CC BY
84
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ... 1 33
УДК 615.2/.3.014.24:547.857.1
A.B. Ланцова1, Е.В. Санарова1, H.A. Оборотова, А.П. Полозкова1, О.Л. Орлова1, Е.В. Игнатьева , И.В. Ярцева , A.C. Миронов , P.C. Шакулов , C.B. Яроцкий , К.В. Лобанов РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ИНЪЕКЦИОННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ НА ОСНОВЕ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ СУБСТАНЦИИ ИЗ ПУРИНОВОГО НУКЛЕОЗИДА АКВ-12
1ФГБНУ "Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина" ФАНО, Москва 2ФГУП "ГосНИИГенетика", Москва
Контактная информация
Ланцова Анна Владимировна, кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник лаборатории
разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)612-81-92
e-mail: lantsova1979@mail.ru
Статья поступила 24.06.2014, принята к печати 08.09.2014.
Резюме
За рубежом на второй фазе клинических испытаний находится кандидат в препараты для лечения В-клеточной лимфоцитарной хронической лейкемии, новое лекарственное средство - А1САЯ (5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеозид), агонист аденозиновых рецепторов, избирательно подавляющий размножение опухолевых В-лимфоцитов. В Российской Федерации в научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов синтезирована субстанция АКВ-12 из пуринового нуклеозида, который также является агонистом аденозиновых рецепторов. Субстанция трудно растворима в воде, для применения онкологическим больным актуальной является разработка рациональной научно обоснованной инъекционной лекарственной формы. В связи с этим целью настоящего исследования явилось разработка инъекционной ЛФ для отечественной субстанции АКВ-12. В ходе исследования разработана парентеральная ЛФ на основе АКВ-12 в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций. В качестве сорастворителей для субстанции АКВ-12 выбраны 5 %-ный раствор маннита и 10 %-ный раствор Ко1Шоп 17 РБ, повышающие растворимость АКВ-12 в 2-3 раза. Предложены ВВ ингибирующие реакцию распада АКВ-12: натрия метабисульфит и аскорбиновая кислота. Показано, что на стабильность АКВ-12 в растворах значительное влияние оказывает температура. Отмечено, что при понижении температуры раствора до + 5 °С процесс деградации АКВ-12 замедляется в 3 раза. Разработана технология получения ЛФ АКВ-12 в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций, которая позволяет увеличить срок хранения препарата. Определены критерии качества ЛФ в соответствии с требованиями действующей в РФ к нормативной документации по контролю качества лекарственных препаратов.
Ключевые слова: лекарственная форма, сорастворители, антиоксиданты, лиофилизация
A.V. Lantsova1, E.V. Sanarova1, N.A. Oborotova1, A.P. Poloskova1, O.L. Orlova1, E.V. Ignateva1, I.V. Yartseva1, A.S. Mironov2, R.S. Shakulov2, S.V. Yarotskiy2, K.V. Lobanov2
DEVELOPMENT OF TECHNOLOGY FOR INJECTABLE DOSAGE FORM BASED ON THE NATIONAL SUBSTANCE OF PURINE NUCLEOSIDE AKV-12
1FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» FASO, Moscow
2State Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms
Abstract
Overseas, a candidate for drugs for the treatment of B-cell chronic lymphocytic leukemia in on the second phase of clinical trials, a new drug - AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside), an agonist of adenosine receptors selectively suppresses reproduction of tumor B-lymphocytes. In the Russian Federation Scientific Center Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms («Genetika») synthesized substance AKV-12 of purine nucleoside, which is also an agonist of adenosine receptors. This substance difficulty soluble in water, in this connection is the actual development of rational based injectable dosage form for cancer patients. In this regard, the aim of this study was to develop injectable substance for domestic dosage form AKV-12. In the study developed a parenteral dosage form based on the AKV-12 in the form of a lyophilisate for solution for injection. As co-solvents for the substance AKV-12 selected 5% mannitol solution and 10% solution of Kollidon 17 PF, solubilizing AKV-12 2-3 times. Proposed adjuvants inhibiting reaction decay AKV-12: sodium metabisulfite, and ascorbic acid. It is shown that the stability of the AKV-12 in solution are strongly influenced by temperature. It is noted that the solution temperature is lowered to +5 ° C, the degradation of the AKB 12 slows down 3 times. Developed the technology for production of dosage form AKV-12 as a lyophilisate for solution for injection, which allows you to increase the shelf life of the drug. Defined quality criteria of dosage form in accordance with the requirements of the current Russian Federation standard documentation for quality control of drugs.
