CC BY
51
УДК 616-006.04:615.371/.372
V. М. Moiseenko, I. A. Baldueva, L. A. Schekina, N. V. Tukavina, А. В. Danilova, А. О. Danilov,
R. V. Orlova, A. I. Semenov, V. V. Anisimav, G. I. Gafton, V. A. Kochnev, A. S. Barchuk,
К. M. Pozharissky, S. V. Kanaev, \ K. P. Hanson
PHASE I-II TRIAL FOR ASSESSMENT OF VACCINE THERAPY BASED ON AUTOLOGOUS TUMOR CELLS WITH BCG ADJUVANT IN PATIENTS WITH DISSEMINATED SOLID TUMORS
N. N. Petrov Research Institute of Oncology, St. Petersburg
ABSTRACT
A phase I-II trial was undertaken to define the feasibility, safety, and antitumor effects of the autologous vaccine with BCG as adjuvant in patients with solid tumor. Between 1998 and 1999, 45 patients (24 with renal cell carcinoma, 8 with malignant melanoma (MM), 8 with prostate cancer (PC), 3 with colon cancer (CC), 1 with soft tissue schwannoma and 1 with non-small cell carcinoma of lung (NSCLC)) were enrolled in study. Resected tumors were disaggregated and adapted to tissue culture, irradiated and injected intradermally with BCG as a vaccine every 2-3 weeks. Complete course of vaccination was 6 injections. Endpoints of study were feasibility, safety, and antitumor effects of the autologous vaccine. 45 patients received from 1 to 6 vaccinations. 16 patients received complete course. Vaccinations were well tolerated without clinically significant signs of toxicity by all patients. There were no complete responses. Partial response was observed in 1 patient with RCC. The duration of the effect was 3 month. Stable disease was observed in 10 from 20 patients (50 %) with disseminated disease receiving vaccinotherapy: 5 with RCC, 3 with MM, 1 with PC and 1 with NSCLC. Median disease free period was 6.4 months. Median time to disease progression in 25 patients who received adjuvant vaccinotherapy was 39.6 months. This well tolerated method of vaccinotherapy has definitive clinical efficiency with a number of durable effects.
Key words: cancer vaccine; BCG; phase I-II.
В. М. Моисеенко, И. А. Балдуева, JI. А. Щекина, H. В. Тюкаеина, А. Б. Данилова, А. О. Данилов, Р. В. Орлова, А. И. Семенова, В. В. Анисимов, Г. И. Гафтон, В. А. Кочнев, А. С. Барчук,
К. М. Пожарисский, С. В. Канаев, [К. П. Хансон\
I-II ФАЗА КЛИНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНОТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ АУТОЛОГИЧНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В СОЧЕТАНИИ С АДЪЮВАНТОМ BCG У БОЛЬНЫХ С ДИССЕМИНИРОВАННЫМИ СОЛИДНЫМИ ОПУХОЛЯМИ
НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова, Санкт-Петербург
РЕЗЮМЕ
В работе представлены результаты клинических и иммунологических исследований применения активной специфической иммунотерапии с помощью вакцин на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с BCG для лечения больных солидными опухолями.
В исследование были включены 45 пациентов (24 больных раком почки, 8 — меланомой кожи, 8 — предстательной железы, 3 — раком толстой кишки, 1 — шванномой мягких тканей бедра и 1 — немелкоклеточным раком легкого), проходивших лечение в НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова с 1998 по 1999 г. Из них 20 пациентов получали вакцинотерапию с лечебной целью и 25 пациентов — с адъювантной. Технология приготовления противоопухолевой вакцины с иммунологическим адъювантом BCG предполагает дезагрегацию образца опухоли, культивирование клеток, облучение с целью блокады пролиферации.
Клиническая и иммунологическая оценка эффективности вакцинотерапии проведена у 45 пациентов, которые получили от 1 до 6 введений вакцины. Полный курс (6 введений) получили 16 больных. Полный регресс не зарегистрирован. Частичный регресс продолжительностью 3 мес отмечен у 1 больной раком почки. По данным
компьютерной томографии и ультразвукового обследования, стабилизация процесса наблюдалась у 10 (50 %) из 20 больных, получавших лечебную вакцинотерапию (5 больных раком почки, 3 — меланомой кожи, 1 — раком предстательной железы и 1 — немелкоклеточным раком легкого). Средняя продолжительность эффекта составила 6,4 мес (от 2 до 26 мес). В группе пациентов, получавших адъювантную вакцинотерапию, средняя продолжительность безрецидивного периода составила 39,6 мес (от 3 до 65 мес).
Установлено, что изучаемый вакцинный препарат безвреден для аутологичного больного, его применение не сопровождается клинически значимыми побочными эффектами. Основным осложнением, наблюдавшимся у всех пациентов в ходе лечения, было образование папул в местах введения вакцины с BCG. У 3 (7 %) пациентов папулы некротизировались. Иммунологический мониторинг вакцинотерапии выявил тенденцию к увеличению активности эффекторных клеток.
Ключевые слова: вакцинотерапия, BCG, I—II фаза.
ВВЕДЕНИЕ
Вакцинотерапия на основе облученных цельных опухолевых клеток, а также их лизатов и иммунологических адъювантов, способных вызывать устойчивый противоопухолевый иммунный ответ, представляется перспективным методом лечения злокачественных опухолей [2, 3]. Существует мнение, что все опухолевые клетки содержат опухоль-ассоциированные антигены. Отсутствие полноценного противоопухолевого ответа обусловлено их слабой иммуногенностью [26]. Поэтому считается, что вакцины должны состоять из двух основных компонентов: одного или более опу-холь-ассоциированных антигенов как источника анти-генности для индукции специфического иммунитета и адъюванта, генерирующего сигналы, которые усиливают иммуногенность специфических антигенов. Оба компонента вакцины считаются ключевыми в формировании устойчивого противоопухолевого иммунного ответа [24, 27, 31].
