CC BY
59
УДК 619:616.98:579.843.95:639.3.091
Ключевые слова: иммуноферментный анализ, болезни лососевых рыб, лабораторная диагностика, инфекционный некроз поджелудочной железы лососёвых, инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых, вирусная геморрагическая септицемия
Key words: enzyme immunoassay (ELISA), disease of salmon, laboratory diagnosis, salmon infectious pancreatic necrosis (IPN), salmon infectious hematopoietic necrosis (IHN), viral haemorrhagic septicaemia (VHS)
Завьялова Е. А., Карпова М. А., Дрошнев А. Е.
ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
SOLID PHASE ELISA TEST FOR DIAGNOSTICS OF VIRAL DISEASES OF SALMON FISHES
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко» Адрес: 109428, Россия, Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1
Russian Research Institute of Experimental Veterinary and Medicine named after Y. R. Kovalenko,
Federal Agency for Scientific Organizations Address: 109428, Russia, Moscow, Rjazanskij pr., 24, h.1
Завьялова Елена Александровна, к. б. н., зав. лабораторией. E-mail: aquazeda@mail.ru. Тел. (495) 995-88-61
Zavyalova Elena А., PhD in Biological Sciences, Head of the Laboratory. E-mail: aquazeda@mail.ru. Tel. +7 (495) 995-88-61
Карпова Марианна Алексеевна, мл. науч. сотрудник
Karpova Marianna A., Junior Researcher
Дрошнев Алексей Евгеньевич, к. б. н., ведущий науч. сотрудник. E-mail: asdf1961@mail.ru
Droshnev Aleksey E., PhD in Biological Sciences, Leading Researcher. E-mail: asdf1961@mail.ru
Аннотация. Разработан диагностический набор и способ, позволяющий в течение трёх часов с достоверностью 98 % определять в образцах биологического материала наличие возбудителей вирусных болезней лососевых рыб. В один планшет можно разместить от двух образцов биоматериала в трёх повторениях до 24-х образцов без повторений. Планшет может быть использован весь одновременно или в четыре приёма, для чего использованные ранее ряды высушивают промывателем и заклеивают пленкой или просто помечают маркером. Диагностикум можно использовать в системе мониторинга, проводимого органами ветеринарной службы страны, что позволит контролировать распространение вирусных болезней рыб и сохранить здоровье культивируемых рыб, а также в научных исследованиях для тестирования существующих и новых клеточных линий, в селекционно-племенной работе, для получения информации о закономерностях циркуляции вирусов-возбудителей IPN, IHN и VHS в аквакультуре России и в диких популяциях рыб. Summary. The diagnostic set and method were developed, and they allow to determine agents of viral diseases of salmon fishes in samples of biological material with the authenticity of 98 % during three hours. Two samples of biological material can be placed in one tablet in three frequencies up to 24 samples without doubling. The tablet can be used simultaneously as whole or in 4 stages, for this purpose ranges, and for this early used ranks can be dried with the washer and sealed with a film or marked. The diagnostic can be used monitoring system that carried out by veterinary authorities of the country, and this will allows to control the spreading of viral diseases of fishes and to preserve the health of cultivated fishes, as well as in the scientific researches for testing of existing and new cell lines, in the stock breeding, to obtain the information on common factors of the circulation of such agent viruses as IPN, IHN and VHS in the aquaculture of Russia and wildlife populations of fishes.
Введение
Сельское хозяйство - неотъемлемая часть всей экономики страны, которая обеспечивает сырьем предприятия лёгкой промышленности, а также является главным источником продовольствия. В условиях действующих санкций и обеспечения продовольственной безопасности страны роль сельского хозяйства в современной экономике постоянно возрастает, одной из важнейших отраслей
является аквакультура. По данным ФАО, в общемировом объёме пищевой рыбы на долю выращиваемых биообъектов приходится почти половина, при этом ежегодно увеличивается объём рыбоводной продукции. В связи с этим, в процессе культивирования гидробионтов особенно актуальна борьба с инфекционными болезнями. Разнообразие заболеваний оборачивается серьезными экономическими и экологическими проблема-
ми для народного хозяйства. Одна из существенных проблем, сдерживающих развитие отечественной акваиндустрии - вирусные болезни выращиваемых гидробионтов, такие как инфекционный некроз поджелудочной железы лососевых (Infectious pancreatic necrosis, IPN), инфекционный некроз гемо-поэтической ткани лососевых (Infectious hematopoietic necrosis, IHN), вирусная геморрагическая септицемия (Viral haemorrhagic septicaemia, VHS) [9, 2].
