Разработка мультиплексной пир для определения уровня цитокинов Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИтом X, № 4, 2014

ли с реактивацией ВЭБ (соответственно, р = 0,05 ир = 0,08).

Выводы. Реактивация отдельных видов гер-песвирусов у детей и подростков ассоциирована с более высокой встречаемостью ранних

посттрансплантационных осложнений, в том числе — тяжелых форм РТПХ, бактериальных инфекций, мукозита полости рта и, вероятно — геморрагических циститов.

Плотникова М.А., Клотченко С. А., ВасинА. В.

ФГБУ«Научно-исследователъский институт гриппа»МинздраваРоссии, Санкт-Петербург

РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОКИНОВ

Введение. Цитокины являются важнейшими межклеточными медиаторами, образующими сложную сеть взаимодействий. Биологические функции цитокинов направлены на регуляцию трёх групп физиологических процессов: иммунного ответа, кроветворения (система гемопоэза) и воспаления. В норме клетки не синтезируют большинство цитокинов в отсутствие эндогенного или экзогенного воздействий. Исключение составляют гемопоэтические цитокины, которые локально функционируют практически постоянно. Изменение экспрессии генов цитокинов, повышение уровня цитокинов в крови может свидетельствовать о системной или органной патологии. В связи с этим диагностика и клинический мониторинг экспрессии цитокинов являются важнейшими этапами оценки иммунного состояния пациента.

Цель исследования состояла в разработке метода мультиплексного определения мРНК цитокинов на основе ПЦР с детекцией в режиме реального времени (мПЦР).

Материалы и методы. В процессе разработки мПЦР в программах Primer3 и PrimerQuest (http://www.idtdna.com/Scitools) были подобраны праймеры и TaqMan зонды для выявления мРНК цитокинов IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12ß, IL-18, IFN-y и TNF, а также генов «домашнего хозяйства» GAPDH и АСТВ. Праймеры, TaqMan зонды были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» (Россия). мПЦР проводили с использованием Taq полимеразы и соответствующего буфера (Медиген, Россия), и прочих реагентов (Promega, США).

Результаты. Оригинальные последовательности праймеров и TaqMan зондов, подобранных к белок-кодирующим областям генов цитокинов, разбили на группы для использования в трёх наборах мультиплексных реакций (SETI,

8ЕТ2 и БЕТЗ), каждый из которых позволяет количественно выявлять три цитокина-мишени и эндогенный контроль (АСТВ или ОАРОН). Для определения оптимального термального профиля рассчитали пороговые значения Cq при трёх температурах отжига праймеров: 55, 57 и 60 °С. В качестве кДНК-матриц использовали смеси очищенных ампликонов в концентрациях по 0,1 нг/мкл. Для всех мишеней наибольший сигнал флуоресценции получали при 57 °С, в дальнейшем это значение температуры отжига использовали во всех мПЦР. Для нормализации выбрали ген ОАРЭН, широко применяемый в качестве эндогенного контроля. Для унификации разрабатываемой тест-системы в каждой реакции использовали одинаковый состав ПЦР-смеси, идентичный по содержанию dNTP, концентрации ионов магния и количеству единиц активности Taq-пoлимepaзы, а также одинаковую программу амплификации. Оценку валидности разработанной тест-системы на основе мПЦР для анализа уровня экспрессии цитокинов проводили по следующим критериям: эффективность амплификации специфических мишеней в мПЦР, чувствительность, динамический диапазон и воспроизводимость получаемых результатов. Данные, представленные на рис. 6, свидетельствуют о том, что эффективности амплификации находятся в пределах 90-100% и отличаются друг от друга в каждой из мПЦР не более чем на 10%. Это значение является допустимой погрешностью при расчёте уровня экспрессии с использованием ДДС1 Динамический диапазон используемых наборов мПЦР составил 5-6 порядков. Нижний предел чувствительности метода в среднем равен 20 фМ для очищенных ПЦР-фрагментов. Коэффициенты вариации значений Cq, определяющие воспроизводимость системы, составили не более 1,5%. Разработанную тест-

«(ИНФЕКЦИИ И ИНФЕКЦИОННАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ В ГЕМАТОЛОГИИ И СЛУЖБЕ КРОВИ»

Санкт-Петербург 13-14 ноября 2014 г.