Наиболее доступным источником индивидуального набора опухоль-ассоциированных антигенов является аутологичная опухоль, полученная в результате радикальной или циторедуктивной операции.
В последние годы установлено, что микобактерии Bacillus Calmette-Guerin (BCG) индуцируют регресс опухоли как неспецифическими, так и специфическими механизмами [12, 14, 20, 23]. Специфический регресс опухоли, вызванный терапией BCG, включает типичную реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), в которой опухолевые клетки подвергаются действию эффекторов (макрофаги, дендритные клетки, цитотоксические лимфоциты, естественные киллерные клетки, BCG-активирующие киллеры и др.). Неспецифический механизм действия BCG включает генерализованную стимуляцию лимфоидной системы и системы антигенпрезентирующих клеток (АПК), приводящую к гиперплазии и гиперреактивности их компонентов, усилению сенсибилизирующих свойств вакцины [5, 11, 15, 32].
Внедрение в клиническую практику аутологичных противоопухолевых вакцин, в т. ч. с иммунологическим адъювантом BCG, тормозится ограниченным числом подобных клинических исследований. Трудности их проведения обусловлены отсутствием стандартных методов получения, выращивания и хранения опухо-
левых клеточных культур человека, а также сложностями в отборе больных для паллиативной и адъювантной вакцинотерапии.
Таким образом, изучение клинической эффективности и токсичности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG наряду с разработкой стандартизированного получения вакцин у больных солидными опухолями может внести определенную ясность в рассматриваемую проблему.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование включены 48 больных с гистологически верифицированным диагнозом рака почки (25 больных), меланомы кожи (10), рака предстательной железы (8), толстой кишки (3), шванномой мягких тканей бедра (1) и рака легкого (1), получавших лечение в НИИ онкологии за период с 1998 по 1999 г. Из них 26 пациентов получали вакцинотерапию с адъювантной целью (13 больных раком почки, 7 — раком предстательной железы, 4 — меланомой кожи, 1 — шванномой бедра и 1 — раком прямой кишки), а 22 пациента паллиативную терапию после циторедуктивного оперативного вмешательства. Критериями включения в исследование являлись: возраст старше 18 лет, общее удовлетворительное состояние по шкале ECOG 0-2, отсутствие противоопухолевого лечения или другой иммуносупрессивной терапии в течение предшествующих 8 нед.
Средний возраст больных составил 57,4±11,8 лет (от 33 до 76 лет). Клиническую оценку эффективности вакцинотерапии провели у 45 пациентов (25 больных, получавших адъювантную вакцинотерапию, и 20 больных, получавших паллиативную вакцинотерапию).
У 3 больных оценка эффекта не проводилась в связи с их отказом от участия в дальнейшем исследовании. Клиническая характеристика больных представлена в таблице. Все пациенты прошли хирургическое лечение: 25 больным выполнены радикальные операции (13 — нефрэктомия, 7 — простатэктомия, 3 — иссечение первичного очага меланомы, 1 — резекция прямой кишки, 1 — иссечение шванномы мягких тканей бедра), 20 — неполные циторедуктивные операции.
Клиническая характеристика пациентов, получавших вакцинотерапию аутологичными опухолевыми клетками с адъювантом BCG
Характеристика Количество пациентов, л=45 (%)
Средний возраст, годы 57,4±11,8 (от 33 до 76)
Пол:
мужчины 24(53)
женщины 21 (47)
Характеристика опухоли:
рак почки (почечноклеточный) 24(53)
меланома кожи 8(18)
рак предстательной железы 8(18)
рак толстой кишки 3(7)
шваннома мягких тканей бедра 1(2)
немелкоклеточный рак легкого 1(2)
Предшествующее лечение
/. Первичной опухоли:
хирургическое 30 (67)
гормональная терапия 3(7)
лучевая терапия 1(2)
не проводилось 14(31)
2. Метастазов:
хирургическое 19 (42)
химиотерапия 2(4)
иммунотерапия 2(4)
лучевая терапия 1(2)
гормональная терапия 4(9)
Локализация метастазов (п=20)
легкие 4(20)
печень 2(10)
лимфатические узлы, мягкие ткани 15(75)
другая локализация (кости, плевра) 7(35)
Перед началом вакцинотерапии все больные прошли комплексное обследование, включающее стандартные клинические, лабораторные и инструментальные методы исследования. В группе пациентов, получавших паллиативную вакцинотерапию (п=20), висцеральные метастазы выявлены у 6 (30 %) больных, невисцеральные — у 14 (70 %).
Приготовление вакцины состоит из четырех этапов:
1. Дезагрегация образца резецированной аутологичной опухоли.
2. Наращивание клеток опухоли в культуре в условиях, соответствующих требованиям Good Laboratory Practice (GLP).
3. Характеристика клеточного состава (цитологическая, иммуноцитохимическая, клоногенная и др.).
4. Программное замораживание и хранение в условиях криобанка для клеточных культур человека до использования.
В качестве адъюванта использовали вакцину туберкулезную (BCG) для внутрикожного введения (ИНГАМАЛ, РФ).