Сейчас, согласно действующей нормативной документации, диагностика вирусных болезней рыб требует культивирования вируса на клетках, что занимает достаточно длительное время и выполняется только в крупных научно-исследовательских институтах, имеющих профильные лаборатории. Этот метод долгий, а результат анализа напрямую зависит от таких факторов, как опыт и компетенция специалиста, проводящего работу, физиологического состояния и биологических особенностей используемой линии клеток, поэтому применение современных методов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), будет, несомненно, востребовано при диагностике [7, 6, 5]. В отечественной литературе встречаются единичные сообщения об использовании некоторых иммунологических методов в диагностике вирусных болезней рыб [10, 1], однако до настоящего времени широкого распространения они всё же не получили, что может негативно сказываться на качестве ежегодно проводимого мониторинга.
Цель исследований - разработка чувствительного и эффективного способа серодиагностики вирусных болезней лососевых рыб: инфекционного некроза поджелудочной железы (IPN), инфекционного некроза гемопо-этической ткани (IHN), вирусной геморрагической септицемии (VHS) и значительное сокращение времени на постановку диагноза за счёт одновременного исследования образцов биоматериала на три заболевания.
Сведения по использованию комбинированного ИФА и существованию диагностических наборов для выявления вирусных болезней рыб в аналогичном формате в современной литературе отсутствуют. В осно-
ву разработки были положены сведения, полученные ранее сотрудниками лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ при создании диа-гностикумов на основе ИФА для некоторых бактериальных и вирусных инфекций рыб [4, 3]. Однако реальным прототипом является запатентованный способ единовременной серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота - методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронави-русного энтеритов, разработанный в лаборатории желудочно-кишечных болезней КРС ФГБНУ ВИЭВ [8].
Материалы и методы
Вирусы и клетки. В работе использовали очищенные и концентрированные антигены: ГРМУ штамм N07-1, выращенный на культуре клеток гонады радужной форели OMG (Патент РФ №2495120); ГНМУ штамм №К-11- на культуре клеток FHM; "УНБУ штамм S7/10 - на культуре клеток эпителиальной папилломы карпов ЕРС (ЕСАСС №«93120820)
Животные. Для получения гипериммунных сывороток к изучаемым антигенам использовали кроликов в возрасте 8-10 месяцев, массой 3-3,5 кг, иммунизацию проводили на опытной базе - Вышневолоцкий филиал ВИЭВ (о. Лисий).
Антитела для сенсибилизации планшетов (антигенсвязывающие) и антигендетектиру-ющие вирусоспецифические кроличьи антитела против ГРМУ, ГШУ, УШУ были получены по разработанным ранее методикам.
Неспецифические компоненты: субстрат -ТМБ (тетраметилбензидин), «стоп-раствор» -2М серная кислота, отмывочный буфер ФСБ-Т (фосфатно-солевой буфер с твином рН 7.4-7.6).
Выделение IgG из иммунных сывороток проводили путём высаливания раствором сернокислого аммония с последующей гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе с измерением концентрации белка.
Конъюгат специфических антител. Конъ-югирование фермента с иммуноглобулинами проводили ковалентным способом, для введения фермента в молекулы антител ис-
пользовали перйодат натрия по методике Wilson и Nakane. В качестве ферментативной метки использовалась пероксидаза хрена (ПХ) RZ>3,1.
Результаты исследований
При диагностике вирусных инфекций лососевых рыб важна оперативная информация, во время эпизоотии необходимо анализировать наличие в организме рыб антигена возбудителя для своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий.
Использование диагностического набора, включающего все необходимые компоненты для проведения иммуноферментного анализа, позволит выявлять антигены IPN, IHN и VHS одновременно в образцах биологического материала от рыб на ранней стадии развития болезни с высокой специфичностью и чувствительностью. Принцип работы тест-системы заключается в следующем: специфические иммуноглобулины к вирусам-возбудителям IPN, IHN и VHS, иммобилизованные на поверхности лунок одного полистиролового микропланшета, связываются с гомологичными антигенами, если они присутствуют в исследуемом материале, образуя комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется путём взаимодействия с иммуноферментным конъ-югатом, фермент которого после добавления субстрата вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. Интенсивность окраски в лунке микропланшета пропорциональна содержанию специфического антигена в испытуемом образце, результаты учитывают по общепринятой формуле.
