CC BY
18
russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(3)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-173-178
immunology
14. Raab S.S., Lenel J.C., Cohen M.B. Low grade transitional cell carcinoma of the bladder. Cytologic diagnosis by key features as identified by logistic regression analysis. Cancer. 1994; Sep. 1; 74 (5): 1621-6.
15. Hughes J. H., Raab S. S., Cohen M. B. The cytologic diagnosis of low-grade transitional cell carcinoma. Am. J. Clin. Pathol. 2000; 114: 59-67.
16. Xin W., Raab S. S., Michael C. W. Low-grade urothelial carcinoma: reappraisal of the cytologic criteria on ThinPrep. Diagn. Cytopathol. 2003; 29 (3):125-9.
17. Mai K. T., Ball C. G., Kos Z. et al. Three-dimensional cell groups with disordered nuclei and cellular discohesion (3DDD) are associated with high sensitivity and specificity for cystoscopic urine cytopatho-logical diagnosis of low-grade urothelial neoplasia. Diagn. Cytopathol. 2014;42(7):555-63.
18. Nathan N.A., Narayan E., Smith M.M., Horn M.J. Cell block cytology. Improved preparatlon and its efficacy in diagnostic cytology. Am. J. Clin. Pathol. 2000;114: 599-606.
19. Reid M.D., Osunkoya A^., Siddiqui M.T., Looney S.W. Accuracy of grading of urothelial carcinoma on urine cytology: an analysis of interobserver and intraobserver agreement. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2012; 5: 882-91.
20. Raab S.S., Grzybicki D.M., Vrbin C.M., Geisinger K.R. Urine cytology discrepancies: frequency, causes, and outcomes. Am.J. Clin. Pathol. 2007;127: 946-53.
21. Rosenthal D.L., Vandenbussche C.J., Burroughs F.H. et al. The Johns Hopkins Hospital template for urologic cytology samples: part I-creating the template. Cancer Cytopathol. 2013;121:15-20.
22. Ubago J.M., Mehta V. Wojcik E.M., Barkan G.A. Evaluation of atypical urine cytology progression to malignancy. Cancer Cytopathol. 2013;121: 387- 91.
23. Koss L.G., Hoda R.S. Koss's cytology of the urinary tract with histopathologic correlations. New York: Springer Press; 2012.
24. Hoda R.S. Non-gynecologic cytology on liquid-based preparations: 3 morphologic review of facts and artifacts. Diagn. Cytopathol. 2007; 35:621-34.
25. Khaled H. Schistosomiasis and cancer in Egypt review. J. Adv. Res. 2013; 4: 461- 6.
26. Hattori M., Nishimura Y., Toyonaga M. et al. Cytological significance
иммунология
© коллектив авторов, 2018
УДК 616.61-089.843-085.276.2.015.22:615.831]-078.33
Федулкина Б.А.1, Кофиади И.А.2 , Батазин А.Б.1, Кильдюшевский А.в.1, Чуксина Ю.Ю.1 , Зулькарнаев А.Б.1 разработка метода оценки уровня экспрессии генов, ответственных
за активацию и ингибирование т-клеточного ответа у реципиентов
почечного трансплантата при проведении экстракорпоральной фотохимиотерапии
1 ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. владимирского», 129110, Москва;
2 ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, Москва, Россия
Разработаны и апробированы тест-системы для оценки уровня экспрессии генов иммунной системы, ответственных за активацию и ингибирование Т-клеточного ответа, у реципиентов почечного трансплантата при проведении экстракорпоральной фотохимиотерапии.
Ключевые слова: РНК; экспрессия генов; гены иммунной системы; обратная транскрипция; экстракорпоральная фотохимиотерапия.
Для цитирования: ФедулкинаВ.А., КофиадиИ.А., Ватазин А.В., Кильдюшевский А.В., ЧуксинаЮ.Ю., Зулькарнаев А.Б. Разработка метода оценки уровня экспрессии генов, ответственных за активацию и ингибирование т-клеточного ответа у реципиентов почечного трансплантата при проведении экстракорпоральной фотохимиотерапии. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63 (3): 173-178. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-173-178
Для корреспонденции: Федулкина Вероника Андреевна, канд.мед.наук, ст.науч.сотр. хирургического отд-ния трансплантологии и диализа; е-mail: v.fedulkina@mail.ru
of abnormal squamous cells in urinary cytology. Diagn. Cytopathol. 2012;40: 798-803.
27. Gulmann C., Paner G.P., Parakh R.S. et al. Immunohistochemical profile to distinguish urothelial from squamous differentiation in carcinomas of urothelial tract. Hum. Pathol. 2013; 44: 164-72.
28. Zhong M., Gersbach E., Rohan S.M., Yang X.J. Primary adenocarcinoma of the urinary bladder: differential diagnosis and clinical relevance. Arch. Pathol. Lab. Med. 2013; 137; 371-81.
29. Bardales R.H., Pitman M.B., Stanley M.W. et al. Urine cytology of primary and secondary urinary bladder adenocarcinoma. Cancer. 1998; 34: 335-43.
