CC BY
8
«(ИНФЕКЦИИ И ИНФЕКЦИОННАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ В ГЕМАТОЛОГИИ И СЛУЖБЕ КРОВИ»
Санкт-Петербург 13-14 ноября 2014 г.
не обеспечивает обязательного доведения результатов обследования до самого донора, задерживает обработку документации на СПК, не мотивирует больного к диспансерному наблюдению (отсутствие квалифицированного послетестового консультирования). При этом лабораторный скрининг доноров не выпол-
няет полностью роль высокоэффективного этапа эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией. Необходимо решить вопрос об обязательности и формах учета лиц с положительными результатами скрининга на наличие маркеров ВИЧ.
Панкратова О. С., ЧухловинА. Б., Вавилов В. Н., Ширяев С. Н., Эйсмонт Ю. А., Зубаровская Л. С.,Афанасьев Б. В.
Научно-исследовательский институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, отделение клинической микробиологии, ФГБОУВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. П. П. Павлова», Санкт-Петербург
РЕАКТИВАЦИЯ ГЕРПЕСВИРУСОВ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК: ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ВОЗРАСТА И ИНТЕНСИВНОСТИ КОНДИЦИОНИРОВАНИЯ
Введение. Протоколы трансплантации гемо-поэтических клеток (ТГСК) включают в себя интенсивную кондиционирующую терапию, которая проводится для лечения основного заболевания. При этом подавляется собственный гемопоэз, и создаются условия для экспансии донорских кроветворных клеток. На фоне временного истощения иммунной системы в течение первого месяца после ТГСК может активироваться целый ряд инфекционных патогенов, в частности — эндогенных герпесвирусов.
Цель. Наше исследование имело целью выявить возможные ассоциации между реактивацией основных видов герпесвирусов и наиболее частыми осложнениями ТГСК.
Материалы и методы. В течение 20022012 гг. мы обследовали группу из 198 пациентов в возрасте от 1 до 66 лет (медиана — 21 год) с различными онкогематологическими заболеваниями, которым выполнялась аллогенная ТГСК. Соотношение трансплантаций костного мозга и периферических стволовых клеток составляло 35 :65, неродственных НЬА-совместимых ТГСК — 64% случаев, миелоаблативные режимы кондиционирования были использованы в 40 % случаев. После ТГСК учитывали частоту и длительность наиболее частых осложнений, а именно: острой реакции «трансплантат против хозяина» (оРТПХ), мукозитов, геморрагических циститов, неврологических синдромов, пневмоний, тяжелых инфекционных состояний. Качественное определение ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), вируса простого герпеса (ВПГ) и вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в лейкоцитах крови
и костного мозга проводили методом геноспе-цифической ПЦР с применением стандартных коммерческих тест-систем. Тестирование проводили еженедельно до дня +100, далее — при повторном обследовании.
Результаты. Частота выявления ДНК ВПГ, ВЭБ и ЦМВ в общей выборке биологических образцов составляла, соответственно, 8%, 19% и 11 %. В то же время частота реактивации ВПГ и ВЭБ (2 и более последующих позитивных теста при мониторинге) у реципиентов ГСК составляла, соответственно, 22% и 30%, с пиком встречаемости вирусов через 1-3 месяца после трансплантации. Реактивация ВПГ и ЦМВ была зависимой от возраста больных, будучи минимальной у детей младшего возраста (1-4 года), с последующим повышением к 18-20 годам. Была обнаружена выраженная корреляция между выявлением ЦМВ и ВПГ, а также между ПЦР-позитивностью по ЦМВ и ВЭБ, что говорит о возможности смешанных вирусных инфекций после ТГСК. Реактивация герпесвирусов более часто отмечалась у пациентов, которые получили миелоаблативный режим кондиционирования, по сравнению с немиелоаблативной терапией. Частота инфекционных осложнений среди молодых ВПГ-позитивных пациентов была несколько выше, чем в ВПГ-негативных случаях (88% и 39%, р = 0,06). Выраженность и длительность проявлений мукозита была достоверно ассоциирована с активацией ВПГ и ЦМВ (соответственно, р = 0,02 и р = 0,008). Риск развития кишечной формы острой РТПХ и, в меньшей мере — геморрагического цистита коррелирова-
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИтом X, № 4, 2014
ли с реактивацией ВЭБ (соответственно, р = 0,05 ир = 0,08).
