CC BY
69
Заключение
В лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ для научно-исследовательской работы используют субкультуры клеток гонад карася и форели, сердца и селезенки форели, эмбрионов гуппи, а также клеточные линии СНН-1, СН5Е-214 и ЕРС. Эти культуры пригодны для диагностики экономически значимых вирусных болезни! рыб: весенней виремии карпа, инфекционного некроза гемопоэтической ткани и инфекционного некроза поджелудочной железы.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Дьяконов Л.П., Ситьков В.И. (ред.). Животная клетка в культуре-М, 2000, с. 148— 159.
2. Завьялова Е.А., Пичугина Т.Д., Дьяконов Л.П., Борисова М.Н. Культура клеток гуппи и ее применение в вирусологических исследованиях//Ветеринарная патология, 2003, 1,5, 50-52.
3. Пичугина Т.Д., Мочалкин В.П., Анисимов М.К. Однослойные культуры клеток эмбрионов гуппи//Бюллетень ВИЭВ, 1976, вып. 26, с. 32.
4. Рудиков Н.И. О клеточных культурах из эмбрионов и личинок пресноводных рыб/ /Рыбоводство и болезни рыб//Научные труды. Отделение животноводства и ветеринарии ВАСХНИЛ.-М., 1969, С. 221-224.
5. Fijan N., Sulimanovic D., Bearzotti M. et al. Some properties of the epithelioma papulosum cyprini (EPC) cell line from carp Cyprinus carpió. Ann Virol (Inst. Pasteur), 1983, 134, 207-220.
6. Wergeland H.I., Jakobsen R.A. A salmonid cell line (TO) for production of infection salmon anaemia virus (ISAV). Diseases of aquatic orqanisms, 2001, 44, 183-190.
7. Wolf K.,Quimby M.C. Established eurethremic line of fish cells in vitro. Science, 1962, 135, 3508, 1065-1066.
SUMMARY
E.A. Zavjalova, T.D. Pichugina. Modern methods of culturing fish cells.
Tissues of the fishes are amenable to the techniques of modern cell culture as mammalian tissues and organs. The authors describes the methods of preparing primary & continues fish cell cultures.
Вирусы аквакультур
Ключевые слова: вакцина, инфекционные заболевания, рыба
Сокращения: Вс - вирус(ы); пз - после заражения; ПЦР - полиме-разная цепная реакция; ТЦД - тканевые цитопатические дозы; ЦПД -цитопатическое действие
Герпесвирусы
При сравнении генома европейских и японских изолятов герпесвируса угрей обнаружили консервативный участок размером 463 пар оснований, который использовали в качестве праймера при проведении ПЦР. Тест оказался чувствительнее изоляции вируса, служащей стандартным методом диагностики этой инфекции. Он позволил обнаруживать в тканях рыб около 10 копий генома герпесвируса угрей [16].
В 1998...2004 гг. по всему миру прокатилась волна вспышек высококонтагиозного заболевания, сопровождавшегося массовой гибелью карпов и кои. Заболевшие рыбы быстро утомлялись и начинали задыхаться на мелководье. Их кожа темнела, а жабры некротизировались. При вскрытии погибших рыб обнаруживали интерстициальный нефрит, некроз жабр и петехиальные кровоизлияния в печени. Возбудителем болезни оказался крупный (100 х 110 нм) икосаэдричес-
кий оболочечный ДНК-Вс, названный Вс нефрита-некроза жабр или Вс герпесвируса кои (см. «РВЖ. СХЖ», 2005, № 2 и «РВЖ. МДЖ», 2005, № 2). С помощью электронной микроскопии его легче всего обнаружить в селезенке [5]. Агент размножается в культурах клеток карпов и кои, вызывая в них ЦПД через 4 дня пз. [9]. Пассирование в культуре клеток ведет к утрате агентом вирулентности. В Университете Хеб-ру (Израиль) данный метод использовали при создании вакцины. Аттенуация возбудителя болезни предусматривала периодическое заражение низкопассажным Вс с последующей изоляции"! и репродукцией его в культуре клеток 115].
