CC BY
148
УДК 616.155.394.5
V.S. Polovinkina, V.S. Kosorukov
RECOMBINANT hGM-CSF IN ANTITUMOR THERAPY
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
ABSTRACT
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF) is one from hemopoietic growth factors' family stimulate the proliferation of myeloid precursor cells and activates mature granulocytes and macrophages. hGM-CSF stimulates the differentiation of hematopoietic progenitors to monocytes, neutrophils, eosinophils, macrophage and reduces the risk for febrile neutropenia in cancer patients. This review summarizes some of the structure, biologic and immunological effects of GM-CSF and describes the generation of novel reagents and vaccines for the treatment of cancer using fusion proteins and chemical modification.
Key words: hGM-CSF, neutropenia, pegylation, glycosylation, modification.
B.C. Половинкина, B.C. Косоруков*
РЕКОМБИНАНТНЫЙ чГМ-КСФ В ОНКОЛОГИИ
ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,
115478 Москва, Каширское ш., 24
РЕЗЮМЕ
Гpaнyлoцитapнo-мaкpoфaгaльный кoлoниecтимyлиpyющий фaктop чeлoвeкa (чГМ-^Ф) вxoдит в ce-мeйcтвo гeмoпoэтичecкиx фaктopoв poCTa, cтимyлиpyeт пpoлифepaцию миeлoидныx клeтoк-пpeдшecтвeнниц и aктивиpyeт зpeлыe гpaнyлoциты и мaкpoфaги. чГМ-^Ф cтимyлиpyeт диффepeнциpoвкy миeлoидныx кле-тoк-пpeдшecтвeнникoв мoнoцитoв, нeйтoфилoв, эoзинoфилoв, мaкpoфaгoв и cнижaeт pиcк paзвития феб-pильнoй нeйтpoпeнии y бoльныx пocлe цитocтaтичecкoй xимиoтepaпии в cвязи c paзличными oпyxoлeвыми зaбoлeвaниями. Oбзop cyммиpyeт дaнныe o cтpyктype, вoзмoжныx биoлoгичecкиx и иммyнoлoгичecкиx эф-фeктax чГM-КCФ, oпиcывaeт нoвoe пoкoлeниe пpoтивooпyxoлeвыx пpeпapaтoв и вaкцин, coздaвaeмыx нa ocнoвe гибpидныx гeннo-инжeнepныx кoнcтpyкций и xимичecкoй мoдификaции.
Ключевые слова: чГM-КCФ, нeйтpoпeния, пeгилиpoвaниe, гликoзилиpoвaниe, мoдификaция.
ВВЕДЕНИЕ
Toкcичecкoe вoздeйcтвиe лyчeвoй и xимиoтepaпии нa гeмoпoэтичecкиe т^ни и opгaны являeтcя oдним из ocнoвныx пpeпятcтвий нa пути эффективтого лечения oпyxoлeвыx зaбoлeвaний. Heгaтивнoe влияние цито-cтaтичecкиx пpeпapaтoв нa пpoцeccы гeмoпoэзa зa cчeт cнижeния кoличecтвa иммyнoкoмпeтeнтныx кле-тoк и угнєтєния иx функции мoжeт пpивoдить к paз-витию cмepтeльнo oпacныx инфекц^нньк ocлoжнe-ний, вызвaнныx нecпeцифичecкoй и ycлoвнo-пaтoгeннoй микpoфлopoй. Cнижeниe галичест^ им-
мyнoкoмпeтeнтныx клeтoк зaчacтyю является ocнoв-нoй пpичинoй пpepывaния и в нeкoтopыx cлyчaяx o^ мены xимиoтepaпии у oнкoлoгичecкиx бoльныx. Эф-фeктивнocть и peзyльтaтивнocть лечения пpи этoм мoжeт знaчитeльнo cнижaтьcя. Очевидвд, чтo peшe-ние пpoблeмы пoбoчныx эффeктoв xимиoтepaпии — oднa из aктyaльнeйшиx зaдaч coвpeмeннoй клиниче-cкoй oнкoлoгии. Becьмa интepecным, мнoгooбeщaю-щим нaпpaвлeниeм в этoй oблacти пpeдcтaвляeтcя paзpaбoткa и ycoвepшeнcтвoвaниe биoлoгичecкиx пpeпapaтoв, oкaзывaющиx cтимyлиpyющee дeйcтвиe
*Косоруков Вячеслав Станиславович — заведующий лабораторией трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей (ЭДиТО); тел. 324 14 59
Половинкина Валерия Сергеевна — научный сотрудник лаборатории трансгенных препаратов НИИ ЭДиТО
на гемопоэз. Гемопоэтический гомеостаз — сложный многоплановый процесс, регуляция которого осуществляется большим количеством факторов. Среди ге-мопоэтических факторов роста на данный момент огромное внимание уделяется идентификации, производству, усовершенствованию и клиническому применению миелоидных факторов роста, поскольку именно они в значительной мере влияют на рост и дифференцировку нейтрофилов, а также тромбоцитов, моноцитов/макрофагов и эозинофилов.
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека (чГМ-КСФ) — один из нескольких основных миелоидных факторов роста, применяемых в онкологической клинической практике для борьбы с нейтропеническими осложнениями [62]. Свое название этот видоспецифичный гликопротеид получил за способность образовывать in vitro колонии гранулоцитов и макрофагов из клеток-предшественниц костного мозга [43; 44].
СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ И РЕЦЕПТОРОВ
ГМ-КСФ человека — гликопротеид с молекулярной массой 22000 Да впервые был выделен из клеток Т-лимфобластоидной линии, инфицированной вирусом II человеческого Т-клеточного лейкоза [27]. чГМ-КСФ состоит из 144 аминокислотных остатков, с лидерной последовательностью из 17 аминокислот (69 % гомологии между молекулами человека и мыши на уровне нуклеотидов, 54 % идентичности на уровне аминокислот, однако межвидовой перекрестной реактивности не обнаружено) [13]. Длина гена, кодирующего чГМ-КСФ, 2,5 тыс. оснований, он состоит из небольшого числа экзонов, разделенных 3 интронны-ми последовательностями, и был картирован на длинном плече хромосомы 5(5q 21-q 32). В этом же районе находятся большинство генов гемопоэтических факторов роста и их рецепторов, таких как hIL-3, hIL-4, IL-5, М-КСФ [26; 39].
В определение биологической активности и ви-доспецифичности гликопротеида существенный вклад вносят регионы, включающие С-концевую и N-концевую части молекулы. Важную роль в сохранении третичной структуры и функций играют внутренние дисульфидные связи (Cys54-96 и Cys88—121), которые образуют 4 остатка цистеина, входящие в состав молекулы.
Кристаллическая структура рекомбинантного человеческого ГМ-КСФ представляет собой высококомпактную глобулярную структуру с гидрофобной центральной частью. Главный структурный элемент представлен пучком из 4 а-спиралей, которые составляют примерно 42 % объема молекулы и располагаются в виде антипараллельного пучка, закрученного влево. Внутренняя часть молекулы представляет собой двуспиральный антипараллельный бета-слой. N-концевая часть молекулы предположительно содержит большинство регионов, ответственных за связывание с рецептором [4; 5; 33].
Рецептор ГМ-КСФ построен из лиганд — специфической а-субъединицы и общей с ИЛ-3 и ИЛ-5 Р- субъединицы, которые относятся к суперсемейству гемопоэтических рецепторов. Поэтому на эозинофилы и базофилы ГМ-КСФ, ИЛ-3 и ИЛ-5 могут оказывать перекрывающееся по своим эффектам воздействие, конкурируя за связь с рецепторами. У рецептора ГМ-КСФ человека имеется единственная Р-субъединица, у рецептора ГМ-КСФ мыши были обнаружены 2 отдельные Р-субъединицы, одна из которых может взаимодействовать с а-субъединицей человека. Ген Р-субъединицы рецептора ГМ-КСФ человека картируется на хромосоме 22q31. Ген а-субъединицы чГМ-КСФ картируется в псевдоаутасомной области половых хромосом, у мыши этот ген аутосомный и локализуется на 19-й хромосоме. Существуют 3 изоформы рецептора ГМ-КСФ, образующиеся путем альтернативного сплайсинга, одна из которых, благодаря наличию трансмембранной делеции может существовать в свободной форме. Клетки различного типа и стадий дифференцировки с разной частотой экспрессируют эти изоформы, вследствие чего их реакция на ГМ-КСФ может различаться. Рецепторы ГМ-КСФ экспрессируются на нейтрофилах, эозинофилах, моноцитах, миелоидных предшественниках и миелолей-козных клетках.
Пути передачи сигнала, включающего цитоплаз-менную область рецептора и запускающего диффе-ренцировку и пролиферацию клеток, еще недостаточно изучены. Стимуляция клеток чГМ-КСФ приводит к фосфорелированию тирозина Р-субъединицы рецептора, что имеет большое значение для запуска сигналов активации и дифференцировки клеток. Важную роль в передаче сигнала играют тирозинкиназы, их ингибиторы блокируют пролиферативную реакцию на действие цитокина. Известно также, что после связывания лиганда с рецептором клеток происходит фос-форилирование целого ряда белков. Пролиферация миелоидных лейкозных клеток в ответ на ГМ-КСФ сопровождается активацией ряда MAP — киназ fc21ras, р42, р44.) [30].
ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ
В регуляции биологической активности зрелого гликопротеида участвуют также 2 сайта N-гли-козилирования (Asn27 и 37) и сайты О-глико-зилирования (Ser9, Ser7, Ser5 и Thr10) молекулы [18]. Физиологически нормальные эндотелиальные клетки и фибробласты человека могут синтезировать и секре-тировать этот фактор с вариациями молекулярной массы зрелого ГМ-КСФ от 14000 до 32000 Да. Эти различия обусловлены степенью гликозилирования молекулы, так что до 50 % ее состава могут быть представлены углеводами [24; 32]. Более полное представление о влиянии степени гликозилирования на биологическую активность чГМ-КСФ было получено после того, как стало возможным выделить его из разных источников и сравнить структуру и функции этих вариантов [15]. Впервые чГМ-КСФ был выделен
из клеток Т-лимфобластоидной линии, инфицированной вирусом II человеческого Т-клеточного лейкоза [27]. На данный момент существуют различные способы получения чГМ-КСФ. Данный гликопротеин возможно выделить из нативных источников, из культуры клеток человека (например, клетки костного мозга человека, среды, кондиционированные тканью легкого, плаценты или селезенки, среды, содержащие культуру клеток Мо Т-лимфоцитов, опухолевую клеточную линию 5637). Такой способ имеет много недостатков: трудоемкий и длительный процесс выделения в конечном итоге дает низкие количества чГМ-КСФ, часто конечный продукт загрязнен молекулами, оказывающими синергичный или ингибирующий эффекты, а также вирусы и прионы. Клонирование гена человеческого ГМ-КСФ и получение рекомбинантного белка чГМ-КСФ, экспрессированного в культуре клеток животных (например культура клеток яичника китайского хомячка — CHO), дрожжах (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) и бактериях (Escherichia coli), дало возможность получать большое количество биосинтетического чГМ-КСФ в значительно более короткие сроки. Экспрессия рекомбинантного чГМ-КСФ в различных продуцентах, бактериальных дрожжевых или эукариотических, придает конечному продукту определенный характер гликозилирования, который может отличаться от такового в человеческих клетках. чГМ-КСФ, экспрессированный в Escherichia coli, дает в итоге негликозили-рованный продукт, в клетках CHO обнаружены видоспецифичные профили гликозилирования. чГМ-КСФ, экспрессировнный в дрожжах, дает максимально гликозилированный тяжелый белок (28000 - 32000 Д). Получение всех этих форм рекомбинантного чГМ-КСФ дало возможность исследовать его биологическую активность и более полно изучить его функции при всех модификациях состава молекулы. Исследования показали, что с уменьшением молекулярной массы гликопротеина возрастает его биологическая активность. Так чГМ-КСФ, гликозилиро-ванный в 2 N-сайтах (28000 - 32000 Да), оказался менее активным, чем ГМ-КСФ, гликозилированный в одном N-сайте (23000 - 25000 Да). Негликозилиро-ванный чГМ-КСФ в 5 раз активнее полностью глико-зилированной формы в тестах стимуляции миелоид-ной пролиферации, в 10 раз активнее в тестах с измерением продукции активного кислорода и приблизительно в 100 раз эффективнее своего полностью гликозилированного аналога в тестах по связыванию с рецептором ГМ-КСФ [15; 40]. Особенно важно, что влияние гликозилирования на активность чГМ-КСФ продемонстрировано не только для продукта глико-зилированного в различных экспрессионных системах и в культурах клеток млекопитающих, но и для нативных гликопротеинов. Хотя вариации степени гликозилирования нативного чГМ-КСФ описаны достаточно подробно, роль этого явления еще недостаточно ясна. Существуют несколько гипотез о функциональном значении карбогидратных групп.
Эти группы могут быть важны для секреции гликопротеина и повышения стабильности молекулы [15].
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ чГМ-КСФ
ГМ-КСФ обладает рядом важных биологических эффектов:
а) стимулирует образование колоний эозинофи-лов, нейтрофилов, моноцитов, макрофагов, причем эозинофилы составляют примерно 30 % всех колоний. В опытах с использованием клонирования методом лимитирующих разведений высокоочищенные популяции клеток-предшественников костного мозга человека, освобожденные от добавочных клеток, под влиянием ГМ-КСФ формируют бурстобразующие единицы эритроидных предшественников (БОЕ-Э) и колониеобразующие единицы гранулоцитов - эритроцитов - макрофагов - мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ). Также было обнаружено: эффективность, с которой ГМ-КСФ оказывает стимулирующее влияние на по-липотентные клетки-предшественники, указывает на то, что они имеют рецепторы для данного цитокина. Стимуляция с использованием ГМ-КСФ приводит к образованию большего числа колоний в культуре клеток костного мозга, чем стимуляция с Г-КСФ [14; 46].
б) чГМ-КСФ способен регулировать свойства многих зрелых миелоидных клеток, таких, как грану-лоциты, макрофаги и эозинофилы, особенно во время иммунных и воспалительных реакций организма, он играет огромную роль при таких воспалительных и аутоиммунных заболеваниях человека, как ревматоидный артрит, астма, аутоиммунные патологии, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), гломерулонефрит [30].
в) ГМ-КСФ повышает выживаемость нейтрофи-лов, моноцитов, макрофагов и эозинофилов in vivo и in vitro, ингибируюя апоптоз и замедляя появление фрагментации ДНК. Данный цитокин также действует на неупорядоченную миграцию нейтрофилов. ГМ-КСФ активирует процессы дегрануляции нейтро-филов моноцитов, макрофагов и эозинофилов. Ней-трофилы, премированные ГМ-КСФ, приобретают способность высвобождать фактор активации тромбоцитов, арахидоновую кислоту, лейкотриены. Под воздействием ГМ-КСФ примерно в 15 раз возрастают хемолюминесценция и образование реактивных продуктов кислорода, увеличивается продукция NO, усиливаются противоинфекционные свойства (хемотаксис и фагоцитоз) нейтрофилов и моноцитов. Механизм такого воздействия связан с быстрой активацией ключевых ферментов на пути синтеза этих активных веществ. Таким образом, ГМ-КСФ повышает бактерицидную, антипаразитарную, противовирусную и противогрибковую активность нейтрофилов, моноцитов, макрофагов и эозинофилов по отношению к целому ряду инфекционных и паразитических агентов, таких как Staphylococcus aureus, Candida albicans, Trypanosoma cruzi, Torulopsis glabrata, Aspergillus hy-phae, Listeria monocytogenes и др [7; 27; 58].
г) ГM-КCФ мoдeлиpyeт ypoвeнь экcпpeccии paз-нooбpaзныx peцeптopoв нeйтpoфилoв, пoвышaeт эте-пpeccию мoлeкyл II ^acca глaвнoгo кoмплeкca racTO-coвмecтимocти (MHC), ycиливaeт aнтитeлoзaвиcимyю клeтoчнyю цитoтoкcичнocть пo oтнoшeнию к oпyxo-левым клeткaм. Лизиc клeтoк oпyxoли oбycлoвлeн тaкжe ycилeнным выcвoбoждeниeм дeфeнзинoв — белгав гpaнyл нeйтpoфилoв, пoвышaющиx пpoницae-мocть мeмбpaн oпyxoлeвыx клeтoк, a тaк же кaтeпcи-нoв и пpoтeaз нeйтpoфилoв [9]. чГM-КCФ yчacтвyeт в peгyляции экcпpeccии peцeптopoв мoнoцитoв, мaкpo-фaгoв, дeндpидныx клeтoк и клеток Лaнгepгaнca, ин-дyциpyeт э^^е^ию мoлeкyл fMLP, CD1, Fc-yII, CD40, CD34, иш^ри^в, пoвышaя пpoтивooпyxoлe-вую aктивнocть этиx клeтoк.
д) ГM-КCФ cтимyлиpyeт мoнoциты, мaкpoфaги и нeйтpoфилы cинтeзиpoвaть дpyгиe гeмoпoэтичecкиe фaктopы, тaкиe, кaк гpaнyлoцитapный кoлoниecтимy-лиpyющий фaктop (Г-КCФ), мaкpoфaгaльный кoлo-ниecтимyлиpyющий фaктop (M-КCФ), фaктop нeкpoзa oпyxoли ^HO), a тaкжe интepлeйкин-1, ин^лей^^ 6 и интepлeйкин-8 [41].
е) ГM-КCФ пoвышaeт жизнecпocoбнocть и ara™-нocть in vitro и in vivo бaзoфилoв чeлoвeкa, мoдyлиpy-ет peaкции гипepчyвcтвитeльнocти зaмeдлeннoгo ти-пa, индуц^ует xeмoтaкcиc бaзoфилoв, ГM-КCФ сти-мyлиpyeт paзвитиe клeтoчнoгo иммyннoгo oтвeтa [17; 38; 58; 59; 62].
ПРЕПАРАТЫ рчГМ-КСФ
Oдним из ocнoвныx ocлoжнeний пpи пpимeнeнии выcoкoдoзныx cxeм xимиoтepaпии для oнкoлoгичe-cкиx бoльныx являeтcя миeлocyпpeccия. Дo введения в клиничежую пpaктикy кoлoниecтимyлиpyющиx фaктopoв вoзмoжнocтeй выcoкoэффeктивнoй пpoфи-лaктики и лечения ocлoжнeний пoдoбнoгo poдa фaк-тичетеи не cyщecтвoвaлo. Чacтичнo cмягчaть пocлeд-cтвия миeлocyпpeccивнoгo дeйcтвия xимиoтepaпии yдaвaлocь зa cчeт уменьшения дoзы пpeпapaтoв, зa-дepжки cлeдyющeгo циклa лечения. Для ^еду^еж-дения и бopьбы c инфекциями, вoзникaющими нa фo-не нeйтopпeнии, пaциeнтaм нaзнaчaютcя am^a^ep^ aльныe пpeпapaты, тaкжe oблaдaющиe pядoм cepьeз-ныx пoбoчныx эффeктoв[10; 28; 31].
^к пpaвилo, пpeпapaты pчГM-КCФ пpeдcтaвляют coбoй вoдopacтвopимый бeлoк, гликoзилиpoвaнный или не гликoзилиpoвaнный, cocтoящий из 127 aминo-киcлoтныx ocтaткoв, cтaбилизиpoвaнный, в жидкoй или лиoфилизиpoвaннoй фopмe. Чeтыpe пpeпapaтa peкoмбинaнтнoгo чeлoвeчecкoгo ГM-КCФ были пpo-вepeны в paндoмизиpoвaнныx иccлeдoвaнияx. Capi'pa-мocтим (pчГM-КCФ, пoлyчaeмый из S. cerevisiae, пoд тopгoвым нaзвaниeм Leukine®, пpoизвoдитeль Immu-nex) был paзpeшeн к пpимeнeнию в CШA, мoлгpaмo-cтим (pчГM-КCФ, пoлyчaeмый из E. coli, тopгoвoe нaзвaниe Leucomax®, пpoизвoдитeли Schering-Plough и Sandoz) paзpeшeн в нeкoтopыx cтpaнax Eвpoпы. Клиничecкиe иccлeдoвaния этиx двyx пpeпapaтoв еще вeдyтcя в дpyгиx ci'pamx. 2 дpyгиx пpeпapaтa: pe^a-
мостим (из клеток СНО, производитель Sandoz) и эко-грамостим (Е. соН, производитель Behringwerke) в настоящее время больше не производятся для клинического применения [10; 21; 28; 31; 38; 58].
ПРИМЕНЕНИЕ
Наиболее частым проявлением гематологической токсичности является нейтропения и связанные с ней инфекционные осложнения. Профилактика нейтропе-нии и борьба с уже развившейся нейтропенией и ней-тропеническими осложнениями — основные направления использования лекарственных препаратов на основе чГМ-КСФ.
В соответствии с определением Американского общества инфекционных болезней (IDSA) под фебрильной нейтропенией следует понимать однократное повышение температуры, измеренной в ротовой полости, выше 38,3 °С или сохранение температуры выше 38,0 °С более 1 ч у больных с нейтропенией менее 0,5 х 109/л (или менее 1,0 х 109/л с высокой вероятностью ее снижения менее 0,5 х 109/л в течение сут). Согласно определению Европейского общества медицинской онкологии (ESMO) фебрильная нейтро-пения характеризуется повышением температуры в подмышечной области выше 38,5 °С в течение 1 ч и более при одновременном абсолютном числе нейтро-филов (АЧН) в крови менее 0,5 х 109/л (<500 нейтро-филов в 1 мм3).
Как показано в ряде исследований, частота развития тяжелых инфекций напрямую зависит от глубины и длительности нейтропении (глубокая длительная нейтропения — предполагаемая продолжительность >7 дней). На фоне нейтропении течение инфекции имеет ряд особенностей. Нейтропеническая инфекция в силу снижения иммунной защиты пациента склонна к быстрому прогрессированию и без адекватного лечения может привести к гибели пациента в короткие сроки. Кроме того, нейтропения затрудняет диагностику инфекции, так как не дает в полной мере развиться признакам воспаления и инфекция протекает без формирования тканевого очага. Зачастую повышение температуры тела является единственным проявлением инфекционного процесса.
Наибольшее применение препараты рчГМ-КСФ получили в профилактике нейтропении и нейтропе-нических осложнений у больных с глубоким снижением нейтрофилов крови после цитостатической химиотерапии в связи с различными опухолевыми заболеваниями. Препараты рчГМ-КСФ широко используются в онкологической практике в следующих случаях: при первичной профилактике в течение 1-го курса химиотерапии для предотвращения инфекционных осложнений, связанных с нейтропенией, если риск фебрильной нейтропении выше 40 %; препараты применяются и для вторичной профилактики в течение последующих курсов химиотерапии при наличии фебрильной нейтропении в течение 1-го курса химиотерапии с целью уменьшения числа инфекционных осложнений и для сохранения нужной интен-
сивности химиотерапии. Также рчГМ-КСФ используется после трансплантации стволовых клеток костного мозга для усиления гемопоэза [6; 48].
рчГМ-КСФ используется в качестве первичного профилактического средства для предотвращения глубокой нейтропенической лихорадки после интенсивной цитотоксической химиотерапии или тотального облучения тела с последующей трансплантацией аутологичного или аллогенного костного мозга у больных острым лимфолейкозом (ОЛЛ), неходж-скинской лимфомой (НХЛ), лимфогранулематозом, острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), множественной миеломой (ММ), миелодиспластическим синдромом (МДС), и не только. В этом случае отмечается ускоренное восстановление нейтрофилов в крови, уменьшение потребности в антибиотиках. Кроме того, в рамках рандомизированных исследований с использованием рчГМ-КСФ не было отмечено увеличения частоты осложнений реакции типа «трансплантант против хозяина» или отторжения трансплантанта. Наблюдалось восстановление нормального донорского миелопоэза, активация пролиферации донорских клеток-предшественников [21; 25; 49].
Назначение ГМ-КСФ увеличивает сниженную продукцию перекисных соединений нейтрофилами и их хемотаксис после аллогенной трансплантации костного мозга. ГМ-КСФ также стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов у больных после аутологичной трансплантации костного мозга [25].
При помощи рчГМ-КСФ также проводится мобилизация клеток-предшественников для постхимиоте-рапевтической профилактики нейтропении, а также тромоцитопении. В результате проведения высоко-дозной интенсивной химиотерапии в сочетании с поддерживающей терапией рчГМ-КСФ для созревания клеток из эндогенного костного мозга или аутотрансплантанта в некоторых случаях требуется определенное время, так называемый интервал восстановления. В этот период необходимо снизить дефицит нейтрофилов. Для этого осуществляют трансплантацию клеток-предшественников периферической крови, мобилизированных с помощью рчГМ-КСФ. Сбор клеток осуществляется у больных перед проведением химиотерапии при помощи лейкафереза. При использовании рчГМ-КСФ в циркулирующей крови пациента достигается высокое содержание клеток-предшественников и, как правило, для мобилизации нужного количества клеток достаточно одной процедуры лейкафереза. Мобилизованные клетки хранятся, а затем трансплантируются больному после высоко-дозной химиотерапии [34].
Таким образом, назначение миелоцитокинов в онкологии, в частности ГМ-КСФ, укорачивает длительность нейтропении, снижает частоту развития инфекции и длительность терапии антибиотиками, повышает качество жизни больного [3; 6; 28; 48].
Препараты рчГМ-КСФ нашли применение в борьбе с нейтропенией, возникающей также на фоне терапии различных вирусных инфекций. Так, при циррозе
печени, особенно декомпенсированном, возникшем на фоне гепатитов В и С, намного чаще возникают гематологические осложнения: анемия, нейтропения, лейкопения и тромбоцитопения, из-за чего нередко приходится снижать дозы противовирусных препаратов, что сказывается на эффективности лечения. Для профилактики и лечения таких гематологических осложнений все шире стали использовать препараты колониестимулирующих факторов, в частности, чГМ-КСФ (сарграмостим и молграстим) [10; 22; 31]. Кроме того, чГМ-КСФ применяется для восстановления функций и количества нейтрофилов, нарушенных вследствие таких заболеваний, как ВИЧ-инфекция, иммунодефицит пожилых, и других заболеваний, сопровождаемых снижением уровня нейтрофилов в крови.
чГМ-КСФ применяется также в терапии травм позвоночника, осложненных повреждением спинного мозга. Такие травмы зачастую приводят к инвалидиза-ции пациентов, и ни оперативные вмешательства, ни реабилитационные мероприятия и медикаментозная терапия не устраняют основной причины заболевания: повреждения невральных структур спинного мозга. Сегодня предпринимаются попытки решения данной проблемы. В комплекс лечебных мероприятий, направленных на борьбу с травматической болезнью спинного мозга, вошли клеточные технологии. Применение их в неврологической практике — трансфузии и трансплантации аутологичных модифицированных стволовых клеток (МСК) — показало хорошие результаты. Мобилизация стволовых (CD34+) периферических клеток у больных травматической болезнью спинного мозга проводится при назначении колониестимулирующих факторов, в том числе препаратов чГМ-КСФ. Под действием этих факторов концентрация стволовых гемо-поэтических клеток крови возрастает в 100 - 1000 раз, что позволяет собрать эти клетки и использовать для трансплантации [57]. Трансплантация клеток костного мозга в поврежденную область спинного мозга в сочетании с терапией чГМ-КСФ показала способность предотвращать апоптоз не только гемопоэтических, но и нейрональных клеток в области травмы спинного мозга. чГМ-КСФ может вызывать мобилизацию прогени-торных клеток из костного мозга в периферическую кровь, активировать макрофаги в зоне повреждения спинного мозга, элиминировать «миелиновый дебрис» и поддерживать аксональную регенерацию [16; 29; 36].
чГМ-КСФ нашел применение и в иммунотерапии злокачественных новообразований. Так, чГМ-КСФ используется в противоопухолевых АПК-вакцинах, получаемых на основе антиген-презентирующих клеток, в клеточных, генно-инженерных, пептидных, антигенных вакцинах, аулологичных и аллогенных вакцинах. чГМ-КСФ обладает иммуномодулирующим эффектом и низким токсическим профилем. Он стимулирует активность миелоидных клеток костного мозга, играет ключевую роль в созревании и миграции АПК-клеток. Культивирование АПК-клеток в присутствии чГМ-КСФ повышает экспрессию антигенов HLA II класса и костимулирующих молекул. Тем са-
мым чГМ-КСФ участвует в создании напряженного противоопухолевого иммунитета.
В некоторых случаях чГМ-КСФ входит в состав противоопухолевых вакцин или вводится в организм совместно с вакциной в качестве эффективного адъюванта, в других — используется в процессе получения вакцины [16]. Так, чГМ-КСФ используется при изготовлении вакцин на основе дендритных клеток (ДК). ДК являются уникальными АПК-клетками, в процессе приготовления вакцины они поглощают антигены (АГ) из лизата опухолевых клеток, процессируют и представляют их в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости I или II (МНС, major histocompatibility complex), генерируя таким образом специфический иммунный ответ, опосредованный цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). ДК подобно макрофагам и гранулоцитам являются CD33+ (позитивными) и проявляют чувствительность к ГМ-КСФ, но не отвечают на воздействие Г-КСФ и М-КСФ. Экспериментально было доказано, что ДК происходят из костномозговых стволовых CD34+ клеток, причем вероятнее всего из предшественников миело-идного ряда. Таким образом, для того, чтобы генерировать зрелые ДК из моноцитов, выделенных из пе-реферической крови или раневого экссудата пациента, эти клетки-предшественники культивируют в присутствии чГМ-КСФ [55; 56; 63]. Клинические испытания ДК-вакцин были выполнены на разных типах опухолей, включая В-клеточную лимфому, миелому, рак толстой кишки, рак предстательной железы, меланому и глиому. У большинства больных после адаптивной терапии с использованием антиген-презентирующих ДК, ассоциированных с ГМ-КСФ, вырабатывался ан-тигенспецифический иммунный ответ и наблюдалась регрессия метастазов [55; 56; 58].
Эффективность противоопухолевых вакцин можно усилить путем повышения иммуногенности опухолевых антигенов, что достигается различными методами: использованием адъювантов, химической модификацией при помощи гаптенов, модификацией непатогенными вирусами и бактериями, а также трансфекцией различных генов, в том числе гена, кодирующего продукцию чГМ-КСФ. Так, доклинические исследования генно-инженерных вакцин показали, что вакцины на основе аутологичных или алло-генных опухолевых клеток, модифицированных геном, экспрессирующим чГМ-КСФ, активно привлекают АПК, стимулируют захват и экспрессию опухолевых антигенов, активно участвуют в формировании устойчивого противоопухолевого иммунного ответа. Рост опухоли в этом случае подавляется с участием нейтрофилов, эозинофилов и макрофагов. Было показано на модели меланомы В16, что при вакцинации ее сингенными клетками, секретирующими чГМ-КСФ, противоопухолевый иммунный ответ был более сильный и длительный по сравнению с вакцинами, секре-тирующими другие цитокины. С помощью вакцин на основе чГМ-КСФ удалось достичь полной ремиссии при лимфоме человека [47; 53; 54]. Вирус папилломы
человека тип 16 (HPV 16) более, чем в 60 % от всех случаев заражения является этиологическим агентом цервикальной карциномы. В настоящее время в клинической практике используются 2 профилактические вакцины против HPV 16 (GlaxoSmithKline «Cervarix» и Merck «Gardasil»). Эти вакцины могут защитить иммунизированных индивидуумов как от HPV16-инфекций, так и от HPV16-ассоциированной цервикальной карциномы. В настоящий момент клинические испытания проходит терапевтическая противоопухолевая АПК-вакцина, в которой ДК модифицированы геном, экспрессирующим чГМ-КСФ, и конструкцией, содержащей гены HPV16, кодирующие белки E6/E7. Данную вакцину предполагается применять уже при развившейся цервикальной карциноме [12].
Получены векторные вакцины на основе рекомбинантных штаммов бацилл Кальметта-Герена (БЦЖ), секретирующих чГМ-КСФ. Изначально БЦЖ была разработана как вакцина против инфекции, вызывающей туберкулез, но позднее было обнаружено, что она оказывает и противоопухолевое воздействие. Предварительные исследования показывают высокую эффективность таких вакцин в отношении рака мочевого пузыря [1; 16; 51].
чГМ-КСФ довольно эффективно применяется и в качестве адъюванта совместно с противоопухолевыми вакцинами. чГМ-КСФ усиливает иммунную реакцию на чужеродные и собственные опухолеассоциированные антигены, повышает активность вакцины.
Иммунотерапия злокачественных новообразований — сравнительно новое направление, и многие исследования еще находятся на стадиях предклиниче-ских и клинических испытаний. Но уже на этом этапе становится очевидным, что чГМ-КСФ будет играть в этом направлении огромную роль.
НОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ рчГМ-КСФ
Повысить клиническую эффективность лекарственного препарата можно различными методами. Некоторые из них так или иначе связаны с изменением структуры препарата. Однако принципиальные изменения химической структуры молекулы может повлечь за собой такие изменения биологических свойств, которые сделают невозможным его клиническое использование. Одним из возможных путей повышения эффективности белковых препаратов без принципиального нарушения их строения является структурно-химическая модификация
Структурно-химическая модификация и усовершенствование рекомбинантной молекулы чГМ-КСФ придают ей новые свойства, усиливают биологическую активность и расширяют спектр биологических воздействий, что позволяет создавать препараты нового поколения, обладающие рядом преимуществ по сравнению со старыми. Модификации рекомбинантного цитокина позволяют создавать препараты направленного действия, обладающие улучшенными фармакодинамикой, фармакокинетикой и биологиче-
ской доступностью. Усовершенствования подобного типа также дают возможность повысить физиологическую и химическую устойчивость препаратов на основе рчГМ-КСФ.
На сегодняшний день разработаны и реализуются 2 основных пути модификации рчГМ-КСФ: первый — модификация при помощи ковалентного присоединения полиэтиленгликоля (ПЭГ), второй — создание гибридных генно-инженерных конструкций [42].
ПЭГ-МОДИФИКАЦИЯ
Относительно короткий период полувыведения белковых препаратов из организма пациента предполагает их многократное введение для достижения требуемого терапевтического эффекта. Повысить устойчивость белковой молекулы к деградации, а также улучшить ряд других ее параметров возможно с помощь модификации ПЭГ.
Исследование модифицирующих свойств поли-этиленгликоля началось еще в 70-х гг. прошлого столетия, и к настоящему моменту ПЭГ одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в качестве субстанции, разрешенной для производства лекарственных препаратов, продуктов питания и косметических средств. ПЭГ — это гидрофильный полимер окиси этилена. Он может иметь различную молекулярную массу и стереохимическую структуру (разветвленная и линейная), а также различные способы присоединения к белковой молекуле. Именно эти факторы определяют принципиальные изменения фармакокинетических и фармакодинами-ческих параметров и свойств модифицированного пептидного субстрата. Так, например, с увеличением массы молекулы ПЭГ происходит увеличение периода полувыведения модифицированного белкового препарата из организма и повышение его фармакологической стабильности. Наличие более разветвленной структуры молекулы или 2 и более линейных молекул ПЭГ, присоединенных к белку, замедляет активный метаболизм препарата и тем самым увеличивает время его циркуляции. Снижение иммуногенности модифицированного белка также связано с разветвленной структурой ПЭГ.
Молекулы ПЭГ обладают высокими гидрофильными свойствами, благодаря которым вокруг модифицированной таким образом белковой молекулы образуется своего рода защитный экран из воды, повышающий ее гидродинамический радиус. Это помогает защитить молекулу от разрушения ферментами и предотвратить опсонизацию и эндоцитоз. Присоединение ПЭГ повышает устойчивость белкового препарата к деградации, делает его более термостабильным, улучшает фармакокинетику, вследствие чего обеспечивает уменьшение его почечного клиренса и увеличивает период полувыведения из плазмы. ПЭГ за счет повышения растворимости увеличивает биологическую доступность препарата. Такая химическая модификация структуры белковых молекул направлена на улучшение переносимости препарата при сохране-
нии его фармакологических свойств и в конечном итоге на улучшение качества жизни больного при проведении терапии [11; 20; 42].
Что касается подобной модификации рчГМ-КСФ, то на сегодняшний день существуют 2 метода его пе-гелирования — присоединения ПЭГ к белку. Первый метод основывается на неспецифической химической конъюгации молекулы ПЭГ к аминокислотным остаткам рчГМ-КСФ. Для связи с молекулами рчГМ-КСФ используется монометоксиПЭГ; его молекула имеет 1 гидроксильную группу, с которой и происходит связывание пептида, другие концы молекулы содержат нереактогенные метильные группы. Образующиеся при этом многочисленные изоформы с различными местами прикрепления ПЭГ к белку могут обладать самыми разными химическими фармацевтическими и биологическими свойствами. Также необходимо учитывать, что в случае присоединения ПЭГ к сайтам, обусловливающим активность молекулы, образуются изоформы со сниженной или даже полностью отсутствующей биологической активностью [11; 20].
