CC BY
140
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
УДК 576.385.5
К.А. Скрыпник, В.С. Косоруков РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ
ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Скрыпник Ксения Александровна, научный сотрудник лаборатории трансгенных препаратов НИИ ЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-14-59 e-mail: kssa@yandex.ru
Статья поступила: 06.07.2011, принята к печати 20.10.2011
Резюме
Человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор можно назвать одним из основных ци-токинов, применяемых в химиотерапевтической онкологической практике. Он активно стимулирует рост числа нейтрофилов, что положительно сказывается на лечении различных нейтропенических состояний, влияя на их пролиферацию, созревание и дифференцировку. Создание рекомбинантных аналогов природного человеческого Г-КСФ является одной из важных биотехнологических задач. При разработке таких аналогов важно подобрать подходящую экспрессионную систему, позволяющую получать достаточные количества препарата и использовать систему очистки, обеспечивающую сохранение биологической активности целевого белка. В обзоре рассмотрены современные стратегии, применяемые при экспрессии рекомбинантного чГ-КСФ, отмечены плюсы и минусы используемых подходов.
Ключевые слова: Г-КСФ, экспрессия, рекомбинантные продуценты.
K.A. Skrypnik, V.S. Kosorukov RECOMBINANT PROTEINS
OF GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
Human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) is one of the main hematopoietic factors used during chemotherapy in oncololgy. It has various functions: neutrophil maturation and differentiation, stem cell mobilisation and others. One of the main purposes of the modern biotechnology is the development of therapeutic recombinant protein analogs, particularly hG-CSF analog. It’s important not only to select the expression system that allows to get high protein level but also to choose the proper purification system. This review describes the modern approaches used for recombinant hG-CSF analogs development. Their pros and cons are observed below.
Key words: G-CSF, expression, recombinant proteins.
Введение
Человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (чГ-КСФ) является одним из ключевых цитокинов, применяемых в онкологии. Он стимулирует развитие нейтрофилов, оказывая влияние на их пролиферацию, созревание и дифференци-ровку. Препараты чГ-КСФ используются для лечения нейтропении - состояния, характеризуемого снижением числа нейтрофилов. Подобное нарушение может быть как врожденным, так и приобретенным в результате инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также, как правило, является следствием проведения химио- или радиотерапии.
Организм пациента, страдающего нейтропе-нией, не способен эффективно сопротивляться инфекциям, иммунитет такого больного снижен. Введение препаратов, созданных на основе рекомбинантных форм чГ-КСФ, позволяет увеличить количество нейтрофилов, повысить иммунитет и избежать возникновения сопряженных инфекций. На-
пример, использование в протоколе химиотерапии этапов с лечением чГ-КСФ значительно улучшает переносимость процедуры и позволяет использовать более агрессивные последовательности химиотерапевтических обработок, что, в свою очередь, положительно отражается на эффективности лечения и выживаемости пациентов.
Впервые колониестимулирующие факторы были описаны в 1960-х гг. Исследователями была изучена группа белков, которая оказывала влияние на развитие незрелых гемопоэтических клеток. Очистка каждого из белков с последующим клонированием сделало возможным определение биологической функции каждого из компонентов, в том числе и Г-КСФ [9; 22].
Ген, кодирующий белок чГ-КСФ, расположен на 17 хромосоме. Экспрессируется Г-КСФ главным образом моноцитами и макрофагами, а также астроцитами, эндотелиальными клетками, фибробластами. Результатом экспрессии чГ-КСФ является гликопротеид, состоящий из 174 аминокислот.
Осуществление биологических функций чГ-КСФ возможно после его связывания с рецептором. Рецептор чГ-КСФ (чГ-КСФ-Р) - мембранный белок, экспрессирующийся на поверхности практически всех клеток миелоидного ряда - как миелобластов, так и дифференцированных нейтрофилов [2]. Связывание чГ-КСФ с рецептором приводит к запуску ряда сигнальных путей - ]ак-БТЛТ, Ыаз-МЛР, Р1-3. Активация сигнальных каскадов увеличивает число нейтрофилов в периферической крови, стимулируя пролиферацию их предшественников.
Уже более 20 лет чГ-КСФ применяется в гематологической и онкологической практике для лечения или облегчения состояния пациентов с различными нарушениями. Исследование биологических активностей этого цитокина продолжается и сегодня. В последние годы было проведено множество работ, показывающих, что чГ-КСФ может быть использован не только при лечении онкологических заболеваний. Этот цитокин исключительно перспективен для лечения ряда аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний, последствий инфаркта миокарда и инсульта[18; 26].