Дезагрегация образцов опухоли. Использовали автоматизированный механический способ дезагрегации
опухолевой ткани с помощью Медимашины (DAKO, Дания) [25] в нашей модификации. Для этого опухолевую ткань разделяли на фрагменты 2-3 мм3, помещали в культуральную среду и Медиконы (стерильные ножи) (DAKO, Дания) и дезагрегировали в течение 10-60 с. Затем клеточную суспензию фильтровали через Филконы 70 и 50 мкм (DAKO, Дания), отмывали центрифугированием при 1000 об./мин в течение 10 мин, определяли количество и жизнеспособность. Далее клетки вводили в фиксированный объем полной культуральной среды и переносили в индивидуальные культуральные флаконы.
Наращивание клеток опухоли в культуре. Индивидуальные клеточные культуры выращивали при температуре 37 °С, 5% С02, 98% влажности в пластиковых флаконах для адгезионных культур (Sarstedt, ФРГ) в полной среде DMEM/F12 («Биолот», Россия), содержащей 20 % сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СКРС) («Биолот», Россия), 100 ед/мл пенициллина, 50 ед./мл стрептомицина. При наращивании первичной клеточной массы получали монослойные, суспензионные или полусуспензионные культуры, у которых в дальнейшем можно изменить адгезионные свойства, используя подложку из коллагена.
Характеристика клеточного состава. Проводили цитологическую и морфологическую верификацию, изучали тип роста, у части культур исследовали скорость пролиферации. Стабильно пролиферирующие культуры меланомы в последующем тестировали на присутствие опухоль-ассоциированных антигенов.
Замораживание клеточных культур. Опухолевые клетки каждого пациента подсчитывали в камере Горяева и замораживали порциями по 107 кл/мл в 2 мл стерильных криопробирках (Sarstedt, ФРГ) и криосреде, содержащей 10 % диметилсульфоксида (ДМСО) (Sigma, США), 20 % СКРС, 70 % DMEM. Для криоконсервации использовали программный заморажива-тель SY Lab с контролируемой скоростью охлаждения, которая составляла -1 °С/мин в диапазоне от 4 до —40 °С и -5 °С/мин в диапазоне от -40 до -120 °С. Затем клетки переносили в индивидуальные контейнеры с жидким азотом и хранили до использования.
Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток и адъюванта BCG. В день вакцинации клетки (107) размораживали, дважды отмывали в культуральной среде, помещали в стерильный контейнер и облучали на терапевтическом аппарате «Ро-кус-у» Со60 1,25 mev при 2000 сГр (мощность дозы
0,99 сГр/с) [6]. После облучения клетки трижды отмывали центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин) в физиологическом растворе, смешивали с 107 BCG и вводили ex tempore по 0,3 мл смеси паравертебрально в межлопаточную область в 4 точки на расстоянии 3 см с образованием «лимонной корочки». В пятую точку, а также, начиная с 3-й вакцинации, во все 5 точек вводили опухолевые клетки без адъюванта. Курс вакцинотерапии состоял из 1-6 введений (в зависимости от количества полученного материала) со следующим интервалом: 1-я и 2-я вакцинации через 2 нед,
3 нед интервал; 3-я и последующие вакцинации с интервалом 3 нед.
Степень токсичности вакцины определяли по шкале СТС NCIC [4]. При оценке лечебного действия использовали единые критерии объективного эффекта при лечении солидных опухолей, которыми являются полная или частичная регрессия опухоли и метастазов (ВОЗ, 1998). Полный регресс расценивали как исчезновение всех поражений опухолевых очагов; частичный регресс — большее или равное 50 % уменьшение площади всех опухолевых очагов при отсутствии новых поражений; стабилизация — уменьшение менее, чем на 50 %, при отсутствии новых очагов или увеличение не более чем на 25 %, площади всех опухолевых очагов; прогрессирование — большее или равное 25 % увеличение размеров опухолевых очагов либо появление нового опухолевого очага. Выживаемость определялась от момента 1-й вакцинации методом Каплана— Мейера (Statistica 6.0).
В процессе вакцинотерапии осуществляли мониторинг состояния иммунной системы. Оценку иммунного статуса проводили с помощью стандартного рутинного комплекса, включающего 20 лабораторных тестов. Относительное и абсолютное количество клеток, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CD8, CD20, CD16, CD25, CD38, CD71, CD95, HLA-DR, определяли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител («Сорбент», Москва). Концентрацию сывороточных иммуноглобулинов (Ig) классов М, G, А оценивали радиальной иммунодиффузией по Манчини, уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) — методом осаждения полиэтилен-гликолем. Для оценки функциональной активности Т-клеток и эффекторов воспаления изучали спонтанную активность мононуклеаров (МНК), пролиферативный ответ на митоген конканавлин А (Кон-А) и фитогемаг-глютинин (ФГА), спонтанную НСТ-активность нейтро-фильных фагоцитов, фагоцитоз моноцитами и нейтро-филами частиц латекса (ФЧ-фагоцитарное число), интенсивность которого выражали через индексный показатель (ФИ) активности этих клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследовании представлены результаты клинической и иммунологической оценки эффективности активной специфической иммунотерапии с помощью вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG у больных солидными опухолями.
Лечение начинали спустя 3-6 нед. после удаления первичного очага или метастазов опухоли. 6 вакцинаций получили 16 (36 %) больных из 45, 5 введений вакцины — 5 (11 %), 4 введения — 15 (33 %), 3 — 4 (9 %), 2 — 3 (7 %) и 1 введение — 2 (4 %) пациента. Преждевременное завершение лечения 29 больных было обусловлено прогрессированием заболевания или отсутствием необходимого количества выращенных в культуре опухолевых клеток, что препятствовало продолжению лечения.
