CC BY
10
УДК 577.112.82: 538.958
РЕНТГЕНОЭЛЕКТРОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ КОНЬЮГАТОВ АЛЬБУМИНА
НАЙМУШИНА Е.А., КОЖЕВНИКОВА О.В., *ШАБАНОВА И. Н., БАРСУКОВ А.К.
Удмуртский государственный университет, 426034, г. Ижевск, ул. Университетская, 1
*Физико-технический институт УрО РАН, 426000, г. Ижевск, ул.Кирова, 132
АННОТАЦИЯ. Изучалось влияние температуры и модификации на форму рентгеноэлектронных спектров альбумина норки. Исследовались нативная форма белка и модифицированная совиалем (сополимер винилпир-ролидона с диацеталем акролеина). Исследования проводились на уникальном рентгеноэлектронном магнитном спектрометре. Немодифицированный альбумин изменяет структуру, определяемую по спектрам С^ и N1^ при нагреве выше 70-80 °С. В его составе уменьшается содержание азота, ковалентно связанного с водородом (КИ3, КИ2). При модифицировании альбумина совиалем (коньюгат) термостабильность альбумина повышается, и изменение структуры рентгеноэлектронных спектров наблюдается лишь при температуре ~200 °С.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: альбуминовые биопрепараты, коньюгат (сополимерномодифицированная форма альбумина), рентгеноэлектронная спектроскопия (РЭС).
ВВЕДЕНИЕ
Технологические нововведения в фармацевтической биотехнологии невозможны без выполнения систематических фундаментально-ориентированных и прикладных исследований [1,2]. Большое значение в научно-технических разработках сополимерномодифициро-ванных форм физиологически активных белков-пептидов, для организации промышленного выпуска иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов нового поколения имеет получение единой картины позволяющей объяснить структуру и свойства новых форм. Набор используемых экспериментальных методов для исследования химического строения альбуминовых биопрепаратов ограничен. Метод РЭС позволяет исследовать электронную структуру, химическую связь, ближнее окружение атома с помощью уникальных магнитных электронных спектрометров. Кроме того, метод РЭС является неразрушающим методом исследования, что особенно важно при исследовании метастабильных систем.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Проведено изучение влияния температуры и степени модификации на форму рентгеноэлектронных спектров альбумина норки. Исследовались нативная форма белка и модифицированная совиалем (сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина).
Исследования проводились на уникальном рентгеноэлектронном магнитном спектрометре [3] с двойной фокусировкой с аппаратурным разрешением менее 0,1эВ, при возбуждении А1Ка- линией (1486,6 эВ) в вакууме 10-6-10-10 Па. Преимущество электронного магнитного спектрометра по сравнению с электростатическими спектрометрами заключается в конструктивном отделении энергоанализатора магнитного типа от вакуумной камеры спектрометра, что позволяет применять различные способы воздействия на образец (сопровождающиеся интенсивным выделением агрессивных газовых потоков) в вакуумном объеме спектрометра без ущерба для фокусирующих свойств прибора.
Изучаемые образцы представляли собой непроводящие системы, на поверхности которых при воздействии рентгеновского луча возникает положительный заряд. В нашем случае, чтобы исключить влияние эффектов зарядки, устанавливалась алюминиевая фольга на пути прохождения рентгеновского излучения между анодом рентгеновской трубки и поверхностью образца. При облучении фольги рентгеновским излучением выбиваются дополнительные электроны, которые нейтрализуют поверхностный положительный заряд. Предлагаемый нами метод избавления от зарядки образца оказался эффективным, о чем можно было судить по положению и ширине полученных спектров.
С целью изучения состояния атомов углерода, кислорода, азота в альбумине и коньюгате исследовались эталонные образцы аминокислот (глицина и гистидина), сополимера совиаля, а также использовались ранее полученные в лаборатории данные по элетронной структуре графита и углеводородов [4]. Исследовались остовные электронные С^, N1s и О^ спектры.
На основе полученных данных была отработана методика разложения спектров на составляющие при помощи программы, основанной на методе наименьших квадратов. В программу для разложения закладываются энергетическое положение, ширина на полувысоте составляющих спектра и их интенсивности. Разложение осуществлялось функцией Лоренца с максимальным приближением огибающей к экспериментальной кривой. Точность в определении положения пиков составляет 0,1 эВ. Вычитание интенсивности фона проводилось по стандартной методике, предложенной Д.А. Ширли [5]. Ошибка в определении контрастности электронных спектров при этом составила не более 5 %.
Изучались С^, N1s, О^ спектры внутренних уровней образцов нативной и модифицированных форм альбумина при комнатной температуре, а также полученные в ходе нагрева до 200 °С. Для нагрева образца служила печь, находящаяся в контакте с образцом по всей его площади.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследовались С^, N1s, О^ внутренних уровней образца альбумина норки при температурах от комнатной до 200 °С. Спектр С^ углерода (рис. 1) состоит из 5 составляющих, связанных с различным окружением атомов углерода: С-С (284 eV), С-Н (285 eV), СН-НЫ (285,5 eV), ЫН-СО (288 eV), С-О-О-Н (289 eV) в соотношениях, приведенных в таблице. О присутствии связи С-С свидетельствует также сателлит в области 306 eV [6].
Таблица
Составляющие C1s спектров углерода в %
Альбумин Альбумин 80 °С Коньюгат Коньюгат 200 °С Совиаль Совиаль 200 °С
С-С 32 17 28 33 15 -
С-Н 12 17 17 31 56 68
С-Н-Ы 24 19 17 - - -
С-О (Ы) 7,5 19 17 35 19 23
С-О-О-Н 24 27 19 - 7 9
спектр альбумина при комнатной температуре (рис. 2) состоит из двух составляющих отражающих связи азота с водородом (Ы-Н) и кислородом (Ы-О).