Следует заметить, что лечение препаратами на основе Г-КСФ используется не только в клинической практике, но и в ветеринарии. Были клонированы и экспрессированы гены не только человеческого Г-КСФ, но и Г-КСФ других организмов. В настоящее время существует рекомбинантный аналог кошачьего Г-КСФ [29], применяющийся для лечения кошек, страдающих от нейтропенического состояния. Экспрессия и очистка собачьего Г-КСФ сделали возможным отказаться при лечении нейтропении от использования чГ-КСФ, обладавшего иммуногенным эффектом [23; 30]. Разработан бычий Г-КСФ, применяемый для лечения нейтропени-ческих постхимиотерапевтических состояний крупного рогатого скота и лошадей [22].
В настоящее время создан ряд модифицированных рекомбинантных аналогов чГ-КСФ, которые используются в клинической практике и ветеринарии [8] и их свойства достаточно подробно исследованы. Несмотря на большой объем исследовательской информации по рекомбинантным формам чГ-КСФ, и скорее всего благодаря этому, продолжаются активные разработки в области перспективных технологий экспрессии и очистки этого фармакологического белка, исследуются новые оригинальные подходы к созданию новых продуцирующих систем.
Пути экспрессии Г-КСФ.
Эукариотические продуценты
Наибольшее внимание уделяется получению и использованию человеческого рекомбинантного Г-КСФ. Для его экспрессии используются различные продуцирующие системы. Естественным выбором для получения полностью функционального рекомбинантного белка человека являются системы на основе эукариотических культур клеток. Использование для продуцирования белка клеточных линий имеет как преимущества, так и недостатки. На современном этапе развития данная экспрессионная система позволяет достигать достаточно высокого уровня экспрессии целевого белка в процессе ферментации. С другой стороны, получение одновременно хорошо растущей и эффективно экспрессирующей линии является сложной задачей. Кроме того, как правило, такие линии достаточно нестабильны и требуют постоянных усилий в поддержании их технологических характеристик, а зачастую и повторных работ по созданию линий [12].
Важно, что при экспрессии в культурах клеток млекопитающих обеспечивается правильное сворачивание белка и гликозилирование, это делает получае-
мый рекомбинантный аналог идентичным нативному белку. При использовании такой экспрессионной системы получают коммерческий аналог ленограстим -гликозилированную форму чГ-КСФ, которая выпускается под названием Граноцит™ фирмой Бапой-ЛуепИз (Франция).
Другими эукариотическими продуцентами, используемыми в биотехнологии, являются дрожжи. В дрожжах может осуществляться необходимый процессинг предшественника целевого белка с последующей секрецией продукта в культуральную среду. Выбор дрожжей в качестве продуцента позволяет упростить процесс очистки целевого белка, а уровень экспрессии достигает 20-200 мг/л. Несмотря на явные преимущества использования дрожжей в качестве продуцента, следует отметить несовершенство глико-зилирования, которое отличается от гликозилирова-ния в организме человека. При получении рекомбинантного чГ-КСФ в дрожжах секретируемый белок образовывал обширные мультимерные комплексы. Такая агрегация влияет на способность белка связываться с рецептором, т. е. приводит к значительному уменьшению биологической активности [3; 4]. Белковые комплексы могут быть обработаны мочевиной или гуанидин хлоридом, денатурирующими белок. Последующий рефолдинг позволяет ренатурировать белок и восстановить его биологическую активность [16]. В последние годы были проведены эксперименты, в ходе которых удалось значительно уменьшить уровень агрегации, но не исключить ее вообще [5].
Трансгенные организмы
Еще одним путем экспрессии рекомбинантных белков является использование генетически измененных животных. В качестве животных-биореакторов используются мыши, коровы, свиньи, кролики и др. Существует несколько возможных подходов к созданию трансгенных животных, экспрессирующих лекарственные белки. Как правило, используют микроинъекцию генетических конструкций в ооциты [7] или трансфецирование спермы [6, 17].
Недостатками этого пути являются сложность, длительность и низкая эффективность получения трансгенных животных. Преимущества использования животных-биореакторов:
■ легко воспроизводимо естественным путем,
■ передача потомству способности воспроизводить целевой продукт.
Целевой белок подвергается посттрансляцион-ным модификациям, чего не происходит при использовании микроорганизмов. Использование трансгенных животных позволяет получать достаточно большие количества целевого белка (до 1г/л), соответственно единицы или десятки трансгенных животных способны обеспечить фармацевтический рынок необходимым белком.
Выбор животного определяется его продуктивностью, сроками получения целевого белка, необходимым количеством нужного препарата.
Наиболее часто используемым путем экспрессии является экспрессия целевого белка в молоко трансгенных животных. Впервые таким образом из молока трансгенных мышей был получен козий в-лактоглобулин [25]. В настоящее время получен ряд терапевтических белков, которые были экспрессированы при использовании тканеспецифичных промоторов молочной железы; проведены работы и по продуцированию чГ-КСФ в этих экспрессионных системах.
Конструкция, несущая ген чГ-КСФ под контролем козьего бета-казеинового промотора, была введена в зиготы с помощью микроинъекции [14].
Уровень экспрессии в козьем молоке во время лактации составил 50 мкг/мл. Полученный целевой белок обладал биологической активностью, что было показано в опытах in vitro и in vivo.
Проведены исследования экспрессии чГ-КСФ в молоко трансгенных кроликов. В зиготы вводилась конструкция, несущая чГ-КСФ под контролем бычьего Р-лактоглобулинового промотора [1]. Достигнутый уровень экспрессии чГ-КСФ в молоке трансгенных кроликов достигал 22 мкг/мл. Отметим, что экспрессия чГ-КСФ приводила к проявлению сильного терратогенного эффекта: происходила гибель эмбриона на 2-4 неделе развития. Размножались только линии трансгенных кроликов с низким уровнем экспрессии.
Не так давно была достигнута трансгенная экспрессия чГ-КСФ в мочу мыши [13]. В разработанной авторами экспрессионной конструкции последовательность Г-КСФ находилась под контролем казеинового промотора. Использование мочевого пузыря в качестве биореактора имеет свои преимущества: получение целевого белка возможно на любой стадии жизненного цикла животного, а также не зависит от пола. Однако достигнутый уровень составлял лишь 500 мкг/мл, что недостаточно для практического использования. Полученный белок обладает биологической активностью, свойственной чГ-КСФ. При этом повышенный уровень Г-КСФ был отмечен и в крови трансгенных животных. Дальнейшие исследования показали, что происходит утечка целевого белка в кровеносную систему через окружающие мочевой пузырь сосуды. Проведенные дополнительно исследования позволяют предположить, что попадание рекомбинантного чГ-КСФ в кровеносную систему мышей не оказывает негативного влияния на животных.
Использование ретровирусных векторов, вводимых в бластодерму куриных эмбрионов, сделало возможным получить трансгенных цыплят, экспрессирующих чГ-КСФ [15]. Последовательнось Г-КСФ была введена в ретровирусный вектор под контроль CMV-промотора. Сформированными вирусными частицами были инъецированы яйца. Рекомбинантный белок экспрессировался в крови цыплят и обладал биологической активностью, характерной для нативного чГ-КСФ. Приобретенный трансген наследовался следующим поколением, но потомство G1 погибло спустя месяц после вылупления.
Интересной представляется экспрессия рекомбинантных белков в растительных культурах клеток. Использование таких экспрессионных систем имеет некоторые преимущества: возможно проведение посттрансляционных модификаций, растения просто и дешево выращивать и содержать. Проведен ряд экспериментов, в результате которых достигнута экспрессия чГ-КСФ в культурах клеток табака и риса. Уровень экспрессии в клетках табака был низок, составив 0,1 мкг/мл. Максимум белка был зафиксирован в культуральной среде на 9-й день инкубации, после чего резко снижался [10].
Новым подходом для продукции чГ-КСФ является использование систем растительной экспрессии на основе вирусных векторов [31]. Подобная система была разработана для продукции целевых белков в австралийском табаке Nicotiana benthamiana. Последовательность чГ-КСФ была клонирована в вирусный вектор под контроль актинового промотора. Далее с помощью агроинъекции вектора доставлялись в листья растения-хозяина, где через 4-5 дней наблюдали экспрессию чГ-КСФ. Уровень экспрессии достигал 500 мкг/кг зеленой массы. Очевидным преимущест-
вом данного метода является транзиентная (временная) экспрессия, позволяющая быстро нарабатывать необходимый белок.
Отметим, что при создании стабильно трансформированных растений количество продуцируемого ими белка составляет лишь 1 % от общего растворимого белка клетки. Растения, зараженные с помощью вирусных векторов, способны производить значительно большее количество целевого белка.