Выводы. Реактивация отдельных видов гер-песвирусов у детей и подростков ассоциирована с более высокой встречаемостью ранних
посттрансплантационных осложнений, в том числе — тяжелых форм РТПХ, бактериальных инфекций, мукозита полости рта и, вероятно — геморрагических циститов.
Плотникова М.А., Клотченко С. А., ВасинА. В.
ФГБУ«Научно-исследователъский институт гриппа»МинздраваРоссии, Санкт-Петербург
РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОКИНОВ
Введение. Цитокины являются важнейшими межклеточными медиаторами, образующими сложную сеть взаимодействий. Биологические функции цитокинов направлены на регуляцию трёх групп физиологических процессов: иммунного ответа, кроветворения (система гемопоэза) и воспаления. В норме клетки не синтезируют большинство цитокинов в отсутствие эндогенного или экзогенного воздействий. Исключение составляют гемопоэтические цитокины, которые локально функционируют практически постоянно. Изменение экспрессии генов цитокинов, повышение уровня цитокинов в крови может свидетельствовать о системной или органной патологии. В связи с этим диагностика и клинический мониторинг экспрессии цитокинов являются важнейшими этапами оценки иммунного состояния пациента.
Цель исследования состояла в разработке метода мультиплексного определения мРНК цитокинов на основе ПЦР с детекцией в режиме реального времени (мПЦР).
Материалы и методы. В процессе разработки мПЦР в программах Primer3 и PrimerQuest (http://www.idtdna.com/Scitools) были подобраны праймеры и TaqMan зонды для выявления мРНК цитокинов IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12ß, IL-18, IFN-y и TNF, а также генов «домашнего хозяйства» GAPDH и АСТВ. Праймеры, TaqMan зонды были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» (Россия). мПЦР проводили с использованием Taq полимеразы и соответствующего буфера (Медиген, Россия), и прочих реагентов (Promega, США).
Результаты. Оригинальные последовательности праймеров и TaqMan зондов, подобранных к белок-кодирующим областям генов цитокинов, разбили на группы для использования в трёх наборах мультиплексных реакций (SETI,
8ЕТ2 и БЕТЗ), каждый из которых позволяет количественно выявлять три цитокина-мишени и эндогенный контроль (АСТВ или ОАРОН). Для определения оптимального термального профиля рассчитали пороговые значения Cq при трёх температурах отжига праймеров: 55, 57 и 60 °С. В качестве кДНК-матриц использовали смеси очищенных ампликонов в концентрациях по 0,1 нг/мкл. Для всех мишеней наибольший сигнал флуоресценции получали при 57 °С, в дальнейшем это значение температуры отжига использовали во всех мПЦР. Для нормализации выбрали ген ОАРЭН, широко применяемый в качестве эндогенного контроля. Для унификации разрабатываемой тест-системы в каждой реакции использовали одинаковый состав ПЦР-смеси, идентичный по содержанию dNTP, концентрации ионов магния и количеству единиц активности Taq-пoлимepaзы, а также одинаковую программу амплификации. Оценку валидности разработанной тест-системы на основе мПЦР для анализа уровня экспрессии цитокинов проводили по следующим критериям: эффективность амплификации специфических мишеней в мПЦР, чувствительность, динамический диапазон и воспроизводимость получаемых результатов. Данные, представленные на рис. 6, свидетельствуют о том, что эффективности амплификации находятся в пределах 90-100% и отличаются друг от друга в каждой из мПЦР не более чем на 10%. Это значение является допустимой погрешностью при расчёте уровня экспрессии с использованием ДДС1 Динамический диапазон используемых наборов мПЦР составил 5-6 порядков. Нижний предел чувствительности метода в среднем равен 20 фМ для очищенных ПЦР-фрагментов. Коэффициенты вариации значений Cq, определяющие воспроизводимость системы, составили не более 1,5%. Разработанную тест-