30. Ciesla M.C., Guidos B.J., Selvaggi S.M. Cytomorphology of small-cell (neuroendocrine) carcinoma on ThinPrep cytology as compared to conventional smears. Diagn. Cytopathol. 2001; 24: 46-52.
31. Dahm P., Gschwend J.E. Malignant non-urothelial neoplasms of the urinary bladder: a review. Eur. Urol. 2003; 44: 672-81.
32. Chalasani V, Chin J.L., Izawa J.I. Histologic variants of urothelial bladder cancer and nonurothelial histology in bladder cancer. Can. Urol. Assoc. J. 2009; 3(6): l93-8.
33. Westfall D.E., Folpe A.L., Paner G.P. et al. Utility of a comprehensive immunohistochemical panel in the differential diagnosis of spindle cell lesions of the urinary bladder. AmJ.Surg.Pathol. 2009; 33: 99-105.
34. Cheson B.D., Schumann J.L., Schumann G.B. Urinary cytodiagnostic abnormalities in 50 patients with non-Hodgkin's lymphomas. Cancer. 1984; 54: 1914-9.
35. Jimenez-Hernandez M., Lopez-Guillermo A., Cobo F. et al. Bladder involvement of diffuse large B-cell lymphoma diagnosed by a cytological study of the urine. Leuk. Lymphoma. 2002; 43: 187-9.
36. Khalbuss W.E., Hossain M., Elhosseiny A. Primary malignant melanoma of the urinary bladder diagnosed by urine cytology: a case report. Acta Cytol. 2001;45:631-5.
37. Xiao G.Q., Chow J., Unger P.D. Metastatic tumors to the urinary bladder. Clinicopathologic study of 11 cases. Int.J.Surg.Pathol. 2012; 20: 342-8.
38. Abol-Enein H., Kava B.R., Carmack A.J. Nonurothelial cancer of the bladder. Urology. 2007; 69 (1): 93-104.
Поступила Принята к печати
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2018; 63(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-173-178
ИММУНОЛОГИЯ
Fedulkina V.A.', KofiadiI.A.2, VatazinA.V.'.', Kildyu.shev.skyA.V'.', Chuksina Yu.Yu.1, ZulkarnaevA.B.' THE DEVELOPMENT OF TECHNIQUE OF EVALUATION OF GENES' EXPRESSION LEVEL RESPONSIBLE FOR ACTIVATION AND INHIBITION OF T-CELL RESPONSE IN RECIPIENTS OF RENAL TRANSPLANT UNDER APPLICATION OF EXTRA-CORPORAL PHOTOCHEMOTHERAPY
1The State Budget Institution of Health Care of the Moscow Oblast "The M.F. Vladimirskiy Moscow Oblast Research Clinical Institute", 1290110, Moscow, Russia
2The Federal State Budget Scientific Institution "The State Scientific Center "The Institute of Immunology"" of the Federal Medical Biological Agency of Russia, 115478, Moscow, Russia
The article presents the developed and approved test-systems for evaluation of the level of expression of immune system responsible activation and inhibition of T-cell response in recipients of renal transplant under application of extra-corporal photochemotherapy.
Keywords: RNA; gene expression; genes of immune system; reverse transcription; extra-corporal photochemotherapy.
For citation: Fedulkina V.A., Kofiadi I.A., Vatazin A.V, Kildyushevsky A.V., Chuksina Yu.Yu., Zulkarnaev A.B. The development of technique of evaluation of genes' expression level responsible for activation and inhibition of T-cell response in recipients of renal transplant under application of extra-corporal photochemotherapy. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostic) 2018; 63(3): 173-178. (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-173-178
For correspondence: Fedulkina V.A., candidate of medical sciences, senior researcher of the Surgical Department of Transplantology and dialysis of the State Budget Institution of Health Care of the Moscow Oblast "The M.F. Vladimirsky Moscow Oblast Research Clinical Institute", e-mail: v.fedulkina@mail.ru Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Acknowledgment. The study was supported by the grant of the The Federal State Budget Scientific Institution "The Russian foundation of fundamental Studies" and the Moscow government, project № 17-44-500307 r.a.
Received 23.10.2017 Accepted 08.11.2017
Введение. Внедрение новых методов предупреждения реакции отторжения трансплантата является актуальным направлением клинической иммунологии [1]. В связи с этим востребованы технологии повышения эффективности методов фармакологической поддержки трансплантата, реализации персонального подхода к терапии реципиентов и поиска новых путей индукции толерантности к пересаживаемым органам и тканям [2].
Одной из перспективных технологий в области индукции толерантности к трансплантату является экстракорпоральная фотохимиотерапия (ЭФХТ), основанная на электромагнитном воздействии на клетки реципиента [3]. Изначально успех ЭФХТ был связан с лечением Т-клеточной лимфомы кожи, затем показал эффективность при ингибировании хронического и острого отторжения в клинике трансплантации сердца, лёгких, печени и почек [4-7].