Прокариотические продуценты чГ-КСФ
В биотехнологии широко используются бактериальные системы экспрессии, позволяющие достигать высокого уровня продукции целевого белка, что, наряду с простотой культивирования, является несомненным преимуществом данного типа продуцентов.
Наиболее активно применяется рекомбинантный чГ-КСФ, поставляемый в продажу фирмой Amgen под международным названием филграстим (коммерческое название Нейпоген). Это негликози-лированный аналог чГ-КСФ, выделенный из E. coli. Белок состоит из 175 аминокислотных остатков и имеет молекулярный вес 18 800 Да. Количество аминокислотных остатков больше, чем в аутентичном белке за счет присутствия N-концевого метио-нинового остатка. Период полужизни препарата составляет около 3,5 ч соответственно, для достижения терапевтического эффекта (повышения и поддержания должного уровня нейтрофилов) необходимы частые инъекции филграстима.
Этой же фирмой в 2002 г. был разработан пэгфилграстим - модифицированный аналог Ней-погена [28]. Особенность данного препарата - молекула чГ-КСФ через N-концевой лизин ковалентно связана с полиэтиленгликолем. Наличие ПЭГ-составляющей приводит к повышению стабильности препарата, увеличению продолжительности действия введенной дозы. Были проведены исследования по сравнению действия филграстима и пэгфилграстима на мышей, а также здоровых доноров. Было показано, что введение единичной дозы пэгфилграстима приводит к увеличению количества нейтрофилов, в то время как для филграстима сходный эффект достигается при ежедневном введении [21]. Препарат представлен на рынке под названием Неуласта.
Еще одним негликозилированным аналогом чГ-КСФ является нартограстим (производитель Kyowa Hakko Kogyo), полученный и применяемый в Японии. В N-концевой области нартограстима заменено несколько аминокислот для достижения высокого уровня экспрессии в бактериальных системах [20]. По сравнению с филграстимом нарто-грастим обладает повышенной стабильностью. Как и филграстим, препарат влияет на дифференциров-ку, созревание нейтрофилов, ускоряет их перемещение из костного мозга в периферическую кровь.
В сравнительных исследованиях филграсти-ма, ленограстима и нартограстима не было получено значимых различий. Все три препарата обладают сходными фармакокинетическими и фармакологическими эффектами, повышая уровень нейтрофилов. Можно предположить, что ни гликозилирование, ни изменение N-концевых аминокислот Г-КСФ не оказывает значительного влияния на действие на ней-трофилы in vivo [26]. В сравнении с негликозилиро-ванным филграстимом требуются менее частые инъекции ленограстима, предлагается вводить его один раз в день, что значительно упрощает проведение курса лечения [19].
В то же время, при сравнении граноцита с пэг-филграстимом, последний имеет больший период полу-жизни и также требует лишь однократного введения.
Существующие в настоящий момент рекомбинантные аналоги чГ-КСФ, полученные с использованием бактериальных продуцентов, экспрессируются в нерастворимой форме. Получение чГ-КСФ в растворимой форме позволило бы избежать дополнительных этапов очистки и упростить процесс получения рекомбинантного аналога этого белка. Экспрессионные системы, позволяющие получать чГ-КСФ в растворимой форме, в настоящий момент практически отсутствуют. Исследователи сталкиваются с тератогенным эффектом при продуцировании этого белка в организме различных трансгенных животных. Попытки экспрессировать чГ-КСФ в растворимой форме в бактериальных клетках приводили к гибели клеток при достижении высокого уровня продукции цитокина. Решением проблемы может являться использование белка-партнера, повышающего растворимость целевого белка. Конструирование экспрессион-ного вектора, в состав которого будут входить последовательности как целевого гена, так и высокорастворимого партнера, а также последующая экспрессия гибридного белка позволяет добиться продукции чГ-КСФ в растворимой форме.
В лаборатории трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН подобрана технология, позволяющая получать чГ-КСФ в растворимой форме. Лабораторный штамм Escherichia соИ продуцирует гибридный белок, в состав которого входит хитинсвязывающий домен, интеиновый домен и домен, соответствующий чГ-КСФ. Хитинсвязывающий домен отвечает за связывание гибридного белка с хитиновым сорбентом, что необходимо для проведения аффинной хроматографии при очистке цитокина.
Особенностью интеина является то, что он, оказываясь слит с целевым белком в составе гибридной конструкции, существенно повышает растворимость чГ-КСФ. Другое важное свойство интеина - его способность к автопротеолитическому вырезанию из состава гибридного белка. Автопротеолиз может индуцироваться действием тиольных реагентов.