Key words: formulation, co-solvents, antioxidants, lyophilisation.
Введение
Многочисленными исследованиями о влиянии ЛФ на терапевтическую эффективность лекар-
№ 3/том 13/2014
ственных препаратов установлено, что оптимальная активность ЛВ достигается только при его назначении в рациональной ЛФ. Кроме того, в этом случае можно избежать многих побочных эффектов
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ...
лекарственных препаратов на организм. ЛФ - это рациональная с фармакологической точки зрения, удобная для приема и хранения форма ЛВ, обеспечивающая его оптимальный терапевтический эффект при минимуме побочного действия. ЛФ представляет собой структурную единицу, как фармакотерапии, так и промышленного производства. Важнейшей задачей при разработке и приготовлении ЛФ является обеспечение оптимальных условий для высвобождения и последующего всасывания субстанции.
Данным условиям подчинены все остальные требования, которым должна отвечать ЛФ. Фармация рассматривала ЛФ как средство транспортировки ЛВ в организм. В этой связи в основном учитывалось удобство введения ЛВ через естественные пути, и поэтому пероральным путем вводятся 70— 80 % всех лекарственных средств. Сравнительные исследования той или иной ЛФ не проводились, а сложившаяся практика показала, что из всех ЛФ наибольшей популярностью пользуются таблетки, капсулы (50 % всех готовых ЛФ), а также инъекционные ЛФ [1-3; 5; 6; 11; 14].
С помощью биофармацевтических технологий можно создавать лекарственные препараты с заданными фармакокинетическими свойствами, в которых заложен определенный фармакологический эффект: синергизм, потенцирование, антагонизм, пролонгирование, дифференцированное или направленное действие, расширение антибактериального спектра и др. При этом заданный терапевтический эффект обеспечивается не только структурой ЛФ, но и возможностью задействовать физиологические особенности организма [1; 4; 7; 10; 13-16].
За рубежом на второй фазе клинических испытаний находится кандидат в препараты для лечения В-клеточной лимфоцитарной хронической лейкемии, новое лекарственное средство - АЛСАЯ (5-аминоими-дазол-4-карбоксамид рибонуклеозид), агонист адено-зиновых рецепторов, избирательно подавляющий размножение опухолевых В-лимфоцитов [18; 19; 24; 25]. В нашей стране в ФГУП «ГосНИИгенетика» синтезирована отечественная субстанция из пуринового нуклеозида АКВ-12 также являющаяся агонистом аденозиновых рецепторов [8; 9; 17]. Биологическое действие АКВ-12 заключается в активации АМПК, ключевого регулятора энергетических процессов протекающих как на клеточном, так и на организменном уровне [12].
АКВ-12, будучи активатором АМПК, приводит к снижению синтеза жирных кислот и белков и благодаря этому на 90 % ингибирует рост раковых клеток человеческой простаты [28], а также останавливает пролиферацию раковых клеток молочной железы человека [27]. АКВ-12 блокирует сигнальный путь Р13К-Ак и повышает экспрессию белков, ингибирующих цикл развития клетки [26], кроме того, он вызывает ингибирование сигнальных каскадов ЕЯК или Ак/тТ0К/Р7086К [18].
Помимо ингибирования пролиферации клеток АКВ-12 так же индуцирует апоптоз опухолевых клеток различных типов, таких как нейробластома [22; 25], рак поджелудочной железы [23], гепатома [24]. Касательно лейкозов имеется патент Е8 2192495 и ряд статей [19-23], в которых сообщается о свойствах АКВ-12, которые можно использовать в терапии данного заболевания, в частности, для лечения В-клеточной лейкемии, так как АКВ-12 вызывает апоптоз В-клеток.
Однако в связи с тем, что субстанция АКВ-12 трудно растворима в воде, для применения он-
кологическим больным актуальна разработка рациональной научно обоснованной инъекционной ЛФ.
Целью настоящего исследования является разработка инъекционной ЛФ для отечественной субстанции АКВ-12.
