CC BY
96
Лиофилизированная наноструктурированная лекарственная форма тиосенса
Санарова Е.В., Полозкова А.П., Оборотова Н.А.
Применение нанотехнологий является одним из ведущих направлений развития фармацевтического производства. Включение лекарственных веществ в биосовместимые носители снижает концентрацию свободных препаратов в кровяном русле и препятствует их быстрому выведению почечной системой, тем самым уменьшая общую токсичность и увеличивая терапевтический индекс за счет изменения фармакокинетики и биораспределения. Накопление нанораз-мерных носителей в опухолях и очагах воспаления обусловлено повышенной проницаемостью эндотелия сосудов, пораженных областей. Липосомы, представляющие собой фосфолипидные везикулы, относятся к наиболее био— и гемосовместимым носителям и пригодны для системного введения в организм.
В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина разрабатывается липосомальная лекарственная форма (ЛЛФ) тиосенса. Субстанция тиосенса синтезирована ГНЦ «НИОПИК» и представляет собой тетра-3-фенилтиофталоцианин-гидроксиалюминия, который интересен тем, что поглощает свет в ближнем инфракрасном диапазоне (720+4 нм). Это свойство позволит использовать его в качестве эффективного фотосенсибилизатора при проведении фотодинамической терапии опухолей. Гидрофобность данного препарата предлагается преодолеть методом включения в липосомальный бислой.
Представленное исследование посвящено разработке технологии получения лиофилизированной наноструктурированной (липосомальной) лекарственной формы тиосенса.
На первоначальном этапе исследования в качестве основных компонентов ЛЛФ выбраны яичный фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-2000-фосфатидилэтаноламин в молярном соотношении 1/0,22/0,002, соответственно. Данный состав обеспечивал приемлемый средний размер липосом — 168+8 нм (до лиофилизации) и включение тиосенса на уровне 98%. В связи с тем, что липосомы не обладают продолжительной устойчивость в водном растворе для увеличения срока годности проводили лиофилизацию липосомальной дисперсии тиосенса с использованием в качестве криопротектора сахарозы в соотношении лецитин/сахароза равном 1/9 [6—8], что обеспечивало сохранение первоначального диаметра везикул и количественного содержания тиосенса во флаконе.
Следующим этапом является оптимизация технологии получения ЛЛФ тиосенса, которая включала отработку процессов получения липидной пленки, ее гидратации, гомогенизации и фильтрации липосо-мальной дисперсии, с последующей лиофилизацией. При получении липидной пленки путем упаривания хлороформного раствора липидов и препарата на роторном испарителе Buchi Rotavapor R-200 важна эффективность испарения растворителя, которая зависит от разности температур водяной бани Buchi Heating Bath B-490 и паров трихлорметана, скорости
вращения колбы с испаряемым образцом и величины создаваемого вакуума. Использовали вакуумный насос обеспечивающий глубину вакуума на уровне — 0,8 Бар (—24 мм.рт.ст), температуру водяной бани поддерживали на уровне +38+20С (температура фазового перехода лецитина). Проводили оценку влияния скорости вращения колбы на эффективность испарения при этом давление и температура были неизменны (Рис.1). Полученные данные указывают на снижение скорости отгона растворителя из хлороформного раствора компонентов ЛЛФ по сравнению с чистым растворителем (2,5 — 4 раза). Увеличение скорости вращения колбы от 30 до 180 об/мин обеспечивало повышение скорости отгона растворителя от 3 до 17 мл/мин, соответственно. Наиболее приемлемой оказалась скорость вращения колбы 120 об/ мин, обеспечивающая достаточную скорость отгона хлороформа из раствора компонентов ЛЛФ и равномерное распределение пленки на стенках колбы.