Полученный в результате экспрессии гибридный белок, несущий в своем составе чГ-КСФ, находится в растворимой форме. При проведении очистки с помощью аффинной хроматографии гибридная белковая конструкция успешно связывается с хитиновым сорбентом, что свидетельствует о функциональной активности хи-тинсвязывающего домена. Автопротеолитическая активность интеина была индуцирована добавлением ДТТ, после чего домен, соответствующий чГ-КСФ, вырезался из состава белковой конструкции.
Литература
Элюированный чГ-КСФ находился в растворимой форме и обладал биологической активностью, соответствующей коммерческому аналогу - филграстиму.
Описанная выше экспрессионная система может быть с успехом применена и для других белков, которые склонны формировать тельца включения при использовании бактериальных продуцентов или их экспрессия токсична для экспрессирующих клеток.
Заключение
Таким образом, при всем разнообразии экс-прессионных систем в настоящий момент оптимальным представляется использование бактериальных продуцентов. Получение рекомбинантных терапевтических белков этим путем существенно выгоднее, чем с использованием клеточных линий или трансгенных животных. Несмотря на то, что при эукариотической экспрессии белки подвергаются должному гликозили-рованию, это не всегда необходимо для проявления биологической активности, как и в случае с грануло-цитарным колониестимулирующим фактором. Кроме того, эукариотические системы экспрессии не позволяют нарабатывать токсичные для клетки белки в больших количествах.
При формировании телец включения в бактериальных клетках белок не является активным, так как накапливается в клетке в качестве нерастворимых клеточных агрегатов. Для получения биологически активного белка требуется проведение рефолдинга, что усложняет проведение очистки целевого белка, но все же остается эффективным с экономической точки зрения. Другим перспективным подходом является описанный выше метод экспрессии целевого белка слитно с бел-ком-партнером. Экспрессия гибридного белка позволяет получать последний в растворимой форме, проводить высокоэффективную аффинную очистку. При этом биологическая активность целевого белка (в частности, чГ-КСФ) проявляется только после вырезания целевого белка из состава гибридной конструкции в процессе хроматографической очистки.
Несмотря на то, что достигнутый к настоящему моменту уровень экспрессии по гибридной технологии сравнительно невысок и находится на нижней границе экономически эффективного диапазона, вполне вероятно, что проводимые исследования позволят повысить уровень экспрессии до требуемого производством уровня. Применение гибридных конструкций, в которых биологическая активность целевого белка ингибирована, сделает возможным получение рекомбинантного чГ-КСФ и других терапевтически важных белков в растительных и животных продуцентах.
1. Прокофьев М.И, Городецкий CM., Мезина М.Н. и др. Создание трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор // Сельскохозяйственная биология. - 2003. - №. 6. - С. 48-54.
2. Avalos B.R. Molecular analysis of the granulocyte colony-stimulating factor receptor // Blood. - 1996. -88(3). - P. 761-77.
3. Bae C.S., YangD.S., ChangK.R. et al. Enchanced secretion of human granulocyte colony stimulating factor directed by a novel hybrid fusion peptide from recombinant Saccharomyces cerevisiae at high cell concentration // Biotechnol bioeng. - 1998. - 57. - P. 600-9.
4. Bae C.S., YangD.S., Lee J, Park Y-Р. Improved process for production of recombinant yeast-derived monomeric human G-CSF // Appl. Microbiol Biotechnol. - 1999. - 52. - P. 338-44.
5. Bahrami A., Shojaosadati A., Khakikzadeh R. et al. Prevention of human granulocyte colony-stimulating factor protein aggregation in recombinant Pichia pastoris fed-batch fermentation using additives // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2009. - 52. - P. 141-8.
6. Cappello F, Stassi G., Lazzereschi D. et al. hDAF expression in hearts of transgenic pigs obtained by sperm-mediated gene transfer // Transplantation Proceedings. - 2000. - 32. - P. 895-6.
7. Chan A.W.S., Homan E.J., Ballou L.U. et al. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1998. - 95. - P. 14028-33.
8. Fernandez-Varon E., Villamayr L. Granulocyte and granulocyte macrophage colony-stimulating factors as
therapy in human and veterinary medicine // The Veterinary Journal. - 2007. - 174. - P. 33-41.
