CC BY
108
УДК 57.088.2
ВОССТАНОВЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЦИТОКИНОВ В ПРОЦЕССЕ РЕФОЛДИНГА НА АФФИННОЙ КОЛОНКЕ
© Е. Н. Кособокова*, В. С. Косоруков
Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН Россия, 115478 г. Москва, Каширское шоссе, 24.
Тел.: +7 (499) 324 14 59.
E-mail: ekkos@mail.ru
Цель исследования — разработка метода восстановления биологической активности рекомбинантного белка непосредственно на аффинной колонке в процессе очищения продукта на примере двух терапевтически значимых цитокинов: инрерферона-альфа-2Ь человека (чИФН-а-2Ь) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (чГМ-КСФ). Рекомбинантные цитокины были получены из бактериального продуцента (Escherichia coli) в виде телец включения. Очистка белков осуществлялось посредством аффинной хроматографии. Для сокращения времени и материальных затрат был разработан метод проведения рефолдинга чИФН-а-2Ь и чГМ-КСФ, иммобилизованных на металл-хелатном сорбенте. Полученные результаты свидетельствуют о ряде преимуществ данной технологии в сравнении с рефолдингом посредством диализа или разведения.
Ключевые слова: рефолдинг на колонке, инрерферон-альфа-2Ь человека, гранулоцитар-но-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека.
ладкой белковой молекулы (рефолдинг), т.к. возможно образование неактивных форм (продуктов неправильного фолдинга), а также высокомолекулярных агрегатов при приобретении белком нативной конформации. Основной подход, применяемым для рефолдинга солюбилизированных белков, заключается в разведении, т.е. медленном внесении ренатурирующего буфера. Существенным недостатком метода является необходимость дальнейшего концентрирования белка из сильно разведенных растворов, а также низкая эффективность рефолдинга (высокими показателями считаются 30% ре-фолдированного белка).
Цель исследования - разработка метода восстановления биологической активности рекомбинантного белка непосредственно на аффинной колонке в процессе очищения продукта на примере двух терапевтически значимых цитокинов: инрер-ферон-альфа-2Ь человека (чИФН-а-2Ь) и грануло-цитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека (чГМ-КСФ).
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и плазмиды Все манипуляции для клонирования вектора проводили в штамме E. coli dH5a с генотипом F-^80d lacZAM15 A (lacZYA-argF) U169 deoR recAl endAl hsdR17 hsdR17 (r-, m+) phoA supE44 X- thi-1 gyrA96 relAl. Для изучения экспрессии полученных конструкций выбрали штамм BL21 (DE3) с генотипом F- ompT hsdSB (r-, m-) gal dcm (DE3) (все штаммы из коллекции лаборатории).
В работе использовали экспрессионные векторы фирмы Novagen (США) pET-32a(+) и pET-26b(+). На их основе сконструировали плазмиду pET32-GM-CSF и pET26-IFN, содержащие ген со-
* автор, ответственный за переписку
Введение
По прогнозам экспертов, биотехнологический рынок достигнет к 2025 году 2 трлн. долларов. При этом на долю России приходится порядка 0.1% мирового оборота биотехнологических продуктов. Рекомбинантные белки практически полностью вытеснили с фармацевтического рынка белковые препараты, полученные из природных источников (например, крови доноров). Разработанные за последние 30 лет технологии позволяют в короткие сроки и в больших количествах получить биологически активные терапевтические белки [1, 2]. Актуальными остаются вопросы, касающиеся оптимизации отдельных этапов в процессе получения вы-сокоочищенных субстанций.
В настоящее время основным продуцентом рекомбинантных терапевтически значимых белков является Escherichia coli [1, 3]. Существующие бактериальные системы экспрессии позволяют получить высокий выход целевого продукта. Однако обычно при накоплении рекомбинантного белка в бактериальных клетках происходит их агрегация в виде плохо растворимых телец включения (ТВ), содержащих неактивный белок [4]. Для дальнейшей работы белки подвергают растворению в жестких условиях, в присутствии мощных денатуран-тов, таких как, 6 М гуанидин гидрохлорид и 8 М мочевина. Для восстановления биологической активности рекомбинантного белка необходимо провести ренатурацию. Стандартная стратегия, используемая для ренатурации нерастворимых белков, включает три этапа: 1) изоляцию и очистку ТВ; 2) солюбилизацию агрегированного белка; 3) рефолдинг солюбилизированного белка [5, 6]. Первые две стадии обычно не вызывают никаких затруднений. Основная проблема связана с повторной ук-
ответствующнго рекомбинантного белка, связанного с полигистидиновым доменом (6His).