Материалы и методы
Характеристика объекта исследования
Субстанция АКВ-12, изготовитель ФГУП «ГосНИИГенетика». Молекулярная масса 258,2 г /моль. Представляет собой кристаллы (иглы) белого цвета, без запаха. Трудно растворим в воде, практически нерастворим в этиловом и метиловом спиртах, хлороформе, ацетоне. Величина pH 1%-ного водного раствора 7-7,5. Все используемые вспомогательные вещества и реактивы соответствовали требованиям НД.
Оборудование
В работе использованы весы аналитические Sartorius 2405 (Sartorius AG, Германия); весы лабораторные Sartorius LA1200S (Sartorius AG, Германия); установка сублимационной сушки «Edwards Minifast DO.2» (Ero Electronic S.p.A., Италия); спектрофотометр Cary-100; рН-метр Sartorius PP-15 (Sartorius AG, Германия); установка для фильтрации инъекционных растворов под вакуумом (Milli-pore, Франция); дозирующие устройства «Oxford», модель «Pipettor», от 0,5 до 10 мл; полуавтомат для обжима колпачков на флаконах, ЗМ-00-0ПС Жда-новского ЗТО; мешалка верхнеприводная механическая RZR 2021 Heidolph с пропеллерным перемешивающим элементом PR 30 Heidolph (Heidolph, Германия).
Упаковочный материал
Для упаковки использовали флаконы из трубки стеклянной для лекарственных средств из стекла НС-1 вместимостью 20 мл по ИСО 8362-1, которые укупоривали резиновыми пробками по ИСО 8362-2, с обкаткой алюминиевыми колпачками по ИСО 8362-3.
Методы
Стерилизующая фильтрация
Стерилизующую фильтрацию растворов АКВ-12 проводили под вакуумом с использованием фильтрационной системы Stericup GP Millipore Express Plus с полиэфирсульфоновыми фильтрами, имеющими размер пор 0,22 мкм.
Метод сублимационного высушивания
Лиофилизацию проводили на сублимационной сушке Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания).
Термический метод определения эвтектической температуры. В его основе лежит фиксирование температуры образца, замороженного ниже эвтектической точки, в процессе медленного оттаивания. На кривой измерения температуры материала при достижении эвтектической точки образуется плато, соответствующее времени, когда тепло, поступающее извне, не приводит к повышению температуры, а расходуется на плавление льда при данной эвтектической «концентрации» раствора. Получить такую площадку можно только при достаточно большом содержании вещества в растворе, поэтому этот метод применим не во всех случаях.
Методика определения эвтектической температуры растворов модельной ЛФ с АКВ-12. Для
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ...
замораживания используют раствор модельной ЛФ с АКВ-12, который дозируют по 6 мл во флаконы вместимостью 30 мл, толщина слоя составляет 15 мм. Модели ЛФ с АКВ-12 замораживают на полке сублимационной установки, начальная температура (+20 ++22) 0С, до температуры (-40+-45) 0С. При достижении заданной температуры на препарате выдерживают в течение 3 часов, далее включают нагрев до температуры (+20++22) 0С.
Спектрофотометрия
Стабильность растворов АКВ-12 в присутствии ВВ определяли методом УФ-спектрофото-метрии на спектрофотометре Cary 100 (Varian, Inc., Австралия) при X 267 нм.
Методика
Содержимое флакона растворяют в воде, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводят объем раствора водой до метки. 1 мл (или 0,5 мл для дозировки 0,48 г) полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки водой. Оптическую плотность полученного раствора измеряют на спектрофотометре в максимуме при 267±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора PCO АКВ-12.
Содержание АКВ-12 во флаконе в граммах (X) рассчитывают по формуле:
X =
D1 • a0 V1
, где
Di и D0 - оптические плотности растворов образца и PCO АКВ-12
V0 _ величина разбавления PCO АКВ-12 (20 000) V1 _ величина разбавления АКВ-12 (100)
Примечание.
Приготовление раствора PCO АКВ-12. Около 1,5 мг (точная навеска) субстанции АКВ-12 растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. Раствор должен быть свежеприготовленным.
Метод потенциометрии
Для измерения активности ионов водорода растворов АКВ-12 использовали рН-метр HANNA 211 (Hanna Instruments, Германия).
Результаты и обсуждения
По данным авторов АКВ-12 трудно растворим в воде, быстро разрушается, что лимитирует его применение в виде в/в инъекций. С целью повышения растворимости и стабильности в водном растворе исследовали ВВ, совместимые с физиологическими жидкостями организма, применяемые для получения инъекционных растворов.
Как известно, ВВ не являются индифферентными, они способны повышать или понижать биологическую активность действующих веществ, а также изменять характер их действия. В качестве сорастворителей в первую очередь были испытаны ВМС, нашедшие широкое применение в медицине _ декстран (полиглюкин), Kollidon 17 PF, полиэти-ленгликоль 1500, циклодекстрины(а, ß), Lutrol Е-400 (BASF), поливинилпирролидон (ISP, Швейца-
рия), ДМСО и их водные растворы, а также ряд других растворителей. Растворимость определяли визуально при температуре (20±2) °С, а также выражали в процентном отношении. Данные по растворимости представлены в табл. 1.
Наибольший интерес представляли растворы, полученные с использованием ВМС, которые повышали растворимость АКВ-12 в 3 и более раз -растворы маннита (5 %-ный) с Kollidon 17 PF (10 %-ный), раствор лактозы (5 %-ный) с Kollidon 17 PF (10 %-ный), раствор декстрана (5 %-ный).
Исследовалась растворимость АКВ-12 в воде при соотношении его с декстраном и Kollidon 17 PF 1 : 1; 1 : 2; 1 : 3; 1 : 4. Максимальную концентрацию АКВ-12 (9 %) получили при соотношении его с декстраном 1 : 1, с Kollidon 17 PF 1 : 2. При повышении концентрации Kollidon 17 PF или декстрана в 2-4 раза растворимость АКВ-12 снижалась.
В качестве стабилизаторов были исследованы ВМС, использованные для повышения растворимости АКВ-12 и антиоксиданты - аскорбиновая кислота, натрия метабисульфит, для регуляции кислотности - натрия гидрокарбонат.
По данным табл. 2 видно, что стабильность АКВ-12 водных растворов с добавлением антиок-сидантов - аскорбиновой кислоты, натрия метаби-сульфита и натрия сернокислого - значительно выше, чем без них. Наиболее оптимальным оказался многокомпонентный состав с аскорбиновой кислотой, натрия метабисульфитом и натрия гидрокарбонатом. Концентрация антиоксиданта подбиралась таким образом, чтобы величина pH растворов была в пределах 6,0-7,5 (5 %-ный раствор), т.к. ранее было установлено, что эта зона является оптимальной для стабильности АКВ-12.
По результатам проведенного эксперимента видно, что антиоксиданты - аскорбиновая кислота и натрия метабисульфит повышают стабильность растворов АКВ-12 с ВМС в 2 раза (температура + 25 °С). Такие многокомпонентные системы стабильнее водных растворов АКВ-12, при этих же условиях, в 2 раза. При этом прослеживается значительное влияние температурного фактора на процесс распада АКВ-12. Так, понижение температуры растворов АКВ-12 до + 5 °С замедляет этот процесс в 2-3 раза.
Следовательно, для того, чтобы повысить устойчивость водных растворов АКВ-12, необходимо готовить и хранить растворы при температуре не выше +5 °С.
Таким образом, для дальнейших исследований выбрана модель инъекционной ЛФ АКВ-12 поликомпонентного состава: АКВ-12, Kollidon 17 PF, маннит, аскорбиновая кислота, натрия гидрокарбонат, натрия метабисульфит.
Стабилизация АКВ-12
при помощи лиофилизации
Одним из наиболее перспективных способов стабилизации веществ является обезвоживание путем лиофилизации, это позволяет сохранить свойства ЛВ, получить препарат с хорошо развитой поверхностью, что ускоряет его растворение.
В связи с этим при разработке инъекционной ЛФ для АКВ-12 возникла необходимость определения оптимального состава, подлежащего высушиванию, установления режима замораживания и сушки, а также изучение влияние всего технологического процесса на конечный продукт. Первым этапом являлось определение эвтектической температуры для АКВ-12. Данные представлены на рис. 1