Несмотря на успешное клиническое применение метода ЭФХТ в клинике трансплантации, биохимические пути, объясняющие механизм индукции толерантности, до настоящего времени не выяснены. Это ограничивает клиническое применение метода ЭФХТ, в частности, в такой важной области, как трансплантация почки. Установление механизмов индукции толерантности позволит повысить эффективность метода, а также учесть индивидуальные особенности пациента при назначении терапии. В связи с этим востребованы исследования качественной и количественной характеристики эффекторных молекул, предположительно задействованных в механизме регуляции иммунного ответа при применении ЭФХТ.
В связи с вышесказанным целью нашего исследования является установление особенностей экспрессии ключевых генов, вовлечённых в регуляцию иммунного ответа до и после проведения ЭФХТ. Целью же данного этапа работы стала разработка средств диагностики ключевых молекул, вовлечённых в процессы активации и ингибирования Т-клеточного ответа, и оценка их аналитических параметров.
Материал и методы. Гены для включения в исследование были подобраны таким образом, чтобы охватить ключевые функциональные этапы, вовлечённые в реализацию иммунного ответа, в том числе при развитии реакции отторжения трансплантата и/или реакции трансплантат против хозяина (РТПХ): ^1 - провоспалительное действие, активация
Т-клеточного ответа, дифференцировка Th17, передача сигнала по пути MAPK, TNF и NFKB; IL2 - провоспалительное действие, активация Т-клеточного ответа, дифференцировка Th1, Th2, Th17, передача сигнала по пути PI3K и JAK-STAT; IFNG -провоспалительное действие, активация клеточного иммунитета, дифференцировка Th1, Th2, Th17, передача сигнала по пути HIF-1 и TGFB; TNFA - провоспалительное действие, передача сигнала по MAPK, NFKB, mTOR, TNF, TGFB пути, принимает участие в процессинге и презентации антигенов. Кроме того, в исследование взяты гены CD28, CTLA4 и PDL1, кодирующие костимуляторные рецепторы, регулирующие клеточную адгезию, осуществляющие взаимодействие с рецепторами антигенпрезентирующих клеток и принимающие участие в передаче сигнала через рецептор Т-клеток.
Проведение анализа осуществляется в два этапа:
- выделение РНК,
- постановка полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)в реальном времени.
Выделение РНК. В работе были использованы образцы крови сотрудников-добровольцев отдела иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (условно здоровые люди без известной истории иммунозависи-мых заболеваний и трансплантации органов, n = 9), образцы крови, полученные из отделения трансплантации ГБУЗ МО МОНИКИ (пациенты с почечным трансплантатом, n = 6) и клинического отделения ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (пациенты с диагнозом общая врожденная иммунная недостаточность - ОВИН, n = 7), собранные с соблюдением процедуры информированного согласия.
Для выделения РНК использовали набор реагентов Проба-НК (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») и реагент Trizol (Qiagen, США). Для выделения ДНК использовали колонки Nucleospin (MachereyNagel, Германия). Использованные в работе методы очистки нуклеиновых кислот подходят для самых разнообразных биологических образцов: периферическая кровь, слюна, мокрота, молоко, моча, сперма, секрет предстательной железы, ликвор и др. Полученный препарат может быть использован для последующего анализа методом ОТ-ПЦР.
Постановка ОТ-ПЦР в реальном времени. Для оценки профиля экспрессии генов была использована технология
относительного анализа количества мРНК в образцах с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.
Принцип метода основан на использовании процесса обратной транскрипции РНК и последующей амплификации кДНК, заключающейся в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки по-линуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой.
Поскольку на низких температурах возможно образование димеров праймеров и неспецифических продуктов амплификации при постановке ПЦР была использована технология «горячего» старта, который обеспечивается использованием модифицированной Taq-полимеразы с активным центром, инактивированным молекулой антитела. При достижении температур, оптимальных для отжига праймеров, происходит диссоциация комплекса фермент-антитело и активный центр освобождается (ООО «НПФ ДНК-Технология, Россия).
В работе использовали вариант ПЦР, основанный на регистрации продуктов ПЦР в режиме реального времени. В реакционную смесь для амплификации введены ДНК-зонды, каждый из которых содержит флуоресцентную метку (репортёр) и гаситель флуоресценции (акцептор). Находясь в пределах одного ДНК-зонда, молекула гасителя эффективно ингибирует флуоресценцию репортёра. При синтезе новой цепи Taq-полимераза, обладающая 5'-экзонуклеазной активностью, разрушает ДНК-зонд, при этом действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции. По мере накопления продуктов амплификации количество разрушенных зондов увеличивается, что приводит к пропорциональному увеличению регистрируемого сигнала. Каждый образец тестировали в двух повторностях.