Основным осложнением, наблюдавшимся у всех пациентов в ходе лечения, было образование папул в местах введения вакцины с BCG. У 3 (7 %) пациентов папулы некротизировались (рис. 1).
Рис. 1. Местные реакции на вакцинацию облученными аутологичными опухолевыми клетками в сочетании с BCG:
А — через 14 дней после первого введения; Б, В, Г— через 28 дней после двух введений
Полный регресс не зарегистрирован ни у 1 больного из 20, получавших лечебную вакцинотерапию. У 1 больной раком почки отмечен частичный регресс метастазов в шейные лимфатические узлы после 6 введений вакцины, продолжительность которого составила 3 мес. Стабилизация процесса характеризовалась большой продолжительностью и наблюдалась у 10 больных (5 больных раком почки, 3 — меланомой кожи, 1 — раком предстательной железы, 1 — раком легкого). Средняя продолжительность времени до прогрессирования составила 6,4 мес (от 2 до 26 мес).
У больных, получавших адъювантную вакцинотерапию {п=25), средняя продолжительность безреци-дивного периода составила 39,6 мес (от 3 до 65 мес). У 1 больного зарегистрировано прогрессирование заболевания после завершения курса вакцинотерапии. У 13 больных (8 — раком почки, 3 — раком предстательной железы, 1 — меланомой кожи, 1 — раком прямой кишки) на момент анализа безрецидивный период продолжается.
При характеристике показателей выживаемости в этих 2 группах больных выявлено, что медиана выживаемости пациентов, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, составила 11,5 мес от начала лечения, средняя продолжительность жизни —19 мес (95% CI 10,4-27,9 мес). Средняя продолжительность жизни больных, получавших вакцинотерапию с адъювантной целью, составила 44,2 мес (95% CI 36,5-51,8 мес). Медиана выживаемости не достигнута (рис. 2).
Иммунологические показатели исследовали перед каждой вакцинацией, и в большинстве случаев они от-
Кумулятивная выживаемость (Каріап-Меіег) • Нецензурироеаны Цензурированы
Время мес
■ Группа 1 • Группа 2
Рис. 2. Выживаемость пациентов, получавших вакцинотерапию на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с БЦЖ с адъювантной (1-я группа) и лечебной целью (2-я группа) (метод Каплана—Мейера)
вечали на активную специфическую иммунотерапию, отражая различную степень иммунного ответа — от незначительного до высокого. Количественные изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета представлены на рис. 3 и 4, где они рассмотрены в связи разделением пациентов на подгруппы и которые лежат в основе индивидуального прогноза заболевания, в частности распространенности процесса и выживаемости пациентов.
До начала лечения иммунологические показатели больных, получавших вакцинотерапию с лечебной (1-я группа) и адъювантной целью (2-я группа), имели статистически недостоверные различия за исключением увеличенного абсолютного содержания в периферической крови моноцитов у больных 1-й группы (0,66±0,42 по сравнению с 0,39±0,20 (р<0,01)) (см. рис.
3, А). Вместе с тем функциональная активность этих клеток была выше у больных после полной циторедукции, что свидетельствует о способности моноцитов (профессиональных АПК) быстро активироваться в самом начале иммунного ответа уже на относительно ранних этапах опухолевого процесса, например микробными продуктами или некоторыми вирусами, которые иммуногенны сами по себе, либо под влиянием адъювантного компонента вакцины, и запускать иммунный ответ. В то же время иммунная система пациентов с диссеминированным заболеванием отвечает на злокачественный процесс неоднозначно. С одной стороны, как показывает наше исследование, увеличивается содержание АПК в периферической крови, а с другой — в результате нарушений гомеостатических механизмов возникает снижение их функциональной активности, которое однако устраняется в процессе лечения (см. рис. 3, Б).
У больных, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, усиление иммунного ответа, зарегистрированное через 14 дней после 1-й вакцинации и отраженное в росте функциональной активности эффекторных клеток (усиление спонтанной миграции лейкоцитов,
Рис. 3. Динамика иммунологических показателей периферической крови больных с солидными опухолями в процессе адъювантной (1-я группа) и лечебной (2-я группа) вакцинотерапии:
А — абсолютное содержание моноцитов; Б — относительное содержание фагоцитирующих моноцитов; В — относительное содержание СОЗ+-Т-лимфо-цитов; Г— спонтанная миграция лейкоцитов; Д— относительное содержание НЬА-1Ж+-клеток
увеличение содержания клеток, экспрессирующих маркер активации НЬА-БК), сочеталось с достоверным увеличением клеток СБЗ+ (73,05+5,9) и СБ8+ (29,35±5,9) по сравнению с аналогичным показателем у больных с адъювантной вакцинотерапией (64,4+10,0 (р<0,001) и 24,27±6,3 (р<0,01) соответственно) (см. рис. 3, В, Г, Д). После 2-й вакцинации, через 5 нед от начала лечения, указанные различия не наблюдались. Второй пик усиления активности эффекторных клеток у этой категории больных был отмечен после 5-й вакцинации (увеличение содержания СБЗ+-Т-кле-ток, усиление спонтанной миграции лейкоцитов и их ответ на митоген КонА) (см. рис. 3, В, Г).