о
О 30 60 90 120 150 180
Скорость вращения колбы, об/мин
Рисунок 1. Зависимость скорости испарения хлороформа и хлороформного раствора компонентов ЛЛФ от скорости вращения колбы
Полученную пленку досушивали под вакуумом до полного отсутствия запаха хлороформа. Время досушивания составляло от 1 до 3 часов в зависимости от количества взятого хлороформного раствора (10 — 30 мл). Высушенную пленку гидратировали с использованием воды для инъекций (рН=5,9+0,2), изотонического раствора натрия хлорида (рН=6,3+0,3) или 5% изотонического раствора глюкозы (рН=3,3+0,2). Липосомальные дисперсии, образовавшиеся после смывания пленки со стенок колбы данными растворами, имели различные значения рН и средний размер (Табл.1) больших мультиламеллярных липосом (БМЛ).
Таблица 1. Значения рН и среднего размера БМЛ Тиосенса
Раствор для гидратации Значения рН Средний размер липосом,нм
Вода для инъекций 6,9±0,2 906±22
Изотонический раствор натрия хлорида 7,3±0,3 1207±34
5% изотонический раствор глюкозы 4,5±0,2 789±18
Медицинские науки
Для введения животным ЛЛФ Тиосенса оптимальным диапазоном рН считается 6,2—7,2, поэтому в дальнейшем в качестве раствора для гидратации использовали воду для инъекций, которая обеспечивала получение липосомальной дисперсии с оптимальным значением рН и диаметра БМЛ.
Для получения малых однослойных липосом применяли метод гомогенизации под высоким давлением с использованием гомогенизатора МюгоАш^ег М-110Б. При этом оценивали изменения значений рН, среднего размера везикул и окисленности липосомаль-ных фосфолипидов (по концентрации малонового диальдегида (МДА) — конечного продукта перекисного окисления фосфолипидов) в зависимости от времени измельчения при неизменном давлении — 40 мм.рт. ст и объеме загрузки — 300 мл (Табл.2).
Таблица 2. Влияние гомогенизации на качество липосомальной дисперсии Тиосенса
Время измельчения, мин Значения рН Средний размер однослойных липосом, нм Концентрация МДА, нмоль/мл
2 6,9±0,1 76±3;387±8 1,08±0,05
4 7,0±0,2 37±2; 169±4 1,25±0,04
6 7,0±0,2 25±1;143±6 1,31±0,05
8 6,1±0,2 63±3; 323±7 1,96±0,07
10 6,1±0,1 39±1; 147±5 2,04±0,05
12 5,8±0,2 28±1;126±5 2,21±0,06
Определение параметров осуществлялось через каждые 2 минуты измельчения, что соответствует 1 циклу гомогенизации. Гомогенизация приводила к разделению липосом на две фракции. Замечено, что на 8 минуте (4 цикла) происходит резкий рост диаметра везикул, что приводит к выпадению в осадок фрагментов бислоя с включенной в них субстанцией тиосенса. В этот период также значительно возрастают значение рН и содержание МДА, снижая качество липосомальной дисперсии. Поэтому при таком объеме загрузки время измельчения не должно превышать 6 минут (3 цикла).
За стадией измельчения следует стерилизующая фильтрация (размер пор фильтра 0,22 мкм), которая не оказывает существенного влияния на размер, значение рН и включение Тиосенса в липосомальный бислой, последнее снижается на 2 — 4%.
Основной задачей этапа лиофилизации ЛЛФ Ти-осенса являлась разработка режима лиофилизации, который обеспечивал бы получение лиофилизата надлежащего качества, с сохранением его биологической активности. Первоначально изучали влияние предварительного замораживания и замораживания в камере лиофильной сушки на внешний вид лиофилизата, его остаточную влажность, рН и размер липосом (после ресуспендирования).
Образец лекарственной формы дозировали по 6 мл во флаконы объемом 25 мл, которые загружали в низкотемпературную камеру N7 280/75.А при температуре +200С+30С. Проводили постепенное замораживание
липосомальной дисперсии от +200С до —500С, после достижения образцами температуры —450С+20С их выдерживали в морозильной камере в течение 6—7 часов. После этого флаконы выгружали и помещали на полки сублимационной сушки Edwards Minifast DO.2. Проводили лиофилизацию и осуществляли досушивание препарата продолжительностью около 3 часов по критерию неизменности остаточного давления паров в сублимационной камере. При замораживании в камере лиофильной сушки раздозированную во флаконы ЛЛФ сразу помещали на полки сушки, замораживали и проводили сублимацию.