9. Golde D., Cline M. Regulation of granulopoesis // N England J Med. - 1974. - 291(26). - P. 1388-95.
10. Hill C.P., Osslund T.D., Eisenberg D. The structure of granulocyte colony-stimulating factor and its relationship to other growth factors // Biochemistry. - 1993. - 90. - P. 5167-71.
11. Hellwig S., Drossard J., Twyman R.M., Fischer R. Plant cell cultures for the production of recombinant pro-
teins // Nature Biotechnology. - 2004. - 22(11). - P. 1415-22.
12. Kaufman R.J. Overview of vector design for mammalian gene expression // Molecular biotechnology. -2000. - 16. - P. 151-60.
13. Kim M.O., Kim S.H., Lee S.R. et al. Transgene expression of biological active recombinant human granulo-cyte-colony stimulating factor (hG-CSF) into mouse urine // Life Sciences. - 2006. - 78. - P. 1003-9.
14. Ko J.H., Lee C-S., Kim K.H. et al. Production of biologically active human granulocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat // Transgenic Research. - 2000. - 9. - P. 215-22.
15. Kwon M.S., Koo B.C., Choi B.R. et al. Generation of transgenic chickens that produce bioactive human granu-locyte-colony stimulating factor // Molecular reproduction and development. - 2008. - 75. - P. 1120-6.
16. LasnikM.A., Porekar V.G., Stalc A. Human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) expressed by methylotrophic yeast Pichia pastoris // Eur O Physiol. - 2001. - 442. - Suppl. 1. - R. 184-6.
17. Lazzereschi D., Forni M., Cappello F. et al. Efficiency of transgenesis using sperm-mediated gene transfer: generation of hDAF transgenic pigs // Transplantation Proceedings. - 2000. - 32. - P. 892-4.
18. Lu C-Z., Xiao B-G. G-CSF and neuroprotection: a therapeutic perspective in cerebral ischaemia // Biochemical society transactions. - 2006. - 34(6). - P. 1327-33.
19. Martin-Christin F. Granulocyte colony-stimulating factors: How different are they? How to make a decision? // Anti-Cancer Drugs. - 2001. - 12. - P. 185-91.
20. Maruyama K., Tsuji K., Tanaka R. et al. Characterization of peripheral blood progenitor cells mobilized by nartograstim in normal volunteers // Bone Marrow Transplantation. - 1998. - 22. - P. 313-20.
21. Molineux G. Pegfilgrastim: using pegilation technology to improve neutropenia support in cancer patients // Anti-Cancer Drugs. - 2003. - 14(4). - P. 259-65.
22. Nagata T., Tohda Y., Yokomizo Y. et al. High level expression, purification, and in vivo activity of bovine granulocyte colony-stimulating factor produced using baculovirus system // Veterinary immunology and immunopathology. - 2003. - 96. - P. 105-10.
23. Ogilvie G.K, Obradovich J.E., Cooper M.F. et al. Use of recombinant canine granulocyte colony-stimulating factor to decrease myelosuppression associated with the administration of mitoxantrone in the dog // J Vet Intern Med. - 1992. - 6(1). - P. 44-7.
24. Sachs L. The molecular control of blood cell development // Science. - 1987. - 238. - P. 1374-9.
25. Simons J.P., McClenaghan M., Clark A.J. Alteration of the quality of milk by expression of sheep beta-lactoglobulin in transgenic mice // Nature. - 1987. - 328(6130). - P. 530-2.
26. Takano H., Komuro I. G-CSF therapy for acute myocardial infarction: studies of animal experiments give valuable hints to clinical trials // International Journal of Cardiology. - 2009. - 135. - P. 115-6.
27. Tanaka H., Tanaka Y., Shinagawa K. et al. Three types of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor have equivalent biological activities in monkeys // Cytokine. - 1997. - 9(5). - P. 360-9.
28. WillisF., PettengellR. Pegfilgrastim // Expert Opin Biol Ther. - 2002. - 2(8). - P. 985-92.
29. Yamamoto A., Iwata A., Saithoh T. et al. Expression in Escherichia coli and purification of the functional feline granulocyte colony-stimulating factor // Veterinary immunology and immunopathology. - 2002. - 90. -P. 169-77.
30. Yamamoto A., Iwata A., Saito T. et al. Expression and purification of canine granulocyte colony-stimulating factor // Veterinary immunology and immunopathology. - 2009. - 130. - P. 221-5.
31. Zvereva A.S., Petrovskaya L.E., Rodina AV. et al. Production of biologically active human myelocytokines in plants // Biochemistry (Mosc). - 2009. - 74(11). - P. 1187-94.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
