РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИН С ПРИМЕНЕНИЕМ ИФА Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИН

С ПРИМЕНЕНИЕМ ИФА

Доронин Максим Игоревич

кандидат биол. наук, докторант ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

г. Владимир

DEVELOPMENT OF A TEST SYSTEM FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF RABIES VIRUS RIBONUCLEOPROTEIN IN RAW MATERIALS FOR VACCINES USING ELISA

Doronin Maksim Igorevich

candidate of Biological Sciences, doctoral student Federal State Budgetary Institution "Federal Center for Animal Health Protection",

Vladimir

АННОТАЦИЯ

Цель статьи - разработать тест-систему для определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением ИФА. Применяли методы конъюгирования иммуноглобулина G с пероксидазой хрена, проводили прямой вариант ИФА, определяли диагностические возможности тест-системы. В результате создана тест-система для определения концентрации аналита в сырье для вакцин, выявлена математическая модель между экстинкцией в ИФА и концентрацией рибонуклеопротеина, доказаны высокая диагностическая точность разработанной тест-системы.

ABSTRACT

The purpose of the article is to develop a test system for determining the concentration of rabies virus ribonucleoprotein in raw materials for vaccines using ELISA. Methods of conjugation of immunoglobulin G with horseradish peroxidase were used, a direct variant of ELISA was performed, and diagnostic capabilities of the test system were determined. As a result, a test system was created to determine the concentration of analyte in raw materials for vaccines, a mathematical model was revealed between the extinction in ELISA and the concentration of ribonucleoprotein, and the high diagnostic accuracy of the developed test system was proved.

Ключевые слова: вирус бешенства; концентрация рибонуклеопротеина; ИФА.

Keywords: rabies virus; ribonucleoprotein concentration; ELISA.

Бешенство - вирусное, смертельно опасное заболевание человека и животных, поражает центральную и периферическую нервную систему, вызывает энцефаломиелиты [2, с. 16]. Данная инфекция приводит к значительным экономическим потерям, которые связаны с гибелью животных, ликвидацией последствий вспышек заболевания, проведением

профилактических и карантинных мероприятий, регулированием численности диких плотоядных животных, отловом бродячих кошек и собак, осуществлением лабораторных исследований по постановке диагноза. Система мер для борьбы с бешенством и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних, сельскохозяйственных и диких плотоядных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [5, с. 579].

В процессе производства антирабических вакцин вируссодержащее сырье исследуют на определение концентрации важного

иммуногенного компонента - рибонуклеопротеина вируса бешенства. Традиционно для определения данного компонента применяют

колориметрический метод

М. Брэдфорда [4, с. 251]. Существенными недостатками метода М. Брэдфорда являются невысокая аналитическая чувствительность анализа (не менее 2 мкг/мл) и невысокая специфичность.

Исходя из этого актуально применить ИФА как серологический метод исследования для определения концентрации аналита в сырье для вакцин.

Цель исследования - разработка тест-системы для определения концентрации

рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением ИФА.

Получение антирабического конъюгата морской свинки. Для изготовления антирабического пероксидазного коньюгата применяют поликлональные антирабические антитела морской свинки. 2 мг пероксидазы хрена (акт. 250 ед/мг) растворяют в 0,5 мл воды. Проводят активирование пероксидазы хрена периодатом натрия (№Ю4). К раствору пероксидазы хрена добавляют 100 мкл свежеприготовленного раствора периодата натрия и инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Окраска должна измениться с оранжевой на зеленую. Фильтруют

полученный раствор через небольшую колонку с сефадекс G-10, насыщенную 0,0001 М ацетатным буферным раствором (рН 4,0). Окрашенные фракции собирают. Проводят измерение оптической плотности при 280 и 403 нм. Высокоочищенная пероксидаза хрена имеет показатель RZ (OD28o/OD4oз) около 3 [3, с. 105].

Проводят конъюгирование иммуноглобулина G с активированной пероксидазой хрена. Значение рН раствора очищенной активированной пероксидазы хрена доводят с помощью 0,2 М раствора КББ до 9,0-9,5. Сразу добавляют ^ G, разведенные до 4-5 мг в 0,5 мл 0,01 М КББ (рН 9,5), и инкубируют при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре 22±2°С. Соотношение белковой составляющей и пероксидазы хрена: ~ 2/1. Добавляют 50 мкл свежеприготовленного раствора борогибрида натрия (4 мг/мл) (NaBH4). Инкубируют еще 2 ч при температуре 4±2°С, периодически помешивая.