Диагностический набор для выявления вирусов-возбудителей IPN, IHN и VHS содержит: планшет полистироловый 96-луноч-ный, сенсибилизированный иммуноглобулинами к IPN, IHN и VHS; положительный контрольный образец IPN, инактивирован-ный (IPN К+); положительный контрольный образец IHN, инактивированный (IHN К+); положительный контрольный образец VHS, инактивированный (VHS К+); отрицательный контрольный образец, инактивирован-
ный (К-); конъюгат 1, представляющий собой анти-IPN антитела, меченные пероксидазой хрена; конъюгат 2, представляющий собой анти-IHN антитела, меченные пероксидазой хрена; конъюгат 3, представляющий собой анти-VHS антитела, меченные пероксида-зой хрена; раствор для разведения конъюгата (РК); промыватель - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином-80 (ФСБ-Тх25); субстрат - раствор тетраметил-бензидина (ТМБ); стоп-реагент; ванночка для реагентов. Компоненты набора расфасованы в пластиковые флаконы разного объёма с завинчивающимися крышками и упакованы в коробки.
Работа проводится в 4 этапа.
1. Подготовка исследуемого материала. Для обнаружения антигенов IPN, IHN и VHS в качестве испытуемого используют биопсийный материал внутренних органов (почка, печень, селезенка), экссудат и/или вируссодержащую надосадочную жидкость культур клеток. Для получения 10 % суспензии биоматериал гомогенизируют до получения однородной массы на ФСБ (рН=7,2-7,4), полученную суспензию используют для исследования.
2. Подготовка компонентов для постановки реакции. Для промывания планшетов при постановке реакции готовят содержащий твин-80 фосфатно-солевой буфер: размешивают содержимое флакона с ФСБ-Т*25, при выпадении в концентрате осадка прогревают его до полного растворения солей и разводят дистиллированной водой до 700мл. Хранят при 4°С до 5-ти суток.
Растворы конъюгатов 1, 2, 3 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием, к 0,05 мл концентрированного раствора добавляют 15 мл раствора для разведения конъюгата (РК), тщательно перемешивают.
Раствор ТМБ готов к применению, непосредственно перед использованием отбирают в пластиковую ванночку 12 мл. Остатки раствора ТМБ из ванночки нельзя сливать во флакон с исходным раствором ТМБ. Хранят при 4°С в течение всего срока годности набора.
3. Постановка реакции. Перед началом анализа лунки планшета промывают один
раз промывочным раствором. В каждую лунку вносят по 300 мкл раствора, через пять минут после заполнения лунок раствор аккуратно удаляют. Остатки влаги из лунок тщательно удаляют, постукивая перевёрнутым планшетом по фильтровальной бумаге.
В первые лунки рядов планшета, сенсибилизированных иммуноглобулинами к IPN, IHN и VHS, вносят по 100 мкл специфических положительных антигенов (IPN К+, IHN К+, VHS К+). Во вторые лунки каждого ряда вносят 100 мкл отрицательного антигена. Во все остальные лунки - по 100 мкл исследуемых образцов (желательно делать 2-3 повторения). Лунки на планшете сенсибилизированы следующим образом: иммуноглобулинами к IPN (1, 4, 7, 10 ряды), IHN (2,5,8,11 ряды), VHS (3, 6, 9, 12 ряды). Внесение материала в плашку сопровождают тщательным перемешиванием и пипетирова-нием в течение 5-7 секунд. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°С) 60 минут.
Растворы конъюгатов № 1, 2, 3 в рабочем разведении готовят за 5-10 минут до окончания инкубации.
По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т от несвязавшихся антигенов, после чего удаляют влагу, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.
В лунки рядов 1, 4, 7, 10 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата-1 (IPN) в рабочем разведении. В лунки рядов 2, 5, 8, 11 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата-2 (IHN) в рабочем разведении. В лунки рядов 3, 6, 9, 12 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата-3 (VHS) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°С) 60 минут. По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т, после чего удаляют влагу постукиванием.
Во все использованные лунки планшета вносят по 100 мкл раствора ТМБ. Для внесения раствора ТМБ используют пластиковую ванночку, входящую в состав набора. Планшет инкубируют при комнатной температуре, в защищённом от света месте, 25-30 минут.
Реакцию заканчивают добавлением во все лунки 100 мкл стоп-реагента.
4. Учёт результатов. Результаты реакции учитывают через 2-3 минуты после добавления стоп-реагента, проводя измерение оптической плотности (ОП) в каждой лунке на спектрофотометре с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм или визуально. Результаты исследований учитывают только при соблюдении следующих условий:
- значение ОП в лунке с отрицательным контролем не более 0,30 о.е.;
- значение ОП в лунке с положительным контролем не менее 0,62 о.е.