На рис. 1 схематически изображены плазмид-ные векторы, использованные в данной работе. Подробное описание конструирования векторов представлено в ранее опубликованных статьях [7, 8].
His Tag | ЕК чИФН-а-2Ь
RB
His Tag-- SjT[ чГМ-КСФ ! б
RB
Рис. 1. Г енетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков чИФН-а-2Ь (а) и чГМ-КСФ (б). LB (left border) и RB (right border) - левая и правая границы генетической конструкции, T7lac - промотор транскрипции, HisTag - полигистидиновый домен (6His), ЕК - сайт гидролиза энтеропептидазой, T7 Term - терминатор транскрипции.
Экспрессия рекомбинантных белков Штамм E. coli BL21(DE3), трансформированный соответствующей рекомбинантной плазмидой, культивировали в течение ночи в 50 мл LB (0.5% дрожжевого экстракта; 1% триптона; 1% NaCl) при 37 °С. Ночную культуру переносили в 500 мл среды SOC (0.5% дрожжевого экстракта; 2% триптон; 10 мМ NaCl; 2.5 мМ KCl; 10 мМ MgCl2; 20 мМ глюкоза, помещали на 37 °С до достижения OD600 = 0.5 - 0.8, после чего добавляли IPTG до концентрации 0.5 мМ. Далее пробы инкубировали при комнатной температуре (21 - 23 °С) в течение 6-7 часов. В качестве отрицательного контроля использовали нетрансформированный штамм E. coli BL21(DE3).
Приготовление лизатов клеток После культивирования клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4000g. Осадок ресуспендировали в 2 мл лизирующего буфера следующего состава: 50 мМ TrisHCl pH = 8.0; 0.5 М NaCl; 0.3% Triton X-100.
Добавляли лизоцим до концентрации 10 мкг/мл. Инкубировали при 4 °С в течение часа. Качество лизирования бактериальной суспензии улучшали проведением циклов поочередного замораживания в жидком азоте и размораживания на водяной бане при 32 °С.
Для удаления вязкости лизат обрабатывали ДНКазой 30 минут при 37 °С.
Полученную смесь центрифугировали 10 минут при 16000g. Надосадочную жидкость и осадок хранили при -20 °С.
Очистка телец включения Так как тельца включения (ТВ) обладают относительно высокой плотностью, их возможно отделить центрифугированием. После проведения лизиса и центрифугирования лизата полученный осадок в большой степени был обогащен ТВ, образованными рекомбинантными белками чИФН-а-2Ь и чГМ-КСФ. Для удаления растворимых белков
бактериальной клетки проводили серию отмывок буфером на основе 50 мМ Т^НС1 с добавлением мочевины до 0М, 2М и 4М в каждой последующей промывке соответственно.
Для дальнейшей работы ТВ растворяли в буфере 20 мМ Т^НС1; 10 мМ №Н2Р03; денатурант (8М мочевина - для чГМ-КСФ и 6М гуанидин гидрохлорид - для чИФН-а-2Ь), pH 8.00. Растворение проводили в течение 3-5 часов при комнатной температуре с постоянным перемешиванием.
Аффинная хроматография и рефолдинг на колонке
Растворенные отмытые ТВ наносили на колонку с №2+-сефарозой (АтегаИат, Швеция), собирали фракцию белков на выходе с целью последующего анализа эффективности связывания рекомбинантных белков с сорбентом. Удалили загрязняющие белки с колонки, путем промывания 10 объемами буферного раствора (20 мМ Т^-НС1, 0.5М №С1, детергент, pH 8.00). Рефолдинг целевого белка проводили на аффинной колонке, гради-ентно снижая концентрацию мочевины с 8 М до 0 М в течение ночи в присутствии окислите льновосстановительных агентов (глутатиона окисленного и восстановленного в соотношении 1:4 соответственно) при комнатной температуре.
На заключительном этапе проводили дифференцированную элюцию: рефолдированный белок элюировали буферным раствором, содержащим 20мМ трис-НС1, 100мМ имидазол, рН 8.0, нерефол-дированный - 20мМ трис-НС1, 100мМ имидазол, 0.5М №С1, 8М мочевина для чГМ-КСФ (или 6М гуанидин гидрохлорид для чИФН-а-2Ь), рН 7.0.
Полученные пробы анализировали при помощи ПААГ-электрофореза. Качественную оценку электрофоретического профиля проводили методом вестерн-блотинга. Количественную оценку рекомбинантных белков осуществляли при помощи им-муноферментного анализа (ИФА).