При сравнении лиофилизатов полученных с использованием различных методов заморозки (Табл.3) выявлено, что образцы, подвергавшиеся предварительному замораживанию, имели вкрапления и после ресуспендирования не сохраняли первоначальный размер липосом. Анализ лиофилизата, весь технологический процесс лиофилизации которого прошел в камере сублимационной сушки, показал отсутствие вкраплений в структуре лиофилизированного препарата и сохранение размеров липосом на допустимом уровне.
ТаблицаЗ. Оценка качества лиофилизата после предварительного замораживания в морозильной камере и замораживания в лиофильной сушке
Способ замораживания Внешний вид Остаточная влажность, % рН Размер липосом, нм
Предварительное замораживание в морозильной камере Светлозеленая сухая пористая масса с мелкими вкраплениями Прак- тически отсут- ствует 7,0±0.2 197±20
Замораживание в лиофильной сушке Светлозеленая пористая масса без вкраплений Прак- тически отсут- ствует 6,7±0,3 156±10
Технология получения ЛЛФ Тиосенса представляет собой сложный, многостадийный процесс, на каждом этапе которого существует множество факторов, способных повлиять на качество конечного препарата. Настоящим исследованием выявлено, что для получения качественной липидной пленки необходимо подобрать соответствующую скорость вращения роторного испарителя (120 об/мин), время сушки (более 1 часа) и проводить гидратацию водой для инъекций. Для получения малых моноламеллярных липосом Тиосенса необходимо 6 циклов гомогенизации при объеме загрузки 300 мл. Стабильность ЛЛФ при хранении и надлежащее качество лиофилизата обеспечивает медленное замораживание липосомальной дисперсии в лиофильной сушке с последующей сублимацией.
Всероссийский журнал научных публикаций, август 2011
Тб
Список использованных источников:
1. Гуревич Д.Г., Меерович И.Г, Меерович г. А. и др. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления Тиосенса в опухоли // Российский биотерапевтический журнал. — 2007. — № 2. — С. 45-49.
2. Меерович И.Г, Оборотова Н.А. Применение липосом
в фотохимиитерапии. 1. Липосомы в ФДТ // Российский биотерапевтический журнал. — 2003. — №4. — C. 3-8.
3. Гатинская Л.Г., Дмитричева Н.А., Игнатьева Е.В., и др. Изучение растворимости тиосенса // Российский Биотерапевтический Журнал. -2006. — №1. — C. 33-34.
4. Meerovich I.G., Smirnova Z.S., Oborotova N.A., et al. Hydroxyaluminium Tetra-3-Phenylthiophthalocyanine is a New Effective Photosensitizer for Photodynamic Therapy and Fluorescent Diagnosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. — 2005. — V. 139 (4). — P. 427-430.
5. Abdelwahed W., Degobert G., Stainmesse S., et al. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations // Advanced Drug Delivery Reviews. — 2006. — V. 58 (15). — P. 1688-1713.
6. Hinrichs W.L.J., Mancenido F.A., Sanders N.N., et
al. The choice of a suitable oligosaccharide to prevent aggregation of PEGylated nanoparticles during freeze thawing and freeze drying // International Journal of Pharmaceutics. — 2006. — V. 311 (1-2). — P. 237-244.
7. Lee M.K., Kim M.Y, Kim S., et al. Cryoprotectants for freeze drying of drug nano-suspensions: effect of freezing rate // Journal Pharm Sci. — 2009. — V. 98 (12). — P. 4808-17.
8. Sun W.Q., Leopold A.C., Crowe L.M., et al., Stability of dry liposomes in sugar glasses, Biophys. J. 70 (1996) 1769-1776.
Информация об авторах
• Санарова Е.В., младший научный сотрудник Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва
• Полозкова А.П., старший научный сотрудник Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва
• Оборотова Н.А., профессор, доктор фармацевтических наук, заведующая лабораторией разработки лекарственных форм Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва