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
36 I ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ...
Таблица 1
Растворимость АКВ-12 в различных раство рителях
Растворитель Максимально полученная концентрация АКВ-12, %
Вода для инъекций 2,0
Диметилсульфоксид (ДМСО) 5,0
Р-р Метилцеллозы в воде 5,0
Р-р В-циклодекстрина в воде 6,0
Лютрол Е-400 5,0
Р-рПолиэтиленглюколя в воде (2-10%) 8,0
Р-ры декстрана в воде (2-10%) 8,0-9,0
Р-ры ПВП в воде (5-20%) 6,0
Р-ры Коллидона в воде (5-20%) 6,0-8,0
Р-р маннита в воде 5% 6,0-8,0
Р-р маннита (5%) с коллидоном (10-20%) 8,0-9,0
Р-р лактозы (5%) с коллидоном (10%) 8,0-9,0
Изучение стабильности АКВ-12 в растворах сорастворителей (168 ч)
Таблица 2
Содержание компонентов, г в 100 мл раствора
Снижение содержания АКВ-12 в растворах, % к исходному
Температура + 25°С
Температура + 5 °С
1.АКВ-12 - 2,0
2.АКВ-12 - 3,0 Декстран - 5,0
3.АКВ-12 - 5,0 Коллидон - 10,0
4.АКВ-12 - 5,0 ПВП - 10,0
5.АКВ-12 - 5,0 Декстран - 5,0
Аскорбиновая кислота - 0,036
6.АКВ-12 - 5,0 Коллидон - 10,0 Аскорбиновая кислота - 0,035 Натрия гидрокарбонат - 0,017
7.АКВ-12 - 5,0 Коллидон - 10,0 Аскорбиновая кислота - 0,035 Натрия гидрокарбонат - 0,017 Натрия метабисульфит - 0,0007 Лактоза - 5,0
8.АКВ-12 - 5,0 Коллидон - 10,0 Аскорбиновая кислота - 0,035 Натрия гидрокарбонат - 0,017 Натрия метабисульфит - 0,0007 Манит - 5,0
9.АКВ-12 - 5,0 Коллидон - 10,0
Натрия сернокислого - 0,036 Манит - 5,0
10.АКВ-12 - 5,0 Декстран - 5,0
Натрия сернокислого - 0,036
11,0
11,0 9,0
11,5
8,9
6,8
6,0
6,0
6,8
7,0
,4
,6 6,0
7,5
6,0
2,8 2,5
2,0
5,1
4,0
Состав моделей ЛФ АКВ-12 для парентерального применения
Таблица 3
№ Вспомогательные вещества Содержание АКВ-12 (номинальное),г Масса содержимого флакона, (номинальная) г Содержание АКВ-12, (найденное), г
11 Коллидон; Маннит; Ка2804 0,48 1,98 0, 424
22 Коллидон; Маннит; Аск. кислота 0,48 1,98 0,456
33 Коллидон; Аск. к-та; ЫаНСОз 0,48 1,98 0,442
44 Коллидон; Маннит; Аск. к-та; ЫаНСОз; Натрия метабисульфит 0,3 1,20 0,304
55 Коллидон; Лактоза Аск. к-та; ЫаНСОз; Натрия метабисульфит 0,3 0,90 0,313
66 Коллидон; Аск. к-та 0,3 0,90 0,265
87 Коллидон; Лактоза; Ка2804 0,3 1,20 0,282
8 Декстран 0,3 0,6 0,293
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ.
Эвтектическое разделение растворов АКВ-12, в точке А (-5 : -7) °С происходит переохлаждение и последующая кристаллизация растворителя, а точка Б (-21:-23) °С относится к зоне эвтектики растворов АКВ-12, где происходит его переохлаждение и последующая кристаллизация. Эта зона и является криогидратной зоной АКВ-12.
Рис. 1. Криогидратные зоны водных растворов АКВ-12, определенные термическим методом:
1 - водный раствор АКВ-12 (5 %-ный);
2 - водный раствор АКВ-12 (5 %-ный)
с Коллидоном (10 %-ным) и антиоксидантами;
зона А - (-5:-7) °С,
зона Б - (-21 :-23) °С.
Оптимальный режим сублимационной сушки 5 %-ного концентрата АКВ-12 выбирали эмпирически после проведения ряда экспериментальных сушек в разных режимах и последующего физико-химического контроля готового продукта.
При разработке оптимального режима сушки АКВ-12 прежде всего исследовали влияние температурного режима на качество готового продукта, его внешний вид, сохранность свойств вещества. При этом учитывали данные по температуре эвтектики и замораживания, а также начальной температуре сушки.