Реакцию оценивают по формуле и выражают в виде процента реактивности:
процент реактивности (%) = (ОП - ОПК-)/ (ОПК+ - ОПК-) х 100 %,
где ОП - оптическая плотность образца; ОПК+ - оптическая плотность положительного контроля; ОПК- - оптическая плотность отрицательного контроля.
Границы пороговых значений: при величине %>22 % реакция считается положительной, значение %<10 % - реакция отрицательная, а диапазон % от 10 % до 22 % -сомнительные результаты реакции.
Выводы
1. Предложенный способ и набор позволяют в течение трёх часов с достоверностью 98 % определять в образцах биологического материала наличие возбудителей наиболее распространённых вирусных болезней лососевых рыб. Формат исследования допускает использование «холодной инкубации» (в течение 4-6 часов при температуре 4оС, в холодильнике), что позволяет получать достоверные, аналогичные результаты в течение одного дня, с перерывом для оператора в ходе работы, что по разным причинам может быть удобно.
2. В один планшет можно разместить от двух образцов биоматериала в трёх по-вторностях до 24 образцов без повторений. Планшет может быть использован весь одновременно или в четыре приема, для чего использованные ранее ряды высушивают промывателем и заклеивают пленкой либо маркируют.
3. Диагностикум можно использовать в системе мониторинга, проводимого органами ветеринарной службы страны, что позволит контролировать распространение вирусных болезней рыб и сохранить здоровье культивируемых рыб, а также в научных исследованиях для тестирования существующих и новых клеточных линий, в селекционно-племенной работе, для получения информации о закономерностях циркуляции вирусов-возбудителей IPN, IHN и VHS в аквакультуре России и диких популяциях рыб.
Список литературы
1. Доронин, М. И. Выявление антигенов вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб с помощью метода латекс-агглютинации [Текст] / М. И. Доронин, В. А Пыльнов., Н. А. Назаров, С. С. Рыбаков // Ветеринария. - 2014. - № 9. -С. 56-61.
2. Завьялова, Е. А. Выделение возбудителя вирусной геморрагической септицемии лососевых от рыб в естественных водоемах [Текст] / Е. А. Завьялова, А. Е. Дрошнев, Н. Ю. Кандрина, Н. Р. Калинина // В сборнике международной науч.-практич. конф. «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел». - 2011. - С. 75-77.
3. Завьялова, Е. А. Новый метод диагностики йерси-ниоза лососевых рыб на основе иммуноферментного анализа (ИФА) [Текст] / Е. А. Завьялова, А. Е Дрошнев., М. А. Карпова, П. Д. Богданова // Сборник материалов 4-й Международной конф. «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов», г. Борок. - 2015. - С. 144-149.
4. Завьялова, Е. А. Разработка тест-системы для выявления вируса возбудителя инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (ГРМУ) им-муноферментным методом [Текст] / Е. А. Завьялова, А. Е. Дрошнев, М. А. Карпова, М. И. Гулюкин // Материалы международной науч.-практич. конф. «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК», Щелково. - 2012. - С. 165-171.
5. Инструкция о мероприятиях по борьбе с вирусной геморрагической септицемией рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро. - 1998. - С. 105-113.
6. Инструкция о мероприятиях по профилактике и борьбе с инфекционным некрозом гемопоэтической ткани лососевых рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро. - 1998. - С. 87-95.
7. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро. - 1998. - С. 96-104.
8. Патент № 2472162 Способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментно-го анализа.
9. Пичугина, Т. Д. Выделение вируса инфекционного некроза поджелудочной железы [Текст] / Т. Д. Пичугина, Е. А. Завьялова, М. Н. Борисова, Л. П. Дьяконов, Г. А. Надточей, А. Ф. Шуляк // Ветеринария. -2005. - № 1. - С. 31-32.
10. Прокаева, И. Б. Разработка непрямого варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) для диагностики герпесвирусной болезни сибирского осетра [Текст] / И. Б. Прокаева, И. С. Щелкунов // В сборнике «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». - 2012. - Т. 1. - С. 307-314.
форум
последние новости подборка статей справочники
каталог лекарственных средств адреса ветклиник и зоомагазинов информация о выставках и конференциях анонсы ветеринарных журналов
Заходите на www.veterinar.ru, и Вы найдёте много интересной и полезной информации!
Приглашаем к сотрудничеству ветеринарных врачей и организации, e-mail: invetiSinbox.ru boldvrevatamail.ru тел.: 8 (gog) 646-76-43, 8 (gi6) 181^5-58