Для корректной оценки уровня экспрессии исследуемых генов принципиальное значение имеет выбор нормировочных генов. Следует учитывать, что гены, выбранные в качестве нормировочных, могут по-разному экспрессироваться в разных тканях или даже в пределах одной ткани. Если учесть, что сам метод также имеет ошибку, представляется целесообразным проведение нормировки по нескольким генам. В данной работе для этих целей были выбраны гены "домашнего хозяйства" гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT1) и TATA-связывающего протеина (ТВР), применявшиеся в практике анализа экспрессии генов и ранее [8].
При оценке аналитических параметров тест-систем учитывали эффективность амплификации. Стандартные прямые были получены при построении графиков зависимости индикаторных циклов исследуемых мишеней (Cp) от относительной концентрации образцов, рассчитанной в соответствии с выполненными разведениями. В основе анализа лежит метод сравнения индикаторных циклов (показатель ACp). Экспрессия мРНК измеряется в относительных единицах и отражает соотношение уровня представленности транскриптов.
В реакции использовали следующие ферменты: реверта-зу (реакция ОТ) и Taq-полимеразу в количестве 1 и 2,5 ед. активности на реакцию соответственно.
Использованные в работе алгоритмы и базы данных. При формировании перечня маркёров пользовались базами OMIM (https://www.omim.org), KEGG (http://www.kegg.jp), STRING (http://string-db.org) и PDB (http://www.rcsb.org).
Подбор праймеров и зондов осуществляли путём анализа последовательностей ДНК и мРНК базы данных NCBI. При подборе праймеров и зондов учитывали структурную организацию генов, кодирующих мРНК, чтобы исключить отжиг на геномной ДНК; наличие псевдогенов; варианты альтернативного сплайсинга.
При построении множественных выравниваний (multiple alignment) пользовались алгоритмом ClustalW сервера Европейского института биоинформатики (www.ebi.ac.uk). Олигонуклеотиды проектировали с помощью программно-
IMMUNOLOGY
го обеспечения Oligo 6.0. Программа позволяет анализировать последовательность, рассчитывать температуру отжига праймеров и зондов, оценивать стабильность формирующегося дуплекса праймер-мишень, формирование тугоплавких шпилек и димеров праймеров.
Для оценки вероятности формирования и стабильности вторичных структур на выбранных участках генома пользовались алгоритмом Mfold (http://mfold.rna.albany.edu/). Биоинформационный анализ структуры генов, включающий оценку вероятности формирования вторичных структур, способных повлиять на эффективность отжига разрабатываемых олигонуклеотидов, позволил оценить эффективность и специфичность разрабатываемых тест-систем ещё на этапе разработки.
Первичное накопление и обработку данных проводили с помощью программы MSOfficeExcel. В ходе работы вычисляли параметры описательной статистики (среднее арифметическое, стандартное отклонение, дисперсию), используя программное обеспечение SPSS17.0.
Результаты и обсуждение. ЭФХТ часто рассматривается в качестве альтернативы фармакологическим методам подавления иммунного ответа. С молекулярной точки зрения индукция толерантности обусловлена тем, что в процессе ЭФХТ молекула фотоактивативируемого производного псо-ралена - 8-метоксипсоралена (8-МОП), обладающая высокой авидностью к пиримидиновым основаниям, интеркалирует в молекулы нуклеиновых кислот. В результате воздействия электромагнитного излучения в ультрафиолетовом диапазоне между ними образуются перекрестные связи, приводящие к нарушению синтеза белков и апоптозу клеток [9], причём наиболее подвержены этому воздействию лимфоциты, а моноциты, напротив, демонстрируют устойчивость. Это приводит к стимуляции субпопуляций дендритных клеток, приобретающих толерогенный фенотип, изменению профиля экспрессии цитокинов и переключению иммунного ответа с Th1 на Th2 путь [10].
Немногочисленные публикации в мировой литературе, посвящённые анализу эффективности метода ЭФХТ в комплексной терапии острого отторжения почечного аллотран-сплантата, свидетельствуют о его положительном воздействии на купирование клинических и иммунологических симптомов отторжения, что создаёт благоприятные условия для редукции иммуносупрессивной терапии и снижения риска возникновения инфекционных осложнений. Комбинированное применение ЭФХТ со стандартной иммуносупрес-сивной терапией улучшило показатели раннего посттрансплантационного периода, снизив частоту реакции острого отторжения, инфекционных осложнений и улучшив показатели ранней функции аллотрансплантата [11].
Недавние клинические исследования продемонстрировали, что ЭФХТ вызывает выработку антигенспецифических регуляторных Т-клеток, в том числе CD4+, CD25+, еFoxP3+, Т-клеток и IL-10, продуцирующих T-клеток, которые могут иметь значение в реализации второго пути индукции толеро-генных антигенпредставляющих клеток [12].
