CC BY
408
Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 49-54.
УДК 582.998 + 581.19
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ПОДОРОЖНИКА БОЛЬШОГО СУХОГО
© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ (Россия) E-mail: oldaniil@rambler.ru
Разработан способ получения средства - экстракта подорожника большого сухого, входящего в состав комплексного препарата Плантэкс, обладающего антиоксидантным действием, заключающемся в том, что предварительно измельченное до размера частиц 0,5-1,0 мм сухое растительное сырье - листья подорожника большого - дважды экстрагируют при температуре 96