С целью отработки режима сублимационной сушки проводили экспериментальные наработки моделей ЛФ АКВ-12. Раствор концентрата АКВ-12 разливали во флаконы вместимостью 20 мл по 4,5 мл; 5,0 мл; 5,5 мл; 6,0 мл (для дозы 0,3 г АКВ-12 во флаконе). Толщина слоя раствора во флаконах в пределах 9-15 мм. Замораживали при (-50^-40) °С и при достижении заданной температуры на препарате выдерживали в течение 3 ч.
Испытаны режимы сушек с разной начальной температурой препарата, разным временем выдержки при минусовой температуре, интенсивностью нагрева и различной температурой досушивания препарата.
По окончании сушки вакуум в сублимационной камере гасили чистым, профильтрованным воздухом, который поступает в камеру через систему фильтров. Кассеты с препаратом выгружают из сублимационной камеры, закрывают крышками и передают на укупорку.
В результате оказалось, что на продолжительность сушки оказывает влияние толщина слоя исходного раствора, а также время и температура досушивания препарата. При интенсификации процесса сушки путем увеличения температуры подог-
рева до +10 °С в час и повышения температуры при досушивании до +27 °С наблюдается снижение содержания АКВ-12 во флаконе ниже допустимых пределов.
Снижение интенсивности подогрева до +5 °С в час и увеличение времени досушивания до 13-15 часов при (+18^+20) °С также не обеспечивает гарантированного качества продукта.
Проведенные эксперименты показали, что качество продукта обеспечивается при следующем режиме сушки:
Кассеты с флаконами, раздозированными по 6 мл, помещают на полку сублимационной установки, подключают датчики, установленные во флаконы, закрывают камеру сублимационной установки и начинают замораживание продукта. Замораживание проводят при температуре (-40 -г- -45) °С. После достижения температуры замораживания препарат выдерживают при этой температуре в течение 2,5-3,5 часов. Контроль температуры и продолжительность замораживания ведется по регистрирующему устройству.
Начальная температура сушки (-40^-45) °С . Нагрев полок до температуры +20 °С начинают через 30 минут после включения вакуумного насоса и выравнивания вакуума. Максимально возможная скорость подъема температуры 1 °/ч. После достижения температуры полок +20 °С включают ин-жекцию воздуха и доводят остаточное давление в камере до значения 40-50 Па. Температура в продукте при досушивании не должна превышать +20 °С. Продолжительность досушивания - от 3 до 5 часов. Общее время сушки препарата во флаконах вместимостью 20 мл составляет 24-30 часов. Контроль процесса сублимационной сушки осуществляется оператором по приборам и регистрирующему устройству, расположенным на панели установки.
В результате технологических разработок были поучены 9 моделей ЛФ АКВ-12 для парентерального применения, отличающиеся как содержанием активного вещества, так и составом ВВ (табл. 3).
На основании технологических и химико-фармацевтических исследований была выбрана ЛФ «АКВ-12, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 300 мг» следующего состава:
Состав на 1 флакон:
АКВ-12
Маннит
Коллидон 17 РБ Аскорбиновая кислота Натрия гидрокарбонат Натрия метабисульфит
300,0 мг 300,0 мг 600,0 мг 2,15 мг 1,03 мг 0,043 мг
Для разработки основных параметров и критериев качества были наработаны 3 серии (по 300 флаконов в каждой) лекарственного препарата «АКВ-12, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 300 мг».
Выбор основных параметров и критериев качества ЛФ АКВ-12
В соответствии с требованиями Отраслевого стандарта «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» 91500.05.001-00, ГФ XI, вып. 1 и вып. 2, а также ГФ XII, часть I, во внимание принимали обязательный набор критериев и параметров качества, регламентированный для характеристики лиофилизированной ЛФ: описание (внешний вид); средняя масса содержимого флакона и отклонение от средней массы; подлинность; прозрачность раствора
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
I ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ...
и испытание на отсутствие механических примесеи; цветность раствора; рН раствора; содержание воды; количественное определение.
Все образцы лиофилизированной ЛФ АКВ-12 представляли собой сухую пористую массу белого цвета.
Электронные спектры поглощения растворов ЛФ, полученные по методике количественного определения, в интервале от 200 до 400 нм совпадали с электронным спектром поглощения раствора субстанции АКВ-12. Определение массы содержимого флакона показало, что для всех проверенных образцов масса содержимого флакона укладывалась в интервал 1,16 - 1,21 г; а отклонение от средней массы не превышало ±5 %.