Исследования последних 10 лет показали, что активация Т-клеток, равно как и индукция толерантности, регулируется соответствующими «вторичными» стимулирующими и инги-бирующими сигналами [13]. Одними из ключевых молекул, ответственных за активацию и анергию CD4+ Т-клеток, являются CD28 и CTLA4. Блокирование этих молекул приводит к индукции толерантности к трансплантированному органу [14]. По всей видимости, подавление экспрессии CD28 приводит к переключению взаимодействия экспрессирующихся на поверхности антигенпрезентирующих клеток молекул класса В7 (CD80/86) на CTLA-4 и/или PD-L1 [15]. Конкурентное ингибирование CD80/86 ограничивает Т-клеточную активацию, терминирует лимфоцитарный ответ, приводит к подавлению экспрессии провоспалительных цитокинов
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2018; 63(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-173-178
ИММУНОЛОГИЯ
(Т№а, ГЬ1) и способствует индукции иммунологической толерантности к презентируемым антигенам.
Цитокины представляют собой вторую важную группу медиаторов иммунного ответа. Они продуцируются клетками различных типов и участвуют в активации клеточного, гуморального ответа и в формировании иммунологической памяти. Помимо реализации иммунного ответа, система цито-кинов участвует и в регуляции ряда других физиологических функций. Более того, она является наиболее универсальной системой регуляции, поскольку цитокины могут синтезироваться практически всеми ядросодержащими клетками организма и способны проявлять биологическую активность как дистанционно (в растворимой форме), так и при межклеточном контакте (в мембранной форме).
Сотрудниками ГБУЗ МО МОНИКИ и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России разработаны тест-системы для оценки уровня экспрессии генов CD28, СТЬА4, PDL1, Л1В, ^2, IFNG, Т^А, вовлечённых в регуляцию иммунного ответа до и после проведения ЭФХТ, в том числе две нормировочные тест-системы для оценки уровня экспрессии генов «домашнего хозяйства» HPRT1 и ТВР.
В ходе этой части работы в рамках разработки тест-систем решались следующие задачи: оценка стабильности экспрессии нормировочных генов, оценка специфичности и чувствительности метода, определение эффективностей амплификации и ошибки метода. Оценку осуществляли в соответствии с рекомендациями по проведению анализа уровня экспрессии генов [8].
Оценка стабильности экспрессии нормировочных генов. Оценку стабильности экспрессии нормировочных генов проводили методом попарного сравнения значений ЛСр,вычисленных по формуле: ЛСр= Ср1 - Ср2,
где Ср - значение характеристического цикла амплификации, автоматически определяемое детектирующим термо-циклером, Ср1 и Ср2 - значения индикаторных циклов для генов 1 и 2.
Если показатель ЛСр между двумя генами постоянен в различных образцах при изменяющихся условиях эксперимента, то оба гена стабильно экспрессируются в данных образцах или имеют общую регуляцию экспрессии. Если для показателя ЛСр характерна дисперсия, выходящая за рамки погрешности метода, то уровень экспрессии одного или обоих генов нельзя считать стабильным.
В этом случае при сравнении разных образцов наилучшими нормировочными генами можно считать:
- пары, имеющие одинаковые средние значения (М) в разных группах пациентов;
- пары, дающие наименьшее среднеквадратичное отклонение а.
Уровень экспрессии нормировочных генов был определён с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Была рассмотрена пара нормировочных генов ТВР и HPRT1 в мононукле-арных клетках периферической крови (МКПК), полученных от разных групп пациентов из ГБУЗ МО МОНИКИ и ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России. Эксперименты проводились на образцах РНК, выделенных разными методами: реагентом Trizol (Qiagen, США) и набором реагентов Проба-НК (ООО «НПФ ДНК-Технология»). В ходе исследования установлено, что гены ТВР и HPRT1 экспрессируют-ся на постоянном уровне во всех образцах периферической крови вне зависимости от группы пациентов (наличия/отсутствия иммунозависимой патологии или трансплантированного органа) и условий эксперимента и дают небольшое среднее квадратичное отклонение (в среднем 0,6) (табл. 1). Следовательно, их можно считать референсной парой, подходящей для проведения клинического исследования.
Аналитические параметры тест-систем. Специфичность. На начальном этапе специфичность тест-системы
Таблица 1
Сравнение уровня экспрессии нормировочных генов в группах пациентов
Группа TBP-HPRT1, M±a
МКПК/выделе- МКПК/выделе-
ние Trizol ние Проба-НК
РНК от условно здоровых 1,4 ± 0,6 1,5 ± 0,6
пациентов
РНК от пациентов с почечным 1,5 ± 0,6 2,8 ± 0,7
трансплантатом
РНК от пациентов с диагнозом ОВИН* 1,2 ± 0,5 1,5 ± 0,6
Примечание. *- ОВИН - общая врожденная иммунная недостаточность.
оценивалась биониформационным методом путём сравнения последовательности разработанных праймеров против базы данных геномных последовательностей GenBank и проверки их на температурную стабильность и температуру отжига с помощью программного обеспечения Oligo 6.0. По результатам первичного анализа ни один из праймеров не обладал достаточной степенью гомологии с геномом человека, для того чтобы привести к синтезу неспецифической мишени на расчётной температуре отжига.