Эта проблема преодолевается при помощи 2-го метода — так называемого сайт-специфического или ферментативного пегелирования. Для того, чтобы осуществить такую специфическую реакцию, используются негликозилированный рчГМ-КСФ, экспрессированный в E. Coli, и линейный метоксиПЭГ размером 20кДа, коньюгированный с сиаловой кислотой. С помощью a-N-ацетилгалактозаминтрансферазы осуществляется специфическое ферментативное a-N-ацетилгалактозамин (GalNAc) — гликозилирование рчГМ-КСФ по остаткам серина и треонина. Следующим этапом модификации молекулы является ферментативное присоединение GalNAc — остатка молекулы к сиаловой кислоте, конъюгированной с ПЭГ. В этом случае ПЭГ присоединяется только к сайтам О-гликозилирования цитокина (Ser7, Ser9 и сайт Thr10), и все области, отвечающие за активность молекулы, остаются свободными.
Модифицированный при помощи полиэтиленгли-коля чГМ-КСФ на данный момент проходит клинические испытания. В настоящее время многие другие лекарственные белки находятся на разных стадиях предклинических и клинических испытаний (ПЭГ -модифицированные: каталаза, уриказа, стрептокиназа, супероксиддисмутаза, L-аспарагиназа и др.) или уже нашли применение в клинической практике. Так, пе-гилированный чГ-КСФ Filgrastim™ (Amgen) получил название Pegfilgrastim™ (Amgen), ПЭГ-интерферона-альфа 2а называется Пегасис (Hoffmann La Roche), а ПЭГ-интерферона-альфа 2b — Пегинтрон (Shering Plough) [18; 50].
ГИБРИДНЫЕ БЕЛКОВЫЕ КОНСТРУКЦИИ
На данный момент на стадии предклинического и начальных фаз клинического исследования находятся несколько типов гибридных конструкций на основе рчГМ-КСФ, обладающих направленным действием.
Их применение позволит избежать использования высоких терапевтических доз рекомбинантного цито-кина, которые в комбинации с химиотерапией могут оказывать токсическое воздействие. Химерные конструкции такого типа дадут возможность усилить иммунный ответ против предварительно выбранного типа клеток, например опухолевых или зараженных вирусом [60].
Гибридные конструкции 1-го типа представляют собой химерную молекулу, слитую из рчГМ-КСФ и рекомбинантного человеческого белка, обладающего полезными биологическими свойствами и в функциональном значении дополняющего цитокин.
Гибридные конструкции 2-го типа — это конструкции на основе чГМ-КСФ, слитого с различными фрагментами антител (Ат) или антигенов (Аг).
Примером конструкции 1-го типа может служить химерный белок ГМ-КСФ-Bcl-XL. ГМ-КСФ в данной химерной конструкции выступает в роли связующего звена, которое соединяет химерный белок с рецепторами на поверхности клеток миелоидного ростка кроветворения. Он также участвует в регуляции пролиферации и дифференцировки нейтрофилов, эозинофи-лов и макрофагов. А Bcl-XL играет активную роль в предотвращении апоптоза этих клеток, усиливая таким образом воздействие цитокина. Bcl-XL — белок, относящийся к семейству Bcl-2 (bcl-2 протоонкоген, активируемый хромосомной транслокацией в В-клеточной лимфоме человека от англ. B-cell CLL/lymphoma 2). В нормальной клетке Bcl-XL находится как в свободном состоянии в цитозоле, так и прикрепленным к митохондриальной мембране.
Одной из основных биологических активностей данного белка является способность подавлять апоп-тоз многих типов клеток in vitro и in vivo, вызванный различными сигналами. Этот белок играет ключевую роль в негативной регуляции проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С и различных апоптогенных факторов. Участвует в негативной регуляции фактора индукции апоптоза - протеазы AIF (от англ. Apoptosis Inducing Factor), предотвращая тем самым расщепление ряда ядерных белков каспазо-независимым путем. Также Bcl-XL участвует в подавлении активности таких протоапоптотических белков своего семейства, как Bax и Bak [2].
Конструкция ГМ-КСФ-Bcl-XL защищает клетки от гибели и индуцирует их пролиферацию в присутствии различных апоптотических агентов. Так, исследования показали, что химерный белок ГМ-КСФ-Bcl-XL способен увеличивать время пролиферации человеческих моноцитов в культуре клеток с 24 ч до 72 ч в тесте стимуляции пролиферации клеточной линии HL-60. Благодаря чГМ-КСФ домену химерная конструкция ГМ-КСФ-Bcl-XL индуцирует также дифференцировку миелоидных клеток-предшественников [8].
В течении многих лет антитела использовали главным образом для создания пассивного иммунитета к вирусным и бактериальным инфекциям. С недавнего времени антитела и гибридные белковые конст-
рукции на основе моноклональных антител (мАТ) стали использоваться в качестве противоопухолевых препаратов. Противоопухолевая активность таких агентов была продемонстрирована по отношению к опухолям, доступным для циркулирующих антител, например, для лимфом, а также для микрометастати-ческих очагов, солидных опухолей небольшого размера.
Создание конструкций на основе фрагментов антитела, слитого с цитокином, позволило сочетать в себе их свойства. Как правило, в гибридных конструкциях используются вариабельные участки, ответственные за связывание с целевым антигеном - Fc или Fab. Функциональные элементы антител в такой химерной конструкции отвечают за специфичность связывания химерного белка с целевыми антигенами (Аг) на поверхности предварительно выбранного типа клеток, а цитокин участвует в формировании иммунного ответа против этих клеток-мишеней.
ГМ-КСФ-мАТ слитые белки на стадии предкли-нических испытаний и начальных фаз клинических исследований демонстрируют прямую противоопухолевую активность в монотерапии, могут применяться в качестве адъюванта для противоопухолевых и антивирусных вакцин, способствуют активации вторичного противоопухолевого иммунного ответа. Примером такого типа конструкций могут послужить рекомбинантные белки, состоящие из чрГМ-КСФ, слитого с фрагментами моноклональных антител chTNT-1, chTNT-2 или chTNT-3 (от англ. chimeric Tumor Necrosis Treatment). Данные мАТ созданы на основе генов Суперсемейства Фактора Некроза Опухоли (TNFSF -Tumor Necrosis Factor Superfamily). Это конструкции направленного действия, целью которых являются стабильные внутриклеточные антигены, представленные во всех типах клеток, но доступные только после их гибели. Предклинические исследования показали полный регресс солидных опухолей у крыс.
Примером химерных конструкций, содержащих чГМ-КСФ и обладающих противовирусной активностью, могут служить конструкции рчГМ-КСФ, слитого с поверхностым антигеном вируса гепатита В HBsAg (Hepatitis B virus surface Antigen). HBsAg — основной маркер острого и хронического гепатита В, липопротеид по химическому составу, ответственный за адсорбцию вируса на поверхности гепатоцитов. Чрезвычайно важной особенностью HBsAg являются его хорошие вакцинные свойства.
Рекомбинантные вакцины на основе HBs-антигена обеспечивают защиту от гепатита В только на 5 - 7 лет. Исследования на мышах показали, что иммуно-генность химерной конструкции HBsAg-ГМ-КСФ оказалась выше, чем у рекомбинантного HBsAg [19; 23; 35; 37; 45; 52; 61].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование в клинической практике рекомбинантных гемопоэтических факторов роста, в частности рчГМ-КСФ, дало возможность более эффективно
бороться с угнетением миелоидного кроветворения, которое часто развивается вследствие применения лекарственных веществ, используемых в высоких дозах для противоопухолевой и противовирусной терапии, а также решило проблему усиления гемопоэза при терапии целого ряда заболеваний, сопровождаемых снижением уровня нейтрофилов в крови. Применение препаратов рчГМ-КСФ сокращает длительность нейтропении, снижает частоту развития нейтропени-ческой инфекции и длительность терапии антибиотиками, повышает качество жизни больного.
Кроме того, рчГМ-КСФ активно применяется в иммунотерапии злокачественных новообразований, входит в состав широкого круга противоопухолевых вакцин и используется в процессе их изготовления.
Благодаря успехам, достигнутым в молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии, перед исследователями открылись новые перспективы усовершенствования препаратов, вакцин на основе рчГМ-КСФ, а также создания и исследования препаратов следующего поколения, обладающих улучшенными фармакодинамикой, фармакокинетикой, биологической доступностью и спектром новых свойств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень СО РАМН. - 2004. -Т 112, №2. - C. 59-63.
2. Канцерогенез / Под ред. Д.Г. Заридзе. - М., 2004. - 576 с.
3. Минимальные клинические рекомендации Европейского Общества Медицинской Онкологии (ESMO) / Под ред. С.А. Тюляндин, Н.И. Переводчи-кова, Д.А. Носов. - M.: Издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003. - 80 с.
4. Altmann, S.W., Kastelein R.A. Rational design of a mouse granulocyte macrophage-colony-stimulating factor receptor antagonist // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 2233-2240.
5. Altmann, S.W., Patel N., Kastelein R.A. Involvement of the fourth alpha-helix of mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in binding to the alpha-subunit of the receptor complex // Growth Factors.
- 1995. - Vol. 12. - P. 251-262.
6. American Society of Clinical Oncology. Re-commmendations for the Use of Hematopoietic Colony-Stimulating Factors: evidance-based clinical practice guidelines // J Clin Oncol. - 1994. - Vol. 12. - P. 2471-508.
7. Anding K., Kropec A., Schmidt-Eisenlohr E. et al. Enhancement of in vitro bactericidal activity of neutrophils from trauma patients in the presence of granulocyte colony-stimulating factors // Eur J Clinical Microbiol and Infect Dis. - 1993. - Vol. 12. - P. 121-124.
8. Antignani A., Youle R.J. The cytokine, granulo-cyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), can deliver Bcl-XL as an extracellular fusion protein to protect cells from apoptosis and retain differentiation induction // J Biol Chem. - 2007. - Vol. 282, № 15. - P. 11246-11254.
9. Baldwin G.C., Chung G.Y., Kaslander C. et al. Colony-stimulating factor enhancement of myeloid effector cel cytotoxicity towardsneuroectodermal tumour cells // Br. J. Haemat. - 1993. - Vol. 83. - P. 545-553.
10. Berghmans T., Paesmans M., Lafitte J.J. et al. Therapeutic use of granulocyte and granulocyte macrophage colony-stimulating factors in febrile neutropenic cancer patients. A systematic review of the literature with meta-analysis // Support Care Cancer. - 2002. - Vol. 10. -P. 181-188.
11. Bruce A. Clinical considerations in pegylated protein therapy // From Reserch to Practice. - 2001. -Vol. 3. - P. 3-9.
12. Bubenik J. Genetically modified cellular vaccines for therapy of human papilloma virus type 16 (HPV 16)-associated tumours // Curr Cancer Drug Targets. - 2008. -Vol. 8, № 3. - P. 180-186.
13. Cantrell M.A., Anderson D., Cerretti D.P. et al. Cloning, sequence, and expression of human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor // Immunology. - 1985. - Vol. 82. - P. 6250-6254.
14. Cao X., Zhao Y., Yu Y. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces the differentiation of murine erythroleukaemia cells into dendritic cells // Immunology. - 1998. - Vol. 95, № 1. - P. 141147.
15. Cebon J., Nicola N., Ward M. et al. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity // J. Biol. Chem. - 1990. - Vol. 265. - P. 4483-4491.
16. Chang D.Z., Lomazow W., Joy Somberg C., Stan R., Perales M.A. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor: an adjuvant for cancer vaccines // Hematology. - 2004. - Vol. 9, № 3. - P. 207-215.
17. Danis V.A., Franic G.M., Rathjen D.A., Brooks P.MEffects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), IL-2, interferon-gamma (IFN-gamma), tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and IL-6 on the production of immunoreactive IL-1 and TNF-alpha by human monocytes // Clin Exp Immunol. -1991. - Vol. 85, №1. - P. 143-150.
18. DeFrees S., Wang Z., Xing R. et al. GlycoPegyla-tion of recombinant therapeutic proteins produced in E. coli // Glycobiology. - 2006. - Vol. 16, № 9. - P. 833843.
19. Dela Cruz J.S., Huang T.H., Penichet M.L., Morrison S.L. Antibody-cytokine fusion proteins: innovative weapons in the war against cancer // Clin Exp Med. -
2004. - Vol. 4, № 2. - P. 57-64.
20. Delgado C., Francis G. E., Fisher D. The uses and properties of PEG-linked proteins // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. - 1992. - Vol. 9. - P. 249-304.
21. DeWitte T., Gratwohl A., Van Der Lely N. et al. Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimuiating factor accelerates neutrophil and monocyte recovery after allogeneic T-cell - depleted bone marrow transplantation // Blood. - 1992. - Vol. 79, № 5. - P. 1359-1365.
22. Dieterich D.T. Treatment of hepatitis C and anemia in human immunodeficiency virus infected patients // J Infect Dis. - 2002. - Vol. 185, № 2. - P. 128-S137.
23. Egilmez N.K., Kilinc M.O., Gu T., Conway T.F. Controlled-release particulate cytokine adjuvants for cancer therapy // Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. - 2007. - Vol. 7, № 4. - P. 266-270.
24. Ernst J.F., Mermod J.J., Richman L.H. Site-specific O-glycosylation of human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor secreted by yeast and animal cells // Eur. J. Biochem. - 1992. - Vol. 203. - P. 663-667.
25. Gadish M., Kletter Y., Flidel O. et al. Effects of recombinant human granulocyte and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors on neutrophil function following autologous bone marrow transplantation // Leuk Res. - 1991. - Vol. 15, № 12. - P. 11751182.
26. Gasson J.C. Molecular Physiology of Granulo-cyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor // Blood. -1991. - Vol. 77, № 6. - P. 1131-1145.
27. Gasson J.C., Weisbart R.H., Kaufman S.E. et al. Purified human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: direct action on neutrophils // Science.
- 1984. - Vol. 226, № 4680. - P. 1339-1342.
28. Gisselbrecht C., Haioun C., Lepage E. et al. Placebo-controlled phase III study of lenograstim (glycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor) in aggressive non-Hodgkin's lymphoma: factors influencing chemotherapy administration // Leuk Lymphoma. - 1997. - Vol. 25, № 3-4). - P. 289-300.
29. Ha Y., Kim Y.S., Cho J.M. et al. Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) prevents apoptosis and improves functional outcome in experimental spinal cord contusion injury // J Neurosurg. -
2005. - Vol. 2. - P. 55-61.
30. Hamilton J.A., Anderson G.P. GM-CSF Biology // Growth Factors. - 2004. - Vol. 22, № 4. - P. 225-231.
31. Hubel K., Dale D.C., Liles W.C. Therapeutic use of cytokines to modulate phagocyte function for the treatment of infectious diseases: current status of granulocyte colony-stimulating factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, macrophage colony-stimulating factor, and interferon-gamma // J Infect Dis. - 2002. -Vol. 185, № 10. - P. 1490-1501.
32. Kaushansky K., Lopez J.A., Brown C.B. Role of carbohydrate modification in the production and secretion of human granulocyte macrophage colony-stimulating factor in genetically engineered and normal mesenchymal cells // Biochemistry. - 1992. - Vol. 31. - P. 1881-1886.
33. Kaushansky K., Shoemaker S.G., Alfaro S., Brown C. Hematopoietic activity of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is dependent upon two distinct regions of the molecule: functional analysis based upon the activities of interspecies hybrid growth factors // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1989. -Vol. 86. - P. 1213-1217.
34. Kessinger A., Armitage J.O. The evolving role of autologous peripheral stem cell transplantation following
high-dose therapy for malignancies // Blood. - 1991. -Vol. 77, № 2. - P. 211-213.
35. Khawli L.A., Hu. P., Epstein A.L. Cytokine, chemokine, and co-stimulatory fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors // Handb Exp Pharmacol.
- 2008. - Vol. 181. - P. 291-328.
36. Kim J.K., Choi B.H., Park H.C. et al. Effects of GM-CSF on the neural progenitor cells // Neuroreport. -2004. - Vol. 15, № 14. - P. 2161-2165.
37. Maloney D.G., Liles T.M., Czerwinski D.K. et al. Phase I clinical trial using escalating single-dose infusion of chimeric anti-CD20 monoclonal antibody (IDEC-C2B8) in patients with recurrent B-cell lymphoma // Blood. - 1994. - Vol. 84, № 8. - P. 2457-2466.
38. McDonald P.P., Pouliot M., Borgeat P. et al. Induction by chemokines of lipid mrdiator synthesis in granulocyte- macrophage and granulocyte colony-stimulating factors - treated human neutrophils // J Immunol. - 1993. - Vol. 151. - P. 6399-6409.
39. Miyatake S., Otsuka T., Yokota T. et al. Structure of the chromosomal gene for granulocyte macrophage colony-stimulating factor. Comparison of the mouse and human gene // EMBO J. - 1985. - Vol. 4. - P. 25612565.
40. Moonen P., Mermod J.J., Ernst J.F. et al. Increased biological activity of deglycosylated recombinant human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84. - P. 4428-4431.
41. Morita M., Lamkhioued B., Soussi Gounni A. et al. Induction by interferons of human eosinophil apoptosis and regulation by interleukin-3, granulocyte/macrophagecolony stimulating factor and interleukin-5 // Eur Cytokine Netw. - 1996. - Vol. 7, № 4. - P. 725-732.
42. Muggia F. The Benefits of pegylation in cancer and antiviral therapy // From Research to Practise. - 2001.
- Vol. 3. - P. 1-3.
43. Nimer S.D., Gasson J.C., DiPersio J.F. The expression and target cell specificity of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor // Year Immunol. -1988. - Vol. 3. - P. 144-151.
44. Nimer S.D., Morita E.A., Martis M.J. et al. Characterization of the human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promoter region by genetic analysis: correlation with DNase I footprinting // Mol Cell Biol.
- 1988. - Vol. 8, № 5. - P. 1979-1984.
45. Ortiz-Sanchez E., Helguera G., Daniels T.R., Penichet M.L. Antibody-cytokine fusion proteins: applications in cancer therapy // Expert Opin Biol Ther. - 2008. -Vol. 8, № 5. - P. 609-632.
46. Ottmann O.G., AbboudM., Welte K. et al. Stimulation of human hematopoietic progenitor cell proliferation and differentiation by recombinant human interleukin
3. Comparison and interaction with recombinant human granulocyte-macrophage and granulocyte colony-stimulating factors // Exp Hemat. - 1989. - Vol. 17. - P. 191-197.
47. Parmiani G., Rodolfo M., Melani C. Immunological gene therapy with ex vivo gene modified tumor
cells: a critique and reappraisal // Hum. Gene Ther. -2000. - Vol. 11. - P. 1269-1275.
48. Pizzo P.A. Management of fever in patients with cancer and treatment-related neutropenia // N Engl J Med.
- 1993. - Vol. 328. - P. 1323-1332.
49. Powles R., Smith C , Milan S. et al. Human recombinant GM-CSF in allogeneic bone-marrow transplantation for leukaemia: double-blind, placebo-controlled trial // Lancet. - 1990. - Vol. 336, № 8728. - P. 14171420.
50. Rasenack J., Zeuzem S., Feinman S.V. et al. Peginterferon alpha-2a (40kD) [Pegasys] improves HR-QOL outcomes compared with unmodified interferon alpha-2a [Roferon-A]: in patients with chronic hepatitis C // Pharmacoeconomics. - 2003. - Vol. 21, № 5. - P. 341-349.
51. Ribas A., Butterfield L.H., Economou J.S. Genetic immunotherapy for cancer // Oncologist. - 2000. -Vol. 5. - P. 87-98.
52. Riethmuller G., Schneider-Gadicke E., Schlimok G. et al. Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17-1A Study Group // Lancet.
- 1994. - Vol. 343, № 8907. - P. 1177-1183.
53. Seder R.A., Gurunathan S. DNA vaccines: immunology, application, and optimization // Annu. Rev. Immunol. - 2000. - Vol. 18. - P. 927-974.
54. Seder R.A., Gurunathan S. DNA vaccines: Designer vaccines for the 21st century // N. Engl. J. Med. -1999. - Vol. 341. - P. 277-278.
55. Thomas R., Davis L.S., Lipsky P.E. Isolation and characterization of human peripheral blood dendritic cells // J Immunol. - 1993. - Vol. 150, № 3. - P. 821-834.
56. Thomas R., Davis L.S., Lipsky P.E. Comparative accessory cell function of human peripheral blood den-
dritic cells and monocytes // J Immunol. - 1993. - Vol. 151, № 12. - P. 6840-6852.
57. Tupitsyn N.N., Yaryghin V.N., Bryukhovetskiy A.S. et al. Immunophenotypic peculiarities of mobilized stem (CD34+) cells in blood from patients with severe spinal cord injury // J Biol Regul Homeost Agents. -
2006. - Vol. 20, № 1-2. - P. 36-40.
58. Waller E.K. The role of Sargramostim (rhGM-CSF) as immunotherapy // The Oncologist. - 2007. - Vol.
12, № 2. - P. 22-26.
59. Weisbart R.H., Kwan L., Golde D. W., Gasson J.C. Human GM-CSF primes neutrophils for enhanced oxidative metabolism in response to the major physiological chemoattractants // Blood. - 1987. - Vol. 69, № 1. - P. 18-21.
60. Wysocki P.J., Karczewska-Dzionk A., Mackiewicz-Wysocka M., Mackiewicz A. Human cancer gene therapy with cytokine gene-modified cells // Expert Opin Biol Ther. - 2004. - Vol. 4, № 10. - P. 1595-1607.
61. Yi S., Xi X.R., Shi R., et al. Secretion expression in Pichia pastoris and immunogenicity comparison of tow forms of HBsAg/GM-CSF fusion proteins // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. - 2007. - Vol. 23, № 10. - P. 894-897.
62. Yong K.L., Linch D.C. Differential effects of granulocyte- and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors (G- and GM-CSF) on neutrophil adhesion in vitro and in vivo // Eur J Haematol. - 1992. - Vol.
49, № 5. - P. 251-259.
63. Zhang X., Gordon J.R., Xiang J. Advances in dendritic cell-based vaccine of cancer // Cancer Biother Radiopharm // 2002. - Vol. 17, № 6. - P. 601-619.
nocTynnna 11.08.2008.
