеток в процессе иммунотерапии.

Между тем, выявлена отрицательная корреляционная взаимосвязь CD4, CD8 и молекул HLA I (г = -0,6, г = - 0,65 соответственно; р< 0,05).

Показатели В-лимфоцитов и их предшественников (CD22+), а также цитотоксических клеток (CD38+) возросли по сравнению с исходным уровнем. Эти изме-

нения сохранялись на протяжении 3-6 месяцев лечения, а к 12 месяцу терапии происходит их нормализация. Существует корреляция СБ38+ с NK-клeткaми (г = -0,94) и НЬАI (г = 0,68).

Остальные показатели иммунного статуса статистически не различимы.

Кроме иммунологических, нами были изучены гематологические показатели в процессе профилактического лечения больных. Они оценивались в течение первого месяца лечения еженедельно (табл. 2), а в последующем 1 раз в 3 месяца (табл. 3).

Несмотря на использование малых доз ГМ-КСФ, отмечается умеренный лейкоцитоз уже к концу первой недели. Выявлено статистически значимое увеличение лейкоцитов с начала лечения и в течение первого месяца (р< 0.05).

Количество моноциты на протяжении трех недель лечения остаются в пределах нормы.

Обращает внимание развитие лимфопении у больных на фоне иммунопрофилактики ГМ-КСФ. Снижение количества лимфоцитов за 3 недели достоверно (р< 0.05), но уже с четвертой недели это количество начинает увеличиваться. Прослеживается достоверное (I = 2,66; р< 0,05) увеличение уровня моноцитов в процессе применения ГМ-КСФ в течение 12 месяцев.

В то же время выявлена корреляционная зависимость моноцитов от НЬАI: увеличение молекул НЬА

I типа сопровождается увеличением моноцитов (г =

0,34; р< 0,05). Как уже говорилось, наблюдается резкое снижение относительного количества лимфоцитов в первые три недели применения ГМ-КСФ (с 27,0% до 12,2%), которое сменяется в дальнейшем достоверным (I = 2,29; р< 0,05) повышением относительного количества лимфоцитов (14,7% - 28,6%). В динамике других

Таблица 3

Динамика гематологических показателей в процессе всего курса лечения ГМ-КСФ

Формула крови До лечения 3 месяца лечения п=13 6 месяцев лечения п=10 9 месяцев лечения п=9 12 месяцев лечения п=9

%±т % + т %1т %±т %+т

лейкоциты 6.710.3 9.9+1.0 7.0+1.0 11.411.7 6.9+0.5

нейтрофилы 60.2+2.8 62.212.4 56.713.1 49.213.4 55.7+1.4

палочки 4.310.6 7.411.1 6.411.4 11.412.5 4.810.5

лимфоциты 27.012.2 20.813.4 26.213.1 24.813.2 28.6+1.4

моноциты 6.1+0.8 4.010.6 4.910.5 5.710.8 7.111.0

эозинофилы 2.210.4 6.811.6 4.1+1.0 12.512.7 3.810.9

базофилы 0.310.2 0.310.2 0.0+0.0 0.110.1 0.110.1

Таблица 4

Трехлетняя частота метастазирования и летальных исходов у больных после иммунопрофилактики ГМ-КСФ и без нее

Статус больных Лечебная группа Контрольная группа

N ' % п %

соответствовали протоколу 13 100 15 100

с метастазами 6 46.2 7 46.6

смерть от прогрессирования 2 15.4 5 ' 33.3

живы с метастазами 4 30.8 2 13.3

без метастазов 7 53.8 8 53.3

форменных элементов крови какой-либо закономерности выявить не удалось.

Непосредственные результаты иммунопрофилактики с помощью ГМ-КСФ оценивались по частоте выявляемое™ метастазов у больных лечебной группы в сравнении с контрольной группой.

Из 15 больных профилактическая иммунотерапия ГМ-КСФ была полностью проведена у девяти больных, что составило 60%. Лечение не завершено у остальных шести больных по разным причинам. Один больной был исключен из исследования из-за сердечно-сосудистых осложнений. У четырех больных в процессе лечения выявлены метастазы (у трех - метастазы обнаруживались в регионарных лимфатических узлах (после прерывания лечения этим больным выполнялась стандартная лимфаденэктомия), у одного пациента диагностирован генерализованный метастатический процесс с развитием летального исхода через 3 месяца). Из-за нарушения графика введения препарата из состава лечебной группы исключена одна больная.

Частота метастазирования представлена в таблице 4. После окончания двенадцатимесячного курса ГМ-КСФ у 2 из 9 полностью пролеченных больных возникли метастазы. В одном случае - солитарный подкожный метастаз в мягкие ткани через 5 месяцев после операции; в другом - регионарные метастазы в лимфатические узлы через 18 месяцев. Оба больных были оперированы и находятся в настоящее время без признаков болезни. Таким образом, в период от 30 до 42 месяцев с момента удаления первичной опухоли 7 больных, закончивших лечение в полном объеме, не имеют признаков болезни (53,8%). У шести больных срок появления метастазов варьировал от 3 до 36 месяцев. Два из них погибли от прогрессирования, четыре - живы с метастазами. В контрольной группе из 15 больных к настоящему моменту зарегистрировано появление метастазов у семи больных, пять из которых умерли от прогрессирования болезни.