Второй этап включал оценку возможности неспецифического отжига разработанных праймеров на геномную ДНК человека. Изначально при разработке тест-систем возможность неспецифического отжига праймеров ограничивалась дизайном ОТ-праймеров. По возможности в ДНК сразу за праймером находился интрон, к которому разработанные праймеры обладали пониженной специфичностью. В эксперименте специфичность тест-систем подтверждалась на референс-образцах ДНК, выделенных на колонках Mach-erey-Nagel и обработанных ферментом рибонуклеазой (NEB, США) в течение 20 мин при 37°С для разрушения остатков РНК. В результате анализа и в эксперименте на четырёх образцах ДНК установлено, что разработанные системы не дают положительного результата на геномной ДНК человека.
Чувствительность. Аналитическая чувствительность тест-системы - это минимальное количество матрицы в образце, которое может быть определено при использовании данного метода. Оценку аналитической чувствительности проводили путём разведений образца с определённой концентрацией кДНК мишени (определение концентрации проводили с помощью спектрофотометра Nanodrop, Thermofish-
Таблица 2
Аналитические характеристики тест-систем
Ген Аналитическая чувствительность (копий кДНК на реакцию) Коэффициент вариации Cv, % Эффективность амплификации, %
CD28 6,8 18 97-98
CTLA4 3,0 6 95-97
PDL1 24,6 11 95-96
IL1B 3,2 4 97-98
IL2 16,4 12 97-98
IFNG 8,3 2 95-98
TNFA 6,0 6 95-96
HPRT1 4,5 8 95-96
TBP 11,0 14 97-98
er, США), который титровали с шагом в 5 раз. В соответствии с выполненными разведениями определяли концентрацию матрицы, при которой во всех амплификационных пробирках при восьми повторах получен положительный результат. Определённая таким образом концентрация рассматривалась как аналитическая чувствительность метода. Аналитическая чувствительность составила 5-25 копий кДНК на амплифи-кационную пробирку (табл. 2).
Эффективность амплификации. Эффективность амплификации (Е) - величина, характеризующая увеличение количества специфичных продуктов реакции на каждом цикле. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение ДНК, т.е. Е = 2.На практике эффективность амплификации определяется экспериментально по формуле:
Е = 1-(1/slope)
где slope - разница в значениях Cp при 10-кратном разведении образца (коэффициент уравнения линейной зависимости Cp от десятичного логарифма концентрации матрицы).
Е может быть также выражена в процентах по формуле:
Е (%) = (10-(1/s,°pe) - 1) ■ 100% .
Исследование было проведено в серии экспериментов. Для определения эффективности амплификации готовили серии 10-кратных разведений кДНК, проводили амплификацию и получали калибровочные «стандартные» кривые с помощью программного обеспечения DTmaster (ООО «НПФ ДНК-Технология).Эффективность амплификации и для разработанных тест-систем составила 95-98% (см. табл. 2).
Ошибка метода. Ошибку относительной экспрессии генов определяли в пределах одного эксперимента при физиологически нормальной концентрации цитокинов в плазме крови условно здорового пациента [21]. Исследование одного образца было выполнено многократно (n = 10), начиная со стадии выделения лимфоцитов.
Уровень экспрессии мРНК исследуемого гена Х относительно мРНК нормировочного гена N определяли по формуле:
[X]/[N] = EncPn/ExcPx,
где Е№ Ex - эффективности амплификации нормировочного и исследуемого генов;
CpN, CpX - значения пороговых циклов реакции амплификации нормировочного и исследуемого генов.
Для полученных значений уровня экспрессии мРНК ци-токинов определяли коэффициент вариации (Cv). Значения коэффициентов вариации нормированного по гену HPRT1 значения уровня экспрессии цитокинов составили от 2 до 18% (см.табл. 2).
Таким образом, в ходе исследования разработаны и охарактеризованы системы для определения количества мРНК следующих генов иммунной системы: CD28, CTLA4, PDL1, IL1B, IL2, IFNG, TNFA. Дальнейший количественный анализ экспрессии костимуляторных молекул CD28, CTLA4, PD-L1, а также генов цитокинов TNFa, IL1, IL2, IFNy до и после проведения процедуры ЭФХТ позволит установить пути, а также механизмы индукции толерантности к почечному трансплантату при помощи физико-химических методов воздействия на рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток крови.
Заключение. Проведённая работа является первым этапом исследований, запланированных в рамках финансирования по Гранту Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский фонд фундаментальных исследований» и Правительства Московской области, проект № 17-44-500307 р_а. В ходе исследования сформирован перечень генетических мишеней, перспективных при оценке экспрессии ключевых генов, вовлечённых в регуляцию иммунного ответа до и после проведения ЭФХТ; разработаны методы оценки уровня экспрессии транскрипционных маркёров, включённых в исследование; разработаны тест-системы анализа профиля экспрессии генов иммунной системы, ответственных за активацию и ингибирование Т-клеточного ответа; проведена
IMMUNOLOGY
оптимизация параметров реакции ОТ-ПЦР в реальном времени для оценки количества транскриптов генов иммунной системы, включёных в исследование.
В результате апробации тест-систем было установлено, что аналитические параметры разработанных тест-систем позволяют использовать их в дальнейшем при оценке уровня экспрессии генов, включённых в исследование.
Количественный анализ экспрессии костимуляторных молекул CD28, CTLA4, PD-L1, а также генов цитокинов TNFa, IL1, IL2, IFNy до и после проведения процедуры ЭФХТ позволит установить пути, а также механизмы индукции толерантности к почечному трансплантату при помощи физико-химических методов воздействия на рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток крови. Сопряжённое исследование механизмов и клинической эффективности приведёт в результате к определению лабораторных критериев безопасного снижения медикаментозной иммуносупрес-сивной нагрузки, к которому на данный момент стремятся все трансплантологи мира.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование поддержано Грантом Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский фонд фундаментальных исследований» и Правительства Московской области, проект № 17-44-500307р.а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев Л. П., Хаитов Р.М., Долбин А.Г., Болдырева М.Н., Але-сеева П.Л., Трофимов Д.Ю. и др.. Иммуногенетика человека и клиническая трансплантация органов в России. Иммунология. 2015;36(2):76-89.
2. Родионов А.А., Кофиади И.А, Абрамов В.Ю., Алексеев Л.П. Новый метод измерения уровня вкДНК в диагностике криза отторжения трансплантата. Иммунология сегодня: традиции и инновации. 2016:13-4.
4. Кильдюшевский А.В., Федулкина В.А., Фомина О.А., Фомин
А.М. Применение экстракорпоральной фотохимиотерапии при лимфомах кожи и трансплантации солидных органов. Альманах клинической медицины. 2014;30: 61-9.
6. Kusztal M., Koscielska-Kasprzak K., Gdowska W., Zabinska M., Myszka M., Klak R. et al.. Extracorporeal photopheresis as an an-
tirejection prophylaxis in kidney transplant recipients: preliminary results. Transplant. Proc. 2011;43(8):2938-40.
8. Хаитов Р.М., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Иммуногеномика и
генодиагностика человека. Национальное руководство. Кофиади И.А., ред. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2017.
10. Ватазин А.В., Зулькарнаев А.Б., Кильдюшевский А.В. Некоторые механизмы действия экстракорпоральной фотохимиотерапии при трансплантации солидных органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2014;1(XVI):76-84.
11. Федулкина В.А., Ватазин А.В., Кильдюшевский А.В., Ольшанский А.Я., Фаенко А.П. Значение экстракорпоральной фотохимиотерапии в ингибировании процессов отторжения почечного трансплантата. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2016;2(18):46-55.
REFERENCES
1. Alekseev LP, Haitov RM, Dolbin AG, Boldyreva MN, Aleseeva PL, Trofimov DY et al. Human immunogenetics and organ transplant clinics in russia. Immunologiya. 2015;36(2):76-89. (in Russian)
2. Rodionov A.A., Kofiadi I.A., Abramov V.Y., Alekseev L.P. A new method for measuring the level of icDNA in diagnosing of transplant rejection. Immunologiya segodnya: traditsii i innovatsii. 2016:13-4. (in Russian)
3. Adamski J., Kinard T., Ipe T., Cooling L. Extracorporeal photopheresis for the treatment of autoimmune diseases. Transfusion and Apheresis Science. 2015;52:171-82.
4. Kil'djushevskij A.V., Fedulkina V.A., Fomina O.A., Fomin A.M.. Application of extracorporeal photochemotherapy in skin lympho-
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2018; 63(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-178-183
ИММУНОЛОГИЯ
mas and transplantation of solid organs. Al'manah klinicheskoy med-itsiny. 2014;30:61-9. (in Russian)
5. Rummler S., Barz D. Extracorporeal photopheresis - a benifical treatment for cardiac and lung transplant rejection. Transplant international. 2011;24:5.
6. Kusztal M., Koscielska-Kasprzak K., Gdowska W., Zabinska M., Myszka M., Klak R. et al. Extracorporeal photopheresis as an an-tirejection prophylaxis in kidney transplant recipients: preliminary results. TransplantProc. 2011;43(8): 2938-40.
7. Barten M.J., Dieterlen M.T. Extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Immunotherapy. 2014;6(8):927-44.
8. Haitov R.M., Trofimov D.U., Alexeev L.P. Human immunogenom-ics and genodiagnosis. National leadership. [Immunogenomika i gen-odiagnostika cheloveka. Nacionalnoe rukovodstvo]. Kofiadi I.A., ed. Moscow: GEOTAR-Media; 2017. (in Russian)
9. Lamioni A., Parisi F., Isacchi G., Giorda E., Di Cesare S., Landolfo A. et al. The immunological effects of extracorporeal photophere-sis unraveled: induction of tolerogenic dendritic cells in vitro and regulatory T cells in vivo. Transplantation. 2005;79(7):846-50.