Раствор содержимого флакона в 20 мл воды для всех изученных образцов ЛФ удовлетворяли требованиям прозрачности (ГФ XII, ч. 1, с. 98), интенсивность его окрашивания не превышала интенсивности окрашивания эталона У6 (ГФ XII, ч. 1, с. 93). Значения рН полученного раствора для всех исследованных образцов лекарственной формы АКВ-12 укладывались в интервал 6,0-7,0. (ГФ XII, ч. 1, с. 85).
Все образцы ЛФ выдерживали требования РД 42-501-98 по механическим включениям.
Потеря в массе при высушивании, определенная из 1 г препарата в соответствии ГФ XII, вып.1, с. 176, не превышала 1,0 % для всех изученных образцов ЛФ.
Для количественного определения содержания активного вещества в ЛФ была применена спектрофотометрическая методика прямого определения вещества с использованием РСО. В электронном спектре поглощения водных растворов АКВ-12 в области 200-350 нм наблюдается интенсивная полоса поглощения при X 267±2 нм (рис. 2).
Рис. 2. Электронный спектр поглощения 0,0015 %-ного водного раствора субстанции АКВ-12.
При изучении влияния ВВ, входящих в состав ЛФ, на спектральные характеристики было показано, что они не влияют на положение максимума полосы поглощения активного вещества (рис. 3).
Литература:
Поглощение раствора ВВ в «рабочей» концентрации незначительно, поэтому в качестве раствора сравнения можно использовать воду для инъекций. Проведенные исследования показали, что как и для растворов субстанции АКВ-12, поглощение растворов ЛФ в максимуме 267±2 нм подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в диапазоне концентраций от 0,005 до 0,025 мг/мл. Предложенная методика предусматривает использование PCO.
Разработанная методика была использована для количественного определения содержания активного вещества в различных моделях ЛФ АКВ-12. Образцы ЛФ хранили при температуре не выше минус 10 °С в сухом защищенном от света месте.
200
250 300
Wavelength (nm)
350
Рис. 3. Электронный спектр поглощения водного раствора моделей ЛФ АКВ-12.
Заключение
Проведены технологические и химико-фармацевтические исследования по созданию инъекционной ЛФ АКВ-12. Изучена растворимость АКВ-12 в растворителях для инъекций. В качестве сорастворителя для субстанции АКВ-12 выбран 10 %-ный раствор Ко1Шоп 17 РБ, повышающий растворимость АКВ-12 в 2-3 раза. В качестве ВВ, ингибирующего реакцию распада АКВ-12, предложены многокомпонентный антиоксидант-ный состав, состоящий из натрия метабисульфита и аскорбиновой кислоты, увеличивающий стабильность его водных растворов в 2 раза.
Натрия гидрокарбонат применили для регулирования кислотности. Показано, что на стабильность АКВ-12 в растворе значительное влияние оказывает температура. При понижении температуры раствора до +5 °С процесс деградации АКВ-12 замедляется в 3 раза. Разработан режим лиофилизации растворов АКВ-12, что позволяет сохранить свойства препарата при хранении. Определены критерии качества ЛФ в соответствии с требованиями действующей в РФ нормативной документации по контролю качества лекарственных препаратов. Для выбранной ЛФ АКВ-12 составлен проект фармакопейной статьи предприятия.
1. Государственная Фармакопея. XII издание. -М., 2008. - 490 с.
2. Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов // Вестник РАМН. - 2012. - № 3. - С. 23-30.
3. Барышникова М.А., Барышников А.Ю. Иммунолипосомы и мишени их действия // Журнал Российского химического общества им. Д.И.Менделеева 2012. - Т. LVI, № 3-4. - C. 60-7.
4. Барышников А.Ю., Оборотова H.A. Иммунолипосомы - новое средство доставки лекарственных препаратов // Современная онкология. - 2001. - Т. 3, № 2. - С. 4.
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ... | 39
5. Барышникова М.А., Орлова О.Л., Полозкова А.П. и др. Разработка лекарственной формы цифелина для перорального применения // Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т. 3, № 2. - С. 12.
6. Барышникова М.А., Орлова О.Л., Шпрах З.С. и др. Разработка лекарственной формы галавита в виде сублингвальных таблеток // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 86-90.
7. Дмитриева М.В., Оборотова Н.А., Орлова О.Л и др. Липосомальная лекарственная форма Борхлори-на // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 31-6.