Герпесвирус устриц 1 — единственный представитель сем. Негре$ушс1ае, способный вызывать инфекцию у беспозвоночных. Заразившиеся им тихоокеанские устрицы (С. gigas) погибают. Криоэлектронная микроскопия очищенных капсидов Вс показала, что они имеют типичную для гер-песвирусов икосаэдрическую (Т=16) форму. Установили гомологию значительной части ДНК герпесвируса устриц 1 с геномом герпесвирусов млекопитающих, птиц, рептилий, рыб и амфибий [6]. У герпесвируса устриц 1 обнаружили 124 уникальных гена, часть из которых кодирует синтез ингибиторов апоптоза, дезоксиуридиновой триптофазы, ДНК-по-лимеразы, рибонуклеотид редуктазы, геликазы, примазы, АТФ-субъединичной терминазы и мембран-ассоциирован-ных протеинов.
Нодавирусы
Нодавирусы вызывают вспышки заболевания преимущественно у мальков и молоди морских рыб. В последнее десятилетие эти агенты стали серьезным тормозом развития рыбоводства во многих странах мира. В Канаде первая вспышка инфекции произошла в 1999 г. в одном из рыбоводческих хозяйств провинции Новая Шотландия у атлантической трески. Недавно болезнь поразила атлантическую треску, пикшу и камбалу в ряде хозяйств Ньюфаундленда и Нью-Брансуика, а также на пограничной с США территории. Сравнение штаммов нодавирусов, изолированных в разных регионах мира, позволило разделить их на 2 группы— североатлантический и европейский кластеры. Получены праймеры для обратнотранскриптазной ПЦР, позволяющие выявлять североатлантические нодавирусы в икре и разных тканях рыб [7].
У норвежской трески нодавироз протекал с симптоматикой энцефалопатии и ретинопатии. При постмортальном исследовании рыб, погибших на острой стадии инфекции, обнаружили интенсивную вакуолизацию центральной нервной системы. Анализ генома возбудителя показал, что он отличается от 4 известных кластеров нодавирусов [10].
В рыбоводческих хозяйствах Греции произошли вспышки нодавирусной инфекции среди пресноводных рыб. Источником инфекции по всей видимости оказался морской окунь, которого до этого считали резистентным к ней. У заболевших рыб развивались сколиоз и лордоз, они становились сонливыми, утрачивали баланс и координацию движений. Вторичные инфекции АеготопаБ Ьус1горЫ1а и ТпсЬосНпа ер. осложняли течение болезни, повышая инцидентность летального исхода [2]. Генетический анализ 128 штаммов Вс геморрагической септицемии морских рыб, изолированных от нескольких видов рыб в разных географических районах, показал их принадлежность к 4 разным генотипам. Генотип I включал штаммы, выделенные от радужной форели (генотип 1а) и разных видов рыб в Балтийском море (генотип 1Ь). У рыб в Балтийском море циркулирует также генотип II. К генотипам III и IV отнесли изоляты Вс, обнаруженные в Великобритании и Северной Америке соответственно [19].
Изолятами Вс геморрагической септицемии морских рыб, выделенными от рыб в Балтийском море, экспериментально заразили радужных форелей. Агент поражал в первую
НОВОСТИ
ВЕТЕРИНАРНЫХ НАУКИ И ПРАКТИКИ
очередь почки и сердце. Его изоляты различались по пато-генности, вызывая гибель от 3,5 до 48% рыб [3].
Датские исследователи разработали 2 варианта ДНК-вакцин против данной инфекции, приготовленных из плаз-мид, кодирующих синтез протеинов G и N возбудителя. Первый вариант ДНК-вакцины индуцировал быстрое и интенсивное накопление вирусного протеина G в миоцитах привитых рыб. Вторая вакцина была менее эффективной [11]. В Японии также провели испытания ДНК-вакцины последнего типа, давшие весьма обнадеживающие результаты: после ревакцинации она индуцировала у 93% привитых рыб надежный иммунитет, длившийся 21 день [4|.
Вирусная анемия лососей
Вирусная анемия проявляется у атлантического лосося летаргией, анемией, кровоизлияниями во внутренних органах и завершается летальным исходом. Ее первая вспышка, по всей видимости, произошла в Норвегии в 1984 г., а затем инфекция распространилась на рыбоводческие хозяйства Канады, Шотландии, США и Фарерских островов. Резервуаром возбудителя предположительно служат свободно живущие рыбы. В лабораторных условиях Вс удается заразить кумжу, радужную форель и атлантическую сельдь. Специалисты канадского Атлантического ветеринарного колледжа предположили, что источником инфекции могут быть также вирены (Р. pollachius), которые постоянно селятся вблизи ферм, занимающихся разведением атлантического лосося. Однако исследование в обратно-транскриптазной ПЦР почек 93 вирен, отловленных вблизи лососевых хозяйств, дало отрицательный результат [12].
Инфекцию диагностируют посредством изоляции возбудителя, а также с помощью обратнотранскриптазной ПЦР и реакции непрямой иммунофлюоресценции. Перечисленные тесты испытали посредством «слепого» тестирования 400 проб почек лососей из 4 рыбоводческих хозяйств. По воспроизводимости результатов ПЦР значительно уступала реакции непрямой иммунофлюоресценции [13].
Вирусный лимфоцистоз
В испанских рыбоводческих хозяйствах от рыб Solea senegalensis, Pagellus bogaraveo и Sparus aurata изолировали ранее неизвестный Вс лимфоцистоза. Он активно размножался в культурах клеток, вызывая в них на 5...6-й день пз ЦПД и достигая титра 106ТЦД50/мл. В Малагском университете для диагностики этой инфекции разработали ПЦР [11.
Вирусный неврологический некроз
Ученые Национального Тайваньского университета получили 5 моноклональных антител (2 IgG и 3 IgM) к штамму G9508KS Вс неврологического некроза морского окуня. С помощью этих антител удается выявлять возбудителя в сетчатке рыб и инфицированной культуре клеток в иммуногистохими-ческом анализе и западном блоттинге. В иммуноферментном тесте, проводимом с этими моноклональными антителами, обнаруживают до 2,5 нг/лунку очищенного антигена вируса [18|.
Вирусный некроз поджелудочной железы
Сыворотка крови радужной форели ингибирует Вс некроза поджелудочной железы. Выраженность такой активности неодинакова у разных рыб и зависит от культуры клеток, в которых проводят репродукцию агента. Сыворотка крови нелососевых рыб не ингибирует Вс [14]. При низкой температуре (18°С) в культуре клеток эпителия печени рыбы-бабочки Вс экспрессирует антигены VP2 и VP3 через 4 ч пз, а при температуре 28°С — значительно позднее. Между интенсивностью синтеза вирусных белков, лизисом клеток моно-
слоя и тяжестью апоптоза выживших в первые 2 дня пз клеток выявили позитивную корреляцию [8|.
Бирнавирусная инвекция
В Испании от рыб нескольких видов, отловленных в разных частях Атлантического океана, выделили бирнавирус. В генетическом отношении изоляты оказались наиболее близки серотипу 1 Вс некроза поджелудочной железы. Они хорошо размножались в перевиваемой линии клеток эмбриона чавычи СНЯЕ-214. Электронная микроскопия показала, что большинство вирионов имеет икосаэдрическую форму, а небольшая их часть оказалась трубчатыми структурами типа I. Последние имели диаметр 55 нм, вариабельную (до 2 микрон) длину и плавучую плотность в градиенте плотности хлористого цезия 1,30 г/см3. Трубчатые вирионы могли размножаться в культуре клеток только в присутствии икосаэд-рических частиц Вс [9].
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Alonso М.С., Cano I., Garcia-Rosado Е. et al. Isolation of lymphocystis disease virus from sole, Solea senegalensis Каир, and blackspot sea bream, Pagellus bogaraveo (Brunnich). J Fish Dis, 2005, 28, 4, 221 -228.
2. Athanassopoulou F., BillinisC., PrapasT. Important disease conditions of newly cultured species in intensive freshwater farms in Greece: first incidence of nodavirus infection in Acipenser sp. Dis Aquat Organ, 2004, 60, 3, 247-252.
3. Brudeseth B.E., Raynard R.S., KingJA, Evensen 0. Sequential pathology after experimental infection with marine viral hemorrhagic septicemia virus isolates of low and high virulence in turbot (Scophthalmus maximus L). Vet Pathol, 2005, 42, 1, 9-18.
4. ByonJ.Y., OhiraT., Hironol. et al. Use of a cDNA microarray to study immunity against viral hemorrhagic septicemia (VHS) in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) following DNA vaccination. Fish Shellfish Immunol, 2005, 18, 2, 135-147.
5. Choi D.L, SohnS.G., Bang J.D. et al. Ultrastructural identification of a herpes-like virus infection in common carp Cyprinus carpio in Korea. Dis Aquat Organ, 2004, 61,12, 165-168.
6. Davison A.J., Trus B.L., Cheng N. et al. A novel class of herpesvirus with bivalve hosts. Gen Virol, 2005, 86, 1, 41-53.
7. Gagne N., Johnson S.C., Cook-Versloot M. et al. Molecular detection and characterization of nodavirus in several marine fish species from the northeastern Atlantic. Dis Aquat Organ, 2004, 62, 3, 181-189.
8. Hong J.R., Huang L.J., WuJ.L Aquatic birnavirus induces apoptosis through activated caspase-8 and -3 in a zebrafish cell line. J Fish Dis, 2005, 28, 3, 133-140.
9. Hutoran M., Ronen A., Perelberg A. et al. Description of an as yet unclassified DNA virus from diseased Cyprinus carpio species. J Virol, 2005, 79, 4,1983-1991.
10. Johansen R., Sommerset I., Torud B. et al. Characterization of nodavirus and viral encephalopathy and retinopathy in farmed turbot, Scophthalmus maximus (L.). J Fish Dis, 2004, 27, 10, 591-601.
11. LorenzenE., LorenzenN., Einer-Jensen K. et al. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish Shellfish Immunol, 2005, 19, 1, 27-41.
12. McClureCA, Hammell K.L., Dohoo I.R., Gagne N. Lack of evidence of infectious salmon anemia virus in pollock Pollachius virens cohabitating with infected farmed Atlantic salmon Salmo salar. Dis Aquat Organ, 2004, 61, 1-2, 149-152. '
13. Nerette P., Dohoo I., Hammell L. et al. Estimation of the repeatability and reproducibility of three diagnostic tests for infectious salmon anaemia virus. J Fish Dis, 2005, 28, 2, 101-110.
14. Park K.C., Reno P.W. Characteristics of inhibition of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) by normal rainbow trout Oncorhynchus mykiss serum. Dis Aquat Organ, 2005,63,1,43-52.
15. Perelberg A., Ronen A., Hutoran M. et al. Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus vaccine. Vaccine, 2005, 16, 23, 26, 3396-3403.
16. Rijsewijk F., Pritz-Verschuren S., Kerkhoff S. et al. Development of a polymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNA in eels based on the herpesvirus DNA polymerase gene. J Virol Methods, 2005, 124, 1 -2, 87-94.
17. Romero-Brey I., Batts W.N., Bandin I. et al. Molecular characterization of birnaviruses isolated from wild marine fishes at the Flemish Cap (Newfoundland). Dis Aquat Organ, 2004, 61, 1-2, 1-10.
18. Shieh J.R., Chi S.C. Production of monoclonal antibodies against grouper nervous necrosis virus (GNNV) and development of an antigen capture EUSA. Dis Aquat Organ, 2005, 25, 63, 1, 53-60.
19. Snow M., Bain N., Black J. et al . Genetic population structure of marine viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV). Dis Aquat Organ, 2004, 61, 1-2, 11-21.