систему успешно апробировали с использованием клеточной модели гриппозной инфекции.

Выводы. На основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени разработана система, позволяющая проводить высокочувствительный одновременный количественный анализ мРНК 1Ь-1р, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-10,

1Ь-12Р, 1Ь-18, №N-7 и ТОТ-а человека. Было показано, что разработанная тест-система позволяет получать стабильные хорошо воспроизводимые результаты и удовлетворяет всем необходимым требованиям для проведения анализа уровня экспрессии с использованием ДДО; метода.

Полухина О. В.1, Суворова Т.Н.2

1 ФГБУ«Россиискии научный центррадиологии и хирургических технологии»МинздраваРоссии, Санкт-Петербург;

2 ФГБВОУВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова»МО РФ, Санкт-Петербург

РАЗНООБРАЗИЕ СПЕКТРА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ИММУНОКОМПРОМЕТИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО ХИРУРГИЧЕСКОГО СТАЦИОНАРА

Введение. Проблема микробиологического мониторинга у иммунокомпрометированных больных является предметом изучения на протяжении нескольких десятилетий. Нарушения иммунитета способствуют расширению спектра возможных возбудителей инфекционных осложнений у этой категории пациентов.

Цель: изучить видовой состав, выявить спектр основных патогенов у иммунокомпрометированных пациентов специализированного хирургического стационара федерального уровня.

Материалы и методы. В период с 2006 по 2012 гг. исследовали 8100 образцов клинического материала от 3543 больных. Использовали бактериологические методы исследования, идентификацию возбудителей проводили с помощью бактериологического анализатора Уйек-2 (биоМерьё, Франция). Клиническую значимость изолятов определяли в соответствии с нормативными документами.

Результаты. Среди выделенных в клинически значимом титре 4033 изолятов были идентифицированы представители 54 родов и 139 видов. Преобладали представители семейства ЕйегоЬа^епасеае: было выделено 1667 штаммов, что составило 41,33% от всех выделенных изолятов. Доля энтеробактерий колебалась от 22,32% в отделяемом дыхательных путей до 44,18% в пробах мочи. Частота выделения энтеробактерий из проб мочи превышала этот показатель для других видов исследованного материала (р<0,05) и не различалась при исследовании проб крови, фрагментов катетеров, раневого отделяемого. Были идентифицированы представители 17 родов, среди них преоб-

ладали бактерии рода Escherichia, Klebsiella, Enterobacter. Кроме того, были выделены представители родов Proteus, Citrobacter, Morganella, Serratia, Providencia, а среди редко встречающихся — Raoultella, Pantoea, Pasteurella, Ewingella, Kluyvera, Yokenella. Доля грамположительных бактерий (п= 1371, 33,99%) в разных видах материала колебалось от 22,32% в отделяемом дыхательных путей до 42,72% в пробах мочи. При этом каталазаположительные бактерии чаще выделялись из крови (24,55 %), фрагментов катетеров (24,24%), отделяемого дыхательных путей (18,64%), а каталазаотрицательные — из проб мочи (24,8%) и раневого отделяемого (16,92%). Среди представителей 14 родов преобладали бактерии рода Enterococcus и Staphylococcus. Кроме того, были выделены представители родов Streptococcus, Kocuria, Aerococcus, Atopobium, Micrococcus и Arcanobacterium. Доля неферментирующих грамотрицательных бактерий составила 14,55% (п=587), при этом частота их выделения из отделяемого дыхательных путей достигала 40,11% и превышала этот показатель для других видов исследованного материала (р< 0,05). Были идентифицированы представители 13 родов, преобладали бактерии рода Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas. Кроме того, были выделены бактерии родов Sphingomonas, Burkholderia, Aeromonas, Alcaligenes, Brevundimonas, Rhizobium, Achromobacter, Actinobacillus, Chryseomonas, Sphingobacterium. Доля микромицетов составила 9,92% от всех выделенных изолятов и колебалась от 5,41% в пробах мочи и до 21,21% в смывах фрагментов венозных катетеров. Среди них были идентифицированы представители