Проводят очистку полученного конъюгата диализом в течение 18 ч при температуре 4±2°С против ФСБ. Фракционируют смесь гель-фильтрацией на колонке с сефарозой (СЬ-6В) в

ФСБ. Для полученной фракции измеряют оптическую плотность при длинах волны 280 и 403 нм. По итогам спектрометрического анализа показатель RZ (OD280/OD403) должен быть не ниже 0,4. Собирают фракции первого пика, которые имеют совпадения по OD280 и OD403, добавляют глицерин в соотношении 1/1 [3, с. 87].

В соответствии с методикой, представленной в разделе «Материалы и методы», получили раствор конъюгата морской свинки в объеме 3 мл, который подвергали стерилизационной фильтрации с помощью фильтров с диаметром пор 0,22 мкм («Minisart Sartorius»). К полученному раствору добавляли 3 мл глицерина, перемешали и хранили при температуре минус 20°С. Определяли рабочее разведение в ИФА полученного конъюгата. Для этого в прямом варианте ИФА тестировали конъюгат в разведениях 1/500, 1/1000, 1/1500, 1/2000, 1/2500, 1/3000. Анализ проводили в соответствии с методикой, отраженной в разделе «Материалы и методы» в трех повторностях. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты титрования антирабического конъюгата морской свинки в ИФА (n=3, p<0,005)

Разведение конъюгата Значение экстинкции, о.е.

положительный контроль отрицательный контроль

1/500 2,664±0,120 0,175±0,090

1/1000 2,462±0,142 0,112±0,025

1/1500 2,323±0,102 0,075±0,011

1/2000 1,845±0,120 0,065±0,014

1/2500 1,779±0,124 0,062±0,010

1/3000 1,685±0,119 0,058±0,009

Из данных, указанных в таблице 1, видно, что значение экстинкции выше 2,100 о.е. отмечали при разведениях конъюгата 1/500, 1/1000, 1/1500. Из них оптимальным являлось разведение 1/1500, поскольку в данном случае значение оптической плотности для отрицательного контроля составляло 0,085 о.е. (<0,100 о.е.), для положительного контроля - 2,323 о.е. (>2,100 о.е.).

Определение разведения антирабического конъюгата морской свинки. Для этого в качестве показателей используют значения оптических плотностей для положительного и отрицательного контрольных препаратов. Положительным контролем служит лиофильно высушенная культуральная суспензия, содержащая рибонуклеопротеин вируса бешенства, а в качестве отрицательного контроля - лиофильно высушенная культуральная суспензия, не содержащая антигена вируса бешенства. В лунки планшета вносят улавливающие антитела, разведенные с помощью КББ до концентрации 5 мкг/мл и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 4±0,5°С. Лунки планшета отмывают промывочным буферным раствором ТБСТ 3 раза. В лунки шести вертикальных рядов вносят контрольные препараты (три ряда - положительный контроль и три - отрицательный). Контрольные препараты

перед использованием центрифугируют при 1000 g в течение 15 минут. Инкубирование проводят 1 ч при температуре 37±0,2°С и отмывают промывочным буферным раствором ТБСТ 3 раза. В лунки горизонтальных рядов А-Р вносят антирабический пероксидазный конъюгат в разведениях 1/500, 1/1000, 1/1500, 1/2000, 1/2500, 1/3000, соответственно, на промывочном буферном растворе ТБСТ, с добавлением сыворотки неиммунизированной лошади до концентрации 5%. Данную сыворотку перед применением центрифугируют при 4000 g в течение 10 минут. Планшеты с содержимым инкубируют 1 ч при температуре 37±0,2°С, промывают с помощью ТБСТ 3 раза и вносят субстрат-хроматогенную смесь. Хромогеном служит ортофенилендиамин (ОФД). Инкубирование проводят 20 минут при комнатной температуре без доступа света. Остановку реакции осуществляют с помощью 3 N раствора серной кислоты. Учитывают реакцию с использованием сканирующего спектрофотометра-ридера при длине волны 492 нм. Рабочим разведением пероксидазного конъюгата морской свинки считают наибольшее разведение, при котором среднее значение экстикции положительного контроля находится выше 2,1 о.е. Среднее значение оптической плотности

отрицательного контроля данного разведения конъюгата не должно превышать 0,1 о.е.

Выявление существования математической модели зависимости концентрации

рибонуклеопротеина вируса бешенства от оптического сигнала в ИФА. В лунки планшета вносят улавливающие антитела, разведенные с помощью КББ до концентрации 5 мкг/мл и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 4,0±0,5°С. Лунки планшета отмывают промывочным буферным раствором ТБСТ 3 раза. В лунки вертикальных рядов № 1-8 вносят контрольные препараты (6 горизонтальных рядов: A-F) с известными концентрациями рибонуклепротеина вируса бешенства.