8. Ланцова А.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л. и др. Создание пероральной лекарственной формы с оригинальной отечественной субстанцией АКВ-12 -агониста аденозиновых рецепторов // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 51.
9. Ланцова А.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л. и др. Разработка парентеральной лекарственной формы для оригинальной отечественной субстанции АКВ-12 - агониста аденозиновых рецепторов // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 51.
10. Ланцова А.В., Сапрыкина Н.С., Санарова Е.В. и др. Изучение противоопухолевой активности нано-структурированной липосомальной формы лизомустина in vivo// Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 32.
11. Левачева И. С., Барышникова М.А. Направленная доставка противоопухолевых препаратов липосо-мами // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 32.
12. Лобанов К.В., Шакулов Р.С., Яроцкий С.В. и др.Доклиническое изучение биосинтетического акаде-зина // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 54.
13. Оборотова Н.А. Противоопухолевые препараты, созданные в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. -Экспериментальная онкология на рубеже веков. - М: Издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003. - С. 5-51.
14. Оборотова Н.А. Достижения в области современных лекарственных форм противоопухолевых препаратов // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 61.
15. Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. - 2009. - Т. 121, № 5. - С. 464.
16. Санарова Е.В., Оборотова Н.А., Смирнова З.С.и др. Применение липосомальных систем доставки для создания нового эффективного противоопухолевого фотосенсибилизатора // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 72.
17. Шакулов Р.С., Миронов А.С., Эрраис Л.Л. Лечебное средство с противоопухолевой активностью на основе акадезина. Патент RU 2 494 744. - 10.10.2013. - С.1-7.
18. Baumann P., Mandl-Weber S., Emmerich B. et al. Activation of adenosine monophosphate activated protein kinase inhibits growth of multiple myeloma cells // Exp Cell Res. - 2007. - 313. - P. 3592-603.
19. Campas C., Lopez J., Santidrian A. et al. Acadesine activates AMPK and induces apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells but not in T lymphocytes // Blood. - 2003. - 101. - P. 3674-80.
20. Campas C., Santidrian A., Domingo A. et al. Acadesine induces apoptosis in B-cells from mantle cell lymphoma and splenic marginal zone lymphoma // Leukemia. - 2005. - 19. - P. 292-4.
21. Coll-Mulet L., Iglesias-Serret D., Santidrian A. et al. MDM2 antagonists activate p53 and synergize with genotoxic drugs in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells // Blood. - 2006. - 107. - P. 4109-41.
22. Garcia-Gil M., Pesi R., Perna S. et al. 5'-aminoimidazole-4-carboxamide riboside induces apoptosis in human neuroblastoma cells // Neuroscience. - 2003. - 117. - P. 811-20.
23. Kefas B., Heimberg H., Vaulont S. et al. AICA-riboside induces apoptosis of pancreatic beta cells through stimulation of AMP-activated protein kinase // Diabetologia. - 2003. - 46. - P. 250-4.
24. Meisse D., Van de Casteele M., Beauloye C. et al. Sustained activation of AMP-activated protein kinase induces c-Jun N-terminal kinase activation and apoptosis in liver cells // FEBS Lett. - 2002. - 526. - P. 3842.
25. Pesi R., Micheli V., Jacomelli G. et al. Cytosolic 5'-nucleotidase hyperactivity in erythrocytes of Lesch-Nyhan syndrome patients // Neuroreport. - 2000. - 11. - P. 1827-31.
26. Rattan R., Giri S., Singh A., Singh I. et al .5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside inhibits cancer cell proliferation in vitro and in vivo via AMP-activated protein kinase // J Biol Chem. - 2005. -280. - P. 39582-93.
27. Swinnen J., Beckers A., Brusselmans K. et al. Mimicry of a cellular low energy status blocks tumor cell anabolism and suppresses the malignant phenotype // Cancer Res. - 2005. - 65. - P. 2441-8.
28. Xiang X., Saha A., Wen R. et al. AMP-activated protein kinase activators can inhibit the growth of prostate cancer cells by multiple mechanisms // Biochem Biophys Res Commun. - 2004. - 321. - P. 161-7.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АМПК ВМС
вв
в/в
дмсо лв
ЛФ
- аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы
- высокомолекулярные соединения
- вспомогательные вещества
- внутривенное
- диметилсульфоксид
- лекарственное вещество
- лекарственная форма
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