При нагреве до 70-80 °С структура рентгеноэлектронных спектров существенно изменяется: уменьшается вклад составляющей Ы-Н (аминогрупп ЫЫНз, ЫЫН2) в спектрах С^, Ы^. В спектре С^ растет составляющая С-Н и С-О.
При модифицировании альбумина (коньюгат) совиалем структура рентгеноэлектронных спектров изменяется (рис. 1). Увеличивается максимум 284 eV, т.е. кроме связей С-С накладывается новая составляющая связанная с изменением окружения атомов углерода. В спектре (рис. 2) появляется составляющая с меньшей энергией связи.
Как следует из структурной формулы совиаля, эта составляющая соответствует связи С-Ы(-Н) по энергии связи близкая к связи С-С. Присутствие этой прочной ковалентной связи стабилизирует КН составляющую в связи с СН, что приводит к термостабилизации коньюгата до 200 °С. Выше этой температуры структура рентгеноэлектронных спектров коньюгата изменяется и становится близкой к структуре альбумин. Уменьшается максимум отражающий связи атомов Ы-С и Ы-Н.
В С^ спектре совиаля (сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина) (рис. 1) полученном при комнатной температуре присутствуют составляющие от связей: С-С, С-Н, СН-НЫ, Ы-СО. При нагреве до 200 °С остаются преимущественно связи С-Н. Об этом свидетельствует отсутствие сателлитной структуры в области 306 eV.
СЬ
270 272 274 276 278 280 282 284 286 288 290 292 294 296 298 300 Энергия связи, эВ
Рис. 1. Рентгеноэлектронные спектры С^ альбумина, коньюгата и совпали, полученные в ходе нагрева от комнатной температуры до 200 °С
Рис. 2. Рентгеноэлектронные спектры N1 нативной формы альбумина норки и коньюгата
N18
коньюгат Т=473К
коньюгат Т=370К
коньюгат Т=300К
альбумин Т=300К
~г
I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I
390 392 394 396 398 400 402 404 406 408 410
Энергия связи, эВ
ВЫВОДЫ
Исследование рентгеноэлектронных спектров нативной и модифицированной совиалем форм альбумина норки при температурах от комнатной до 200 °С позволяет сделать выводы о том, что:
- низкая термостабильность белка (альбумина) обусловлена слабой связью NH3 (NH2) группы с СН группой и уменьшением NH (NH3, NH2) групп в составе белка;
- одним из следствий образования ковалентной связи атомов азота с атомами углерода С-N (-H), в данном случае, является повышение термостабильности сополимерномодифицированного белка.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Барсуков А.К., Бармин А.В, Кожевникова О.В. и др. К вопросу о совершенствовании технологии производства фармацевтических биопрепаратов // Сельскохозяйственная биология. 2005. №6. С.84-91.
2. Барсуков А.К., Бармин А.В., Кузнецов А.И. и др. Разработка экспериментальных подходов на основе белков-стандартов для оценки качества биопрепаратов крови и иммунопероксидазных конъюгатов, специфичных к иммуноглобулинам G человека и животных // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т.45, №4. С.487-492.
3. Trapeznikov VA., Shabanova I.M., Zhuravlev VA The use of the X-ray photoelectron spectroscopy for studying inverse p-decay // Electron Spectroscopy and Related Phenomena. 2004. P.731 -734.
4. Макарова Л.Г., Шабанова И.Н., Теребова Н.С. Применение метода рентгеноэлектронной спектроскопии для исследования химического строения углеродных наноструктур // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2005. Т.71, №5. С.26-28.
5. Анализ поверхности методами оже- и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии / пер. с англ. / под ред. Д.Бриггс, М.П.Сих. М. : Мир, 1987. 600 с.
6. Шабанова И.Н. Рентгеноэлектронная спектроскопия неупорядоченных систем на основе переходных металлов : дис. д-ра физ.-мат.наук. Ижевск, 1990. 502 с.
X-RAY PHOTOELECTRON INVESTIGATION OF THE THERMOSTABILITY OF ALBUMIN CONJUGATES
Naimushina E.A., Kozhevnikova O.V., *Shabanova I.N., Barsukov A.K. Udmurt State University, Izhevsk, Russia
*Physical-Technical Institute, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Izhevsk, Russia
SUMMARY. In the present paper the influence of temperature and modification on the shape of the X-ray photoelectron spectra of mink albumin are studied. The native protein form and the one modified with copolymer of vinylpyrrolidone with acrolein diacetal are investigated. The investigations were carried out on a unique X-ray electron magnetic spectrometer. At heating to temperatures above 70 - 80 °C, the structure of unmodified albumin changes and is determined by the C1s and N1s spectra. In the albumin composition, the content of nitrogen covalently bound with hydrogen (NH3, NH2) decreases. When it is modified with copolymer of vinylpyrrolidone with acrolein diacetal (conjugate), the albumin thermostability improves, and the structure variation of the X-ray photoelectron spectra can be observed only at ~200 °C.
KEYWORDS: albumin biopreparations, conjugate (albumin modified with copolymer of vinylpyrrolidone with acrolein diacetal), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).
Наймушина Екатерина Александровна, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаб. РЭС Института физики поверхности Удмуртского государственного университета
Кожевникова Ольга Владимировна, научный сотрудник факультета медицинской биотехнологии УдГУ
Шабанова Ирина Николаевна, доктор физико-математических наук, профессор, главный научный сотрудник лаб. Электронной спектроскопии ФТИ УрО РАН, тел. (3412)432539, e-mail: [email protected]
Барсуков Алексей Константинович, кандидат биологических наук, доцент, декан факультета медицинской биотехнологии УдГУ