Достоверных различий при сравнении полученных результатов не отмечено, но прослеживается тенденция более длительной выживаемости в лечебной группе.

При оценке переносимости малых доз ГМ-КСФ учитывался факт появления приступов стенокардии и бронхоспазма у больных, а также некоторых менее грозных побочных эффектов.

Частота основных побочных симптомов, выявленных при иммунотерапии ГМ-КСФ, представлена в таблице 5. За исключением одного случая стенокардии выраженной степени тяжести все остальные побочные явления были 1 -2 степени тяжести и не требовали отмены или коррекции доз препарата.

Кроме описанных выше симптомов, у четырех больных наблюдалось увеличение размеров лимфатических узлов, которые могли быть регионарными по отношению к локализации первичного очага опухоли, но проведенная биопсия с гистологическим исследованием выявила только их гиперплазию без очагов атипии.

Выводы. Повышение 1ЧК-клеток у больных меланомой почти в два раза в исходном иммунном статусе можно объяснить реакцией неспецифического иммунологического звена на опухоль. Это подтверждается сниженным уровнем лимфоцитов различных СО-популя-ций, в том числе цитотоксических. Уровень молекул НЬАI класса также исходно снижен, что, очевидно, и является определяющим пусковым фактором к повышению КГК-клеток и запуску неспецифического иммунного ответа.

После применения ГМ-КСФ количество МК-кле-ток уменьшается и становится ниже нормы. Уровень лимфоцитов, в т.ч. активированных, и молекул НЬАI класса возрастает, коррелируя со снижением ИК-кле-ток. Полученные результаты косвенно свидетельствуют о переходе с неспецифического механизма иммунологического звена противоопухолевой защиты на спе-

Таблица 5

Побочные симптомы на фоне длительной иммунотерапии ГМ-КСФ в малых дозах

Симптомы Количество больных %

Повышение температуры 7 46,7

Гриппоподобный синдром 14 93,3

Эритема 6 40,0

Повышение печеночных ферментов 2 13,3

Повышение креатинина в сыворотке крови 1 6,7

Стенокардия 1 6,7

Бронхоспазмы 0 0

цифический, более «качественный», механизм иммунологического противоопухолевого надзора организма в результате применения в течение года малых доз ГМ-КСФ. Увеличение числа моноцитов (предшественников антигенпрезентирующих клеток) подтверждает предположение о необходимости применения ГМ-КСФ в качестве иммунного адъюванта, запускающего каскад специфических иммунных реакций. Повышение относительного числа моноцитов происходит в пределах границ нормы. Гиперплазия регионарных периферических лимфатических узлов после применения ГМ-КСФ также может быть проявлением специфической стимуляции иммунной системы.

Несмотря на то, что частота метастазирования в группе контроля и лечебной группе - приблизительно одинаковая, смерть от прогрессирования регистрировалась чаще в группе контроля. Общее же количество больных без признаков болезни выше в лечебной группе.

Соответственно, клинически также отмечена эффективность применения ГМ-КСФ при удовлетворительной переносимости малых доз ГМ-КСФ в течение 12 месяцев.

I

I

№4/том1/2002 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1

ЛИТЕРАТУРА

1. Здоровье мира в конце второго тысячелетия. Отчет Всемирной Организации Здравоохранения за 2000 год // Медицинская картотека, 2000,37, № 6, С. 4-10.

2.ДемидовЛ.В., Харкевич Г.Ю. Роль (2а-интерферона в профилактике метастазов у больных с локальной меланомой кожи (ИА-ИВ), также с регионарными метастазами (III стадия) // Клиническая онкология, 1999,1, № 1, С. 28-30.

3. Grab stein КН, Urdal DL, Tushinski RJ et al. Induction of tumoricidal activity by granulocyte macrophage colony stimulating factor // Science, 1992,232, P. 506-508.

4. Kleinerman ES, Knowles RD, Lachman L et al. Effect of recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor on human monocyte activity in vitro and following intravenous administration // Cancer Res, 1990, 48, P. 2604-2609.

5. Masucci G, Wersall P, Ragnhammer P, Mellstedt H. Granulocyte macrophage colony stimulating factor augments cytotoxic capacity of lymphocytes and monocytes in antibody dependent cellular cytotoxicity // Cancer Immunol Immunother, 1989, 29, P. 288-292.

6. Lynn E. Spitler. Adjuvant Therapy of Stage III and IV Malignant Melanoma Using Granulocyte-Macrofage Colony-Stimulating Factor II Clin Oncol, 2001, 18, P. 1614-1621.

7. Rosenberg S. Principles and practice of the biologic therapy of cancer. Third edition. Ibid, 2000