Биологическая активность
Для подтверждения биоэквивалентности полученных препаратов проводили изучение биологической активности в сравнении с существующими фармацевтическими аналогами. В случае чИФН-а-2Ь использовали стандартную международную методику изучения противовирусной активности цитокина на культуре перевиваемых диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека по подавлению цитопатогенного действия вируса энцефаломиокардита. Изучение биологической активности чГМ-КСФ проводили по стандартной методике, основанной на изучении стимуляции пролиферации человеческих промиелоцитных клеток линии HL-60 (данные не опубликованы).
Результаты и обсуждение
Бактериальная система экспрессии обеспечивала высокий выход рекомбинантных белков: более 30% всех белков бактериальной клетки (рис. 2).
чИФН-а-2Ь и чГМ-КСФ полностью агрегировались в виде нерастворимых телец включения. Относительно высокая плотность ТВ обеспечивала их отделение от растворимых белков бактериальной клетки уже на этапе центрифугирования (рис. 3, дорожка 7).
лец включения растворами, содержащими более 2М мочевины, сопровождалась потерями целевого продукта. Тем не менее, этап предварительной очистки ТВ был необходим в обоих случаях, т.к. повышал эффективность посадки рекомбинантных белков и качество аффинной хроматографии.
Рис. 2. Анализ эффективности экспрессии рекомбинантных генов. Электрофорез образцов в 12%-ом ПААГ (а, в) и вестерн-блотинг (б): 1 - маркер молекулярной массы белков, кДа; 2 - контрольный образец чИФН-а-2Ь (без 6His); 3 - лизат бактериальных клеток, содержащих плазмиду рЕТ26-ШК после индукции; 4-5 - качественная оценка электрофоретического профиля методом вестерн-блотинга образцов 2 и 3; 6 - лизат клеток BL21(DE3) без рекомбинантной плазмиды; 7 - лизат бактериальных клеток, содержащих плазмиду pET32-GM-CSF до индукции; 8 - лизат бактериальных клеток, содержащих плазмиду pET32-GM-CSF после индукции. Стрелкой обозначен целевой белок.
Рис. 3. Электрофорез в 12%-ом ПААГ образцов, полученных в результате отмывки ТВ чИФН-а-2Ь: 1 - лизат бактериальных клеток, экспрессирующих чИФН-а-2Ь; 2 - супернатант после центрифугирования лизата; 3-6 -последовательные отмывки ТВ, супернатанты после центрифугирования; 7 - отмытые ТВ чИФН-а-2Ь; 8 - чИФН-а-2Ь после очистки на аффинной колонке. Стрелкой обозначен целевой белок.
Следующий этап, очистки ТВ, был более эффективен для чИФН-а-2Ь: на выходе бактериальные белки, входящие в состав агрегатов, составляли менее 20% (рис. 3). Аналогичная цифра для чГМ-КСФ - 35-45% (рис. 4, дорожка 1). Данные результаты можно объяснить тем, что интерфероны являются белками плохо растворимыми, а это позволяет удалять больше лучше растворимых бактериальных белков, используя растворы с высоким содержанием таких денатурантов, как мочевина в концентрациях до 4М. Для чГМ-КСФ отмывка те-
Рис. 4. Электрофорез в 12%-ом ПААГ образцов, полученных в результате аффинной хроматографии чГМ-КСФ: 1 - очищенные и растворенные ТВ чГМ-КСФ, нанесенные на аффинную колонку; 2 - белки бактериальной клетки, не связавшиеся с сорбентом; 3 - белки бактериальной клетки, отмытые с колонки; 4-5 - фракции рефолдированного чГМ-КСФ; 6 - фракция нерефолдиро-ванного чГМ-КСФ. Стрелкой обозначен целевой белок.
Основная очистка осуществлялась при помощи аффинной хроматографии (рис. 5). В обоих случаях рекомбинантный белок полностью связывался с сорбентом (рис. 4, 6). Такой подход обеспечивал высокую степень чистоты целевого продукта (более 95%).
Рис. 5. Аффинная хроматография чГМ-КСФ, включающая процесс рефолдинга. I - белки бактериальной клетки, не связавшиеся с сорбентом; II - белки бактериальной клетки, отмытые с колонки; III - фракция рефолдирован-ного рчГМ-КСФ; IV - фракция нерефолдированного рчГМ-КСФ. Сплошная линия отображает изменение оптической плотности. Прирывистая линия отображает градиентную смену буфера в процессе рефолдинга. Звездочкой отмечено изменение спектра поглощения, вызванное присутствием глутатиона в растворе для проведения рефолдинга.
Следующим задачей было восстановление природной конформации белка с его переходом в растворимую биологически активную форму. Использование для рефолдинга рекомбинантных ци-токинов методов разбавления или диализа, которые обеспечивают постепенное снижение концентрации денатуратов в растворах, сопровождалось низким выходом восстановленного белка (порядка 15-20% и для чИФН-a^b, и для чГM-КСФ). Кроме того, это длительные методы, требующие значительных объемов растворов. Последующее концентрирование и центрифугирование белковых растворов с целью удаления невосстановленного белка очень трудоемко.
12 3 4
Рис. б. Электрофорез в 12%-ом ПААГ образцов, полученных в результате аффинной хроматографии чИФН-a-2b: 1 - очищенные и растворенные ТВ чИФН-a^b, нанесенные на аффинную колонку; 2 - белки бактериальной клетки, не связавшиеся с сорбентом, З - фракции рефолдированного чИФН-a^b. Стрелкой обозначен целевой белок.
Одним из условий успешного рефолдинга рекомбинантного белка является обеспечение пространственного разделения его молекул для предотвращения их агрегации. Именно это происходит при разбавлении образца буферным раствором. В данном исследовании был использован принципиально иной подход, основанный на пространственном разделении молекул друг от друга за счет их адсорбции на сорбенте в процессе аффинной хроматографии. Следует отметить, что изначально специфическое связывание гибридного белка происходит в присутствии высоких концентраций хаотропных агентов (мочевина или гуанидин гидрохлорид), что исключает агрегацию. За счет компактного расположения молекул белка на сорбенте отпадает необходимость использования больших объемов растворов, присущих классическим методикам.
Было исследовано несколько вариантов проведения рефолдинга на аффинной колонке с использованием различных буферных растворов, отличающихся наличием и концентрацией различных компонентов. На основании результатов проведенных ранее экспериментов была выбрана схема, описанная в разделе «Mатериалы и методы». При таком подходе эффективность рефолдинга достига-
ла 70% для чГМ-КСФ (рис. 4) и 80% для чИФН-а-2Ь (рис. 6), что в 4-5 раз выше при использовании классических методов.
Биологическая активность полученных цито-кинов была сопоставима с активностью коммерческих аналогов, что свидетельствует о применимости разработанной технологии для получения терапевтических белков.
Заключение
Развитие биотехнологии позволило получать в необходимых количествах многие ранее малодоступные терапевтические белки. Подавляющая часть таких белков синтезируется штаммами-продуцентами в виде нерастворимых и биологически неактивных ТВ. Для восстановления биологической активности целевого продукта требуются определенные шаги для растворения агрегатов, очищения белка и его рефолдинга. Данная работа посвящена совмещению нескольких этапов. Преимуществом такого подхода является простота, быстрота и высокая эффективность. Метод восстановления биологической активности на аффинной колонке высокотехнологичен, поскольку позволяет совместить эффективный рефолдинг с очищением целевого продукта.
Выше приведенные данные свидетельствуют о том, что предложенная технология получения, очищения и восстановления биологической активности является универсальной и может быть легко перенесена на другие терапевтические белки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Terpe K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appl Microbiol Bio-technol. 2006. Vol. 72(2). P. 211-222.
2. Mattanovich D., Branduardi P., Dato L., Gasser B., Sauer M., Porro D. Recombinant protein production in yeasts // Methods Mol Biol. 2012. Vol.824. P. 329-358.
3. Sivashanmugam A., Murray V., Cui C., Zhang Y., Wang J., Li Q. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli // Protein Sci. 2009. Vol. 18(5). P. 936-948.
4. Upadhyay A. K., Murmu A., Singh A., Panda A. K. Kinetics of inclusion body formation and its correlation with the characteristics of protein aggregates in Escherichia coli // PLoS One. 2012;7(3):e33951.
5. Burgess R. R. Refolding solubilized inclusion body proteins // Methods Enzymol. 2009. Vol. 463. P. 259-282.
6. Гусарова В. Д., Миронов А. Ф. Выделение рекомбинантных белков из тел включения бактериальных продуцентов // Биофармацевтический журнал 2010. Т.2. №1. С. 14-29.
7. Кособокова Е. Н., Косоруков В. С. Исследование влияния поли-His доменов на уровень экспрессии и эффективность очистки Интерферона-а^ человека // Российский биоте-рапевтический журнал. 2010. №4. С. 107-112
8. Кособокова Е. Н., Скрыпник К. А., Пинюгина М. В., Щер-
баков А. И., Косоруков В. С. Оптимизация процесса ре-фолдинга рекомбинантного гранулоцитарно-
макрофагального колониестимулирующего фактора человека, иммобилизованного на аффинном сорбенте // Биотехнология. 2013. №3. в печати.
Поступила в редакцию 30.09.2013 г.