10. Vatazin A.V., Zul'karnaev A.B., Kil'djushevskij A.V. Some of the mechanisms of extracorporeal photochemotherapy in solid organ transplantation. Vestnik transplantologii i iskusstvennykh organov. 2014;1(XVI):76-84. (in Russian)
11. Fedulkina V.A., Vatazin A.V., Kildyushevskij A.V., Olshanskij A.Y., Faenko A.P. The value of extracorporeal photochemotherapy in renal transplant rejection inhibition. Vestnik transplantologii i iskusstven-nyh organov.2016;2(18):46-55. (in Russian)
12. Biagi E., Di Biaso I., Leoni V., Gaipa G., Rossi V., Bugarin C. et al. Extracorporeal photochemotherapy is accompanied by increasing levels of circulating CD4+ CD25+ GITR+ Foxp3+ CD62L+ functional regulatory T-cells in patients with graft-versus-host disease. Transplantation. 2007;84(1):31-9.
13. Fife B.T., Bluestone J.A. Control of peripheral T - cell tolerance and autoimmunity via the CTLA - 4 and PD - 1 pathways. Immunological reviews. 2008;224(1):166-82.
14. Dieterlen MT, Bittner HB, Pierzchalski A, Dhein S, Mohr FW, Barten MJ. Immunological monitoring of extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Clinical & Experimental Immunology. 2014;176(1):120-8.
15. Holtick U., Wang X.N., Marshall S.R., Scheid C., von Bergwelt-Baildon M., Dickinson A.M. Immature DC isolated after co-culture with PUVA-treated peripheral blood mononuclear cells downregu-late graft-versus-host reactions in the human skin explant model. Curr. Stem Cell Res. Ther.2013;8(4):324-32.
Поступила 23.10.17 Принята к печати 08.11.17
©коллектив авторов, 2018 УДК 616-008.949-078.33
Бекман Н.И.1, Помелова В.Г.1, Осин Н.С.2
мультиплексный анализ наркотических средств на основе технологии иммуночипов фосфан
1 ФГУП «Государственный НИИ биологического приборостроения» ФМБА РФ, 125424, Москва, Россия;
2 ЗАО «Иммуноскрин», 125424, Москва, Россия
Разработан новый метод мультиплексного количественного анализа наркотических, психотропных средств на основе технологии Фосфан с использованием иммуночипов в формате стандартных 96-луночных планшетов, моноклональных антител к наркотическим соединениям и Pt-копропорфирина в качестве длительно люминесцирующего метчика. Для мультиплексного анализа используется 20 мкл биологической жидкости человека (мочи, сыворотки крови или слюны) или 2 диска диаметром 3,2 мм из высушенного на бумаге пятна мочи. Не требуется предварительная обработка или разведение исследуемой пробы. Продемонстрирован широкий диапазон измеряемых концентраций при высокой чувствительности анализа: 1 нг/мл морфина и метадона, 0,5 нг/мл барбитуратов, 2 нг/мл бензоилэкгонина, метамфетамина, каннабиноидов и бензодиазепинов, 8 нг/мл амфетамина при вариабельности результатов не более 15%. Апробация метода на аттестованных образцах мочи (n = 197) и сывороток крови (n = 98) показала, что метод позволяет правильно определять опиаты, кокаин, каннабиноиды, метадон, бензодиазепины, барбитураты и амфетамины при отсутствии ложноположитеяьныхрезультатов при исследовании образцов, содержащих ненаркотические лекарственные средства. Результаты исследования высушенных на бумаге проб мочи (n = 50) хорошо совпадали с результатами анализа жидких проб для всех исследуемых аналитов. На основе предложенного мультиплексного анализа разработана тест-система Нарк-Фосфан для количественного исследования одновременно до 96 проб различных биологических жидкостей, в том числе в виде высушенных на бумаге пятен. Продемонстрированные высокая чувствительность, специфичность и точность анализа при определении наиболее распространённых наркотических средств позволяют предложить его в качестве первичного теста при массовых обследованиях населения для выявления наркомании, особенно на ранней стадии.
Ключевые слова: Фосфан; мультиплексный анализ; биочипы; наркотики; морфин; кокаин; каннабиноиды; амфетамины; бензодиазепины; барбитураты. Для цитирования: Бекман Н.И., Помелова В.Г, Осин Н.С. Мультиплексный анализ наркотических средств на основе технологии иммуночипов Фосфан. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63 (3): 178-183. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-178-183 BekmanN.I.1, Pomelova V.G.1, OsinN.S.2
THE MULTIPLEX ANALYSIS OF DRUG MEDICINALS ON THE BASIS OF TECHNOLOGY OF IMMUNOCHIPS PHOSPHAN
1The Federal State Unitary Institution "The State Research Institute of Biological Instrument-Making Industry" of the Federal Medical Biological Agency of Russia, 125424, Moscow, Russia 2The Closed Corporation "Immunoskrin" 125424, Moscow, Russia
Для корреспонденции: Бекман Наталья Игоревна, канд. хим. наук, ст.науч. сотр. лаборатории молекулярных методов диагностики инфекционных и соматических заболеваний ; e-mail: nibeckman@mail.ru