Выявленная персистирующая стимуляция активности Т-клеток у больных с диссеминированным опухолевым процессом косвенно свидетельствует о необходимости увеличения иммуногенности вакцины для этой категории больных по сравнению с невысоким, но устойчивым иммуностимулирующим эффектом на изучаемые показатели у больных после полной циторедукции (см. рис. 3, В). Следовательно, изучаемый
вид вакцинотерапии может быть рекомендован больным с сохранным иммунологическим статусом на ранних стадиях заболевания для профилактики рецидивов и метастазов после удаления первичного очага или регионарных метастазов в лимфатических узлах.
Анализ иммунологических показателей у пациентов в зависимости от выживаемости (1-я группа—живы, 2-я группа — умерли) выявил кратковременное повышение функциональной активности эффекторных клеток (HLA-DR+-KJieTKH, спонтанная миграция лейкоцитов) у больных 2-й группы перед 2-й и 5-й вакцинацией, которое сочеталось с увеличенным содержанием в периферической крови СБЗ+-Т-лимфоцитов. Динамика содержания СЭЗ+-клеток в разнородных по выживаемости группах представлена на рис. 4, А. Исходно высокое содержание CD3+-KneTOK у больных 2-й группы было обусловлено повышенным содержанием цитотоксических СВ8+-Т-клеток (1,34±0,7 и 0,52±0,3 по сравнению с 1,06+0,4 и 0,36±0,2 (р<0,03) у больных
1-й группы) и указывало на усиление иммунного ответа у этой категории больных. По всей вероятности, этот феномен обусловлен нерадикальным хирургическим вмешательством, которое способствовало увеличению контакта клеток иммунной системы и опухоли in vivo.
В процессе вакцинотерапии у больных 1-й группы обнаруживается возрастание функциональной активности эффекторных клеток с 2,07+2,0 до 3,77±2,8 (р<0,05) и снижение этого показателя с 3,50±2,6 до 2,31±1,6 (р<0,05) перед 4-й вакцинацией у пациентов
2-й группы (см. рис. 4, Б). Последующее увеличение функциональной активности эффекторных клеток
Рис. 4. Динамика иммунологических показателей периферической крови больных с солидными опухолями в процессе вакцинотерапии в зависимости от выживаемости (1-я группа — живы, 2-я группа — умерли): А'— абсолютное содержание СОЗ+-Т-клеток; Б — спонтанная миграция лейкоцитов; В — содержание ЦИК
у больных 2-й группы наблюдалось перед 6-й вакцинацией и сочеталось с падением содержания в периферической крови CD3+-T-KueTOK (1,34±0,7 до лечения и 0,99±0,4 после вакцинотерапии; р<0,05). Этот показатель указывает на истощение резервных возможностей клеточного иммунитета и является прогностически неблагоприятным фактором, который требует дальнейшего изучения.
Исследование гуморального иммунитета выявило увеличенное содержание ЦИК у больных диссеминированным опухолевым процессом (2-я группа), которое было повышенным после 2-й (123,58±51,6), 3-й (121,10±56,9) и 4-й вакцинации (127,90±70,3) по сравнению с аналогичным показателем у больных 1-й группы (88,50±47,1), (89,11+37,9) и (64,93±29,4) с достоверностью (р<0,03), (р<0,05), (р<0,005) соответственно (см. рис. 4, В). В конце курса вакцинотерапии, перед 5-й и 6-й вакцинациями обнаружено сниженное количество IgG в сыворотке крови и инверсия в содержании ЦИК. Это указывает на усиление В-клеточного иммунного ответа на вакцинацию у больных 1-й группы и ослабление гуморального иммунитета наряду с истощением клеточного у больных диссеминированным заболеванием. Несомненно, это является неблагоприятным фактором и требует коррекции терапии, например заместительной иммунотерапии большим количеством клеток с высоким цитотоксическим потенциалом (ЛАК, или BCG-активированные киллеры, или активированные ex vivo ЕК-клетки), в т. ч. донорскими, с последующими курсами активной специфической иммунотерапии (аутологичной, аллогенной или ксеногенной вакцинации).
Индукция противоопухолевого иммунитета может быть достигнута локальной активацией микобактериями (BCG), как это показано при лечении больных поверхностным раком мочевого пузыря [29]. Тесное взаимодействие трех систем — пациента, микобактерий и опухоли — запускает каскад иммунологических эффектов, которые проявляются в регрессе рецидива и метастазов опухоли. G. Shankar и соавт. (2003) показали, что BCG является одним из факторов, способствующих созреванию ДК, увеличению экспрессии на этих клетках CD54-, CD80- и СБ86-антигена, а также усилению продукции ИЛ-12 и ингибиции синтеза ИЛ-10 [30]. Перенос in vivo BCG-сенсибилизированных ДК демонстрировал их увеличенную способность генерировать иммунный ответ по пути Т-хелперов 1-го типа [16]. Авторы рекомендуют использовать ДК, созревшие под воздействием BCG, как адъювант в противоопухолевой иммунотерапии.
Описаны так называемые BCG-активированные киллерные клетки (ВАК), которые являются потенциально возможными эффекторными клетками в иммунотерапии BCG [10]. S. Brandau и A. Bohle (2001) отводят им ведущую роль в противоопухолевой терапии с BCG [11].
Иммуностимулирующий эффект применения вакцины BCG в значительной степени зависит от вида вакцины, дозы, режима и места введения [13, 37]. Боль-
шинство исследователей пришли к выводу, что живая вакцина более эффективна, чем девитализированная. В нашем исследовании неспецифическая стимуляция иммунной системы осуществлялась вакциной BCG отечественного производства (живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1), специфическая — облученными аутологичными опухолевыми клетками.
Полученные нами данные были подтверждены другими авторами. Так, в рандомизированном исследовании J. Vermorken и соавт. (1997) по изучению адъювантной вакцинотерапии аутологичными опухолевыми клетками с BCG у больных раком ободочной кишки стадии В и С по Duke’s частота рецидивов заболевания (местный рецидив и отдаленные метастазы) снизилась на 43 %, а число умерших от прогрессирования опухоли оказалось на 32 % ниже [35]. Это сопоставимо по своей эффективности с адъювантной химио-иммунотерапией при этой локализации рака (5-фторурацил+лейковорин, мышиные моноклональные антитела — панорекс), что позволило авторам обосновано рекомендовать активную специфическую иммунотерапию аутологичной вакциной в качестве стандартного метода лечения больных раком ободочной кишки в стадии В по Duke’s.
В. М. Henz и соавт. (1996) отмечают, что адъювантное лечение больных меланомой кожи (pT3^,N0M0) аутологичными опухолевыми клетками с вакциной «BCG Pasteur» и, в меньшей степени, «BCG RIV» сопровождалось выраженной регионарной и системной реакций на вакцинацию [19]. Все больные, у которых наблюдалась активация клеточного иммунитета и образовались антитела на вакцинацию BCG, имели длительную без-рецидивную выживаемость (р=0,05).
В нашем исследовании безрецидивная выживаемость (см. рис. 2) сочеталась с невысоким, но устойчивым содержанием в периферической крови CD3+-T-клеток и ЦИК, а также выраженным усилением активности эффекторных клеток перед 4-й вакцинацией (см. рис. 4, А, Б, В). Эти данные у больных после радикального хирургического лечения являются хорошим прогностическим фактором по сравнению с пациентами с диссеминированным опухолевым процессом и паллиативной вакцинотерапией (см. рис. 3, В).
Больные с метастазами меланомы кожи в регионарные лимфатические узлы, несмотря на хирургическую лимфаденэктомию, имеют плохой прогноз. Появление у 40-50 % больных меланомой кожи отдаленных метастазов опухоли через несколько лет после радикального хирургического вмешательства свидетельствует о том, что лечение только самой опухоли не в состоянии предотвратить рецидива заболевания, т. е. фактически прогрессирования опухолевого процесса. После радикального хирургического вмешательства — удаления первичной опухоли вместе с возможными регионарными метастазами — в организме все же сохраняется достаточно большая масса опухолевых клеток, являющаяся источником последующего рецидива заболевания [1]. Но для клинической манифестации рецидива необходим некий латентный период,
длительность которого зависит от скорости пролиферации метастатических клеток, их общей массы и состояния организма, в первую очередь — состоятельности противоопухолевых иммунологических реакций.
В нашем исследовании у больных с диссеминированным опухолевым процессом до вакцинотерапии выявлена тенденция к увеличению в периферической крови абсолютного содержания СОЗ+-клеток по сравнению с этим показателем у пациентов после радикального хирургического вмешательства (см. рис. 3, В). Это увеличение обусловлено возросшим количеством CD4+- и С08+-клеток и сопровождалось тенденцией к увеличению содержания в периферической крови основных классов иммуноглобулинов (М, G и А) и ЦИК, а также выраженным увеличением абсолютного содержания моноцитов с низкой фагоцитарной активностью (см. рис. 3, А, Б). Не исключено, что последнее обстоятельство является отражением значительной функциональной нагрузки на АПК, которая может быть обусловлена среди прочих причин длительной стимуляцией иммунного ответа слабыми опу-холь-ассоциированными антигенами [17, 38]. Наши результаты подтверждают это на примере пациентов с диссеминированными солидными опухолями и позволяют сделать вывод, что при планировании вакцинотерапии следует учитывать функциональную активность рассматриваемых клеток. Несомненно, оптимальным и предпочтительным является полное (радикальное) удаление из организма источника антигенного материала — опухолевых клеток.
Е. G. Elias и соавт. (1997) предприняли попытку увеличить выживаемость пациентов путем циторедук-тивной лимфаденэктомии с последующей вакцинацией облученными аутологичными опухолевыми клетками (20-106) в смеси с BCG [18]. Кроме того, с целью снижения содержания в периферической крови неспецифических Т-супрессоров за 3 дня до вакцинации больным вводили внутривенно циклофосфамид (300 мг/м2). Спустя 4-6 лет наблюдения у 68 % больных рецидива или метастазов не было зарегистрировано, что улучшило безрецидивную выживаемость по сравнению с историческим контролем на 10-25 %.
Положительный клинический эффект вакцинотерапии облученными аутологичными опухолевыми клетками в смеси с BCG был получен A. Baars и соавт. (2000) [6]. В исследование был включен 81 больной с III и IV стадией меланомы кожи, которым была выполнена циторедуктивная операция, в т. ч. с целью приготовления вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в смеси с BCG. Опухолевые клетки (107) вводили внурикожно с интервалом 3 нед через
4 нед после операции. Первые 2 вакцинации комбинировали с иммунологическим адъювантом BCG (107 микобактерий). Выраженные побочные эффекты зарегистрированы не были, за исключением транзиторных изъязвлений в месте введения вакцины с BCG. Уплотнения, а также эритема в месте введения вакцины отчетливо коррелировала с выживаемостью пациентов (р<0,0001 и р=0,0004). 5-летняя выживаемость после
полной циторедуктивной операции у больных с III стадией заболевания составила 48 %, с IV стадией — 34 %. Вместе с тем у больных с макрометастазами до начала вакцинотерапии клинического эффекта не было получено.
В нашем исследовании стабилизация процесса наблюдалась у 10 (50 %) больных с продолжительностью времени до прогрессирования 6,4 мес. (от 2 до 26 мес). У 1 (5 %) больной раком почки зарегистрирован частичный регресс метастазов в шейные лимфатические узлы после 6 введений вакцины, продолжительность которого составила 3 мес. Эти данные подтверждают перспективность используемой нами схемы вакцинотерапии для больных с диссеминированными солидными опухолями. Кроме того, она может быть рекомендована для рандомизированного исследования и изучения в адъювантном режиме.
В экспериментальных исследованиях перспективной представляется вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками, модифицированными физическими, химическими или биологическими методами в смеси с BCG [8, 9, 33]. М. Lotem и соавт. (2002) оценивали общую и безрецидивную выживаемость больных диссеминированной меланомой кожи, получавших адъювантную вакцинотерапию на основе аутологичных опухолевых клеток, конъюгированных с динитрофенолом [22]. В исследование включены 43 пациента (28 — AJCC III стадия, 15 — AJCC IV стадия) с медианой наблюдения 34 мес. (6-62 мес.). Каждая доза вакцины содержала 10-ь25-106 опухолевых клеток, которые были получены из образцов аутологичной опухоли и переведены в клеточные культуры. Опухолевые клетки конъюгировали с гаптеном — динитрофенол, облучали (110 Гр) и смешивали с BCG. Безрецидивная и общая выживаемость коррелировала с реакцией ГЗТ на немодифицированные аутологичные опухолевые клетки.
Гистологическая картина регрессирующих опухолевых образований была сходна с хроническим воспалением, с образованием гранулем, хотя сильно варьировала, к тому же противоопухолевый эффект наблюдался и без выраженных клеточных изменений.
Таким образом, современное понимание механизмов активации, лучшее определение цитотокси-ческих клеток и их роли, молекулярные исследования опухолевых клеток способствуют разработке более эффективных иммунологических протоколов и индивидуальных терапевтических подходов у больных с солидными опухолями, которые в настоящее время проходят клинические исследования I-III фазы [9, 21, 28, 34].
ВЫВОДЫ
1. Вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками в сочетании с иммунологическим адъювантом BCG у больных с солидными опухолями не сопровождается выраженными побочными эффектами, хорошо переносится больными и обладает иммуномодулирующим действием.
2. Иммуномодулирующие эффекты вакцинотерапии могут быть зарегистрированы in vivo в реакции ГЗТ и in vitro в рутинных лабораторных тестах, определяющих активацию моноцитов и лимфоцитов, сенсибилизацию CD4+- и С08+-клеток, стимуляцию гуморального иммунитета.
3. Перспективной представляется вакцинотерапия больных после радикального лечения или циторедук-тивных операций с минимальным объемом опухолевой массы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вагнер Р. И., Анисимов В. В., Барчук А. С. Меланома кожи. — Ч. 2. — СПб.: Наука, 1996. — 274 с.
2. Моисеенко В. М. Биотерапия солидных опухолей // Вопр. онкол. — 1998. — Т. 44, № 1. — С. 120-125.
3. Моисеенко В. М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи // Практ. онкол. — 2001. — № 4(8). —
С. 58-64.
4. A Practical Guide to EORTC Studies. — Brussels, 1996.
5. Akazawa Т., Masuda II, Saeki Y. et al. Adjuvant-mediated tumor regression and tumor-specific cytotoxic response are impaired in MyD88-deficients mice // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64. — P. 757-764.
6. Baars A., ClaessenA. М., van den Eertwegh A. J. et al. Skin tests predict survival after autologous tumor cell vaccination in metastatic melanoma: experience in 81 patients // Ann. Oncol. — 2000. — Vol. 11. — P. 965-970.
7. Baars A., van Riel J. М., Cuesta M. A. et al. Metastasectomy and active specific immunotherapy for a large single melanoma metastasis // Hepatogastroentero-logy-2002. — Vol. 49. — P. 691-693.
8. Berd D., Sato Т., Mastrangelo M. J. Effect of dose and composition of an autologous hapten-modified melanoma vaccine on the development of delayed-type hypersensitivity responses // Cancer Immunol. Immunother. — 2002. — Vol. 51. — P. 320-326.
9. Berd D„ Sato Т., Maguire H. C. et al. Immunopharmacological analysis of an autologous, hapten-modified human melanoma vaccine // J. Clin. Oncol.
— 2004. — Vol. 22. — P. 403—414.
10. Bohle A., Thanhauser A., Ulmer A. J. et al. Dissecting the immunobiological effects of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) in vitro: evidence of a distinct BCG-activated killer (ВАК) cell phenomenon // J. Urol.
— 1993. — Vol. 150. — P. 1932-1937.
11. Brandau S., Bohle A. Activation of natural killer cells by Bacillus Calmette-Guerin // Eur. Urol. — 2001. — Vol. 39. — P. 518-524.
12. Brandau S., Riemensberger J„ Jacobsen M. et al. NK cells are essential for effective BCG immunotherapy // Int. J. Cancer. — 2001. — Vol. 92. — P. 697-702.
13. Chabalgoity J. A., Dougan G., Mastroeni P., Aspinall R. J. Live bacteria as the basis for immunotherapies against cancer // Expert Rev. Vaccines. — 2002. — Vol. 1. —P. 495-505.
14. Dang L. H., Bettegowda C., Huso D. L. et al. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of
experimental tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001. —Vol. 98. —P. 15155-15160.
15. Das H., Masahiko S., Brenner M. B. Mechanisms of V-delta-l-gamma-delta T cell activation by microbial components // J, Immunol. — 2004. — Vol. 172. — P. 6578-6586.
16. Demangel C., Palendira U„ Feng C. G. et al. Stimulation of dendritic cells via CD40 enhances immune responses to Mycobacterium tuberculosis infection // Infect. Immun. — 2001. — Vol. 69. — P. 2456-2461.
17. Dredge K„ Marriott B. J., Todryk S. M., Dalgleish A. G. Adjuvants and the promotion of Thl-type cytokines in tumour immunotherapy // Cancer Immunol. Immunother. — 2002. — Vol. 51. — P. 521-531.
18. Elias E. G., Suter C. M., Fabian D. S. Adjuvant immunotherapy in melanoma with irradiated autologous tumor cells and low dose cyclophosphamide // J. Surg. Oncol. — 1997. — Vol. 64. — P. 17-22.
19. Hem B. M, Macher E., Brocker E. B. et al. Prognostic value of tuberculin and BCG immunoreactivity in stage I high-risk malignant melanoma (EORTC protocol 18781)//Dermatology. —1996.—Vol. 193.—P. 105-109.
20. Hsueh E. C„ Essner R., Foshag L. J. et al. Prolonged survival after complete resection of disseminated melanoma and active immunotherapy with a therapeutic cancer vaccine // J. Clin. Oncol. — 2002. — Vol. 20. — P. 4549-4554.
} 21. Huber C. H, Wolfel T. J. Immmunotherapy of can-
cer: from vision to standard clinical practice // Cancer Res. Clin. Oncol. — 2004 [Epub ahead of print].
22. Lotem M„ Peretz T., Drize O. et al. Autologous cell vaccine as a post operative adjuvant treatment for high-risk melanoma patients (AJCC stages III and IV). The new American Joint Committee on Cancer // Br. J. Cancer. — 2002. — Vol. 86. — P. 1534-1539.
23. Matsumoto M., Seya T, Kikkawa S. et al. Interferon gamma-producing ability in blood lymphocytes of patients with lung cancer through activation of the innate immune system by BCG cell wall skeleton // Int. I mmunopharmacol. — 2002. — Vol. 1. — P. 1559-1569.
24. Ochsenbein A. F., Sierro S., Odermatt B. et al. Roles of tumour localization, second signals and cross priming in cytotoxic T-cell induction // Nature. — 2001.
— Vol. 411. — P. 1058-1064.
25. Ottosen G. L., Christensen I. J., Larsen J. K. et al. Tissue disaggregation for flow cytometric DNA analysis: comparison of fme-needle aspiration and an automated mechanical procedure // Cytometiy. — 1996. — Vol. 26.
— P. 65-68.
26. Pardoll D. M. Immunology and cancer // Clinical Oncology 3rd / Eds. M. D. Abeloff, J. O. Armitage,
J. E. Niederhuber et al. — Elsevier Electronic Image Collection to Accompany, 2004. — P. 679-686.
27. Pardoll D. M. Inducing autoimmune disease to treat cancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96. — P. 5340-5342.
28. Ribas A., Butterfield L. H., Glaspy J. A. et al. Current developments in cancer vaccines and cellular immunotherapy // J. Clin. Oncol. — 2003. — Vol. 21. — P. 2415-2432.
29. Saint F., Patard J. J., Salomon L. et al. Mechanisms of action of BCG: towards a new individualized therapeutic approach? // Prog. Urol. — 2000. — Vol.
10. —P. 1118-1126.
30. Shankar G., Pestano L. A, Bosch M. L. Interferon-gamma added during Bacillus Calmette-Guerini induced dendritic cell maturation stimulates potent Thl immune responses // J. Transl. Med. — 2003. — Vol. 1 — P. 7-12.
31. Shankaran V., Ikeda H., Bruce A. T. et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity // Nature.
— 2001. —Vol. 410. —P. 1107-1111.
32. Smith S. M., Brookes R., Klein M. R. et al. Human CD8+ CTL specific for the mycobacterial major secreted antigen 85A // J. Immunol. — 2000. — Vol. 165. — P. 7088-7095.
33. Sojka D. K., Felnerova D„ Mokyr M. B. Antimetastatic activity of hapten-modified autologous tumor cell vaccine in an animal tumor model // Cancer Immunol. Immunother. — 2002. — Vol. 51. — P. 200-208.
34. Sosman J. A. When will melanoma vaccines be proven effetive? // J. Clin. Oncol. — 2004. — Vol. 22. — P. 387-389.
35. Vermorken J., Claessen A., Gall H. et al. Randomized phase III trial of active specific immunotherapy vs control in patients with Duke’s B2, B3 or C colon cancer. Abstr. ECCO 9 // Eur. J. Cancer. — 1997. — Vol. 33 (Suppl. 8). — P. 162.
36. Vermorken J. B., Claessen A. M., van Tinteren H. et al. Active specific immunotherapy for stage II and stage III human colon cancer: a randomised trial // Lancet. — 1999. — Vol. 353. — P. 345-350.
37. Vilella R., Benitez D., Mila J. et al. Treatment of patients with progressive unresectable metastatic melanoma with a heterologous polyvalent melanoma whole cell vaccine // Int. J. Cancer. — 2003. — Vol. 106.
— P. 626-631.
38. Ward S., Casey D., Labarthe M.-C. et al. Immunotherapeutic potential of whole tumour cells // Cancer Immunol. Immunother. — 2002. — Vol. 51. — P. 351-357.