Контрольные препараты перед использованием центрифугируют при 1000 g в течение 15 минут. Во все лунки горизонтального ряда H вносят положительный контроль, содержащий 1,0 мкг/мл аналита. Во все лунки горизонтального ряда G вносят отрицательный контроль. Инкубирование проводят 1 ч при температуре 37±0,2°С и отмывают промывочным буферным раствором ТБСТ 3 раза. Во все лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в разведении 1/1500 на промывочном буферном растворе ТБСТ, с добавлением сыворотки неиммунизированной лошади до концентрации 5%. Данную сыворотку перед применением центрифугируют при 4000 g в течение 10 минут. Планшеты с содержимым

инкубируют 1 ч при температруе 37±0,2°С, промывают с помощью ТБСТ 3 раза и вносят субстрат-хроматогенную смесь. Инкубирование проводят 20 минут при комнатной температуре без доступа света. Остановку реакции осуществляют с помощью 3 N раствора серной кислоты. Учитывают реакцию с использованием сканирующего спектрофотометра-ридера при длине волны 492 нм. Для положительного контроля значение оптической плотности должно превышать 2,100 о.е., для отрицательного контроля должно быть ниже 0,1 о.е. Образец считают положительным, если для него среднее значение оптической плотности составляет более 2,1 о.е., отрицательным - при значении экстинкции менее 0,1 о.е. Определяют значения экстинкции для анализируемых образцов и контролей.

Проводили прямой вариант ИФА с использованием стандартных образцов очищенного рибонуклеопротеина вируса бешенства со следующими концентрациями: 0,015; 0,025; 0,050; 0,100; 0,500; 1,000; 1,500 мкг/мл. По результатам анализа оптическая плотность отрицательного контроля составляла 0,076±0,082, следовательно, отрицательными являлись образцы со значением экстинции ниже 0,176. Зависимость значений оптической плотности пробы от концентрации рибонуклеопротеина представлена в таблице 2 на рисунке.

Таблица 2

Экстинкция проб в прямом варианте ИФА для определения концентрации рибонуклеопротеина

Концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства, мкг/мл Значения оптической плотности, о.е.

1 2 3 М±т

0,015 0,185 0,178 0,192 0,185±0,007

0,025 0,214 0,202 0,209 0,208±0,006

0,050 0,249 0,256 0,255 0,253±0,004

0,100 0,301 0,227 0,285 0,271±0,039

0,500 0,502 0,519 0,512 0,511±0,009

1,000 1,257 1,244 1,269 1,257±0,013

1,500 2,788 2,796 2,763 2,782±0,017

о

л н и

0

1

н о

ч а

к

«

ы

и <и Т Я н а О

-0,5

3,5 —3 2,5 —2 1,5 —1 0,5

0 -0,5

0

ОП = 0,2145e1,7304< R2 = 0,9898 -РНП ВБ 1-А

1- -1

^пР-1

1

1,5

Концентрация рибонуклеопротеина вируса бешенства, мкг/мл

А

2

2

1,5 Срнп be = 0,56281n(011) R2 = 0,9963 + 0,9792

0,5 i—

0 ,5 1 5 2 5 3,

Оптическая плотность в ИФА, о.е.

Б

Рисунок - Математическая модель зависимости экстинкции в прямом варианте ИФА и концентрации рибонуклепротеина вируса бешенства (РНП ВБ). Примечание: А - экспонециальная зависимость, Б - логарифмическая зависимость (п=3, р<0,005).

Из полученных данных видно, что существует для полученной тест-системы в прямом варианте ИФА логарифмическая модель:

Срнп вб = 0,5628* 1п(ОП) + 0,8963,

где Срнп вб - концентрация рибонуклеопротеина вируса бешенства (мкг/мл), ОП - оптическая плотность (о.е.). Достоверность аппроксимации составила 0,9963 (^-1,0000).

Определение диагностических показателей тест-системы определения концентрации рибонуклеопротеина виурса бешенства в прямом варианте ИФА. Для данной тест-системы определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в прямом варианте ИФА рассчитывали следующие диагностические показатели: диагностическую чувствительность (DSe), диагностическую специфичность (DSp), ^ критерий (индекс Каппа Коэна), прогностичность положительного результата (PPV),

прогностичность отрицательного результата (№У), диагностическую точность (DAc) [1, с. 103]. Для определения чувствительности исследовали 110 положительных образцов суспензий, содержащих РНП вируса бешенства с концентрациями от 0,1 до 1,5 мкг/мл. Постановку анализа проводили, как отражено выше. При интерпретации результатов исследования положительными считали пробы, которые содержат рибонуклеопротеин вируса бешенства, отрицательными - пробы, в которых данный компонент отсутствует. В результате в ИФА определили, что из 110 положительных образцов суспензий 109 определены в качестве положительных, а 1 - в качестве отрицательных. Для исследования специфичности тест-системы анализировали 110 образцов суспензий клеточной линии ВНК-21, которые не содержали антиген вируса бешенства. В результате исследования определили, что из 110 отрицательных суспензий

все 110 определены в качестве отрицательных. Иными словами, количество истинно положительных проб (а) - 110, количество ложноотрицательных (b) - 1, количество ложноположительных проб (с) - 0, количество истинно отрицательных (d) - 110.

Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) метода составила 99,10% (в 95%-ном доверительном интервале: 95,08-99,98%), диагностическая специфичность (DSp) - 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 96,70-100%), k-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,991, прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (OTV) - 99,10% (в 95%-ном доверительном интервале: 93,99-99,87%), диагностическая точность (DAc) - 99,55% (в 95%-ном доверительном интервале: 97,50-99,99%).

Список литературы

1. Андрерс Альбом, Стефан Норрел. Введение в современную эпидемиологию / Мати Раху; пер. с англ. И. Боня - Таллин: Ин-т эксперим. и клин. медицины (Эстония), Дат. противорак. о-во., 1996. -122 с.

2. Груздев К.Н., Метлин А.Е. Бешенство животных. - Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. -394 с.

3. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика иммуноферментного анализа -М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. -P. 248-254.

5. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 3.1.17. -P. 578-612.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КАК ОСНОВА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ВОЗДЕЙСТВИЯ ЖЕЛЕЗНОДОРОЖНОГО ТРАНСПОРТА НА КАЧЕСТВО

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Сосков Александр Викторович

Аспирант

Калужский государственный университет им. К.Э.Циолковского

г. Калуга

BIOLOGICAL RESEARCH AS A BASIS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING OF THE IMPACT OF RAIL TRANSPORT ON ENVIRONMENTAL QUALITY

Soskov Alexander Viktorovich

Graduate student

Kaluga State University named after K.E. Tsiolkovsky

Kaluga

DOI: 10.31618/nas.2413-5291.2021.3.72.487

АННОТАЦИЯ

Экологический мониторинг (ЭМ) является одной из составляющих частей системы управления охраной окружающей среды на Российских железных дорогах. Он заключается в получении аналитической информации о составе и свойствах загрязнения отраслевыми объектами, сравнении с установленными нормативами и передаче данной информации в базу данных для принятия управленческих решений.[1]

Цель: изучение биологических исследований как основа экологического мониторинга воздействия железнодорожного транспорта на качество окружающей среды

Методы: литературный обзор

Выводы: с помощью биологических исследований и новейших экоинформационных систем возможна более полная и качественная оценка состояния окружающей среды железных дорог Российской Федерации.

ABSTRACT

Environmental monitoring (EM) is one of the components of the environmental management system on Russian Railways. It consists in obtaining analytical information about the composition and properties of pollution by industrial facilities, comparing it with established standards and transferring this information to a database for management decision-making.[1]

Ключевые слова: экологический мониторинг; биологические исследования; экоаналитические лаборатории; экоинформационные системы.

Keywords: environmental monitoring; biological research; eco-analytical laboratories; eco-information systems.

В настоящее время ЭМ на железнодорожном транспорте осуществляется:

• производственными экологическими лабораториями (отделенческими);

• передвижными экологическими лабораториями (экологическими вагонами-лабораториями и лабораториями на автомобильном ходу);

• пунктами экологического контроля (ПЭК) тепловозов и путевой техники.[3]

ЭМ Российский железных дорог имеет свои преимущества:

> эффективно и рационально используются дорогостоящее оборудование приборы и специфические реактивы

> имеются высококвалифицированные специалисты.

При такой схеме существенно снижаются капитальные и эксплуатационные затраты на обеспечение экологического контроля и

мониторинга. Следует отметить, что основной проблемой является недостаточная оснащенность лабораторий площадями и современной лабораторной, компьютерной техникой и экоинформационными технологиями. [2]

В последнее время весьма перспективными становятся биологические методы экологического мониторинга, которые дают нам прямую информацию о реакции организмов на стрессорные факторы. Это достаточно эффективный метод мониторинга окружающей среды, основанный на исследовании воздействия изменяющихся экологических факторов на различные характеристики биологических объектов и систем. Биологический метод оценки состояния системы позволяет решить задачи, разрешение которых с помощью физических и химических методов невозможно. Рекогносцировочная оценка степени загрязнения по составу бионтов позволяет быстро установить его санитарное состояние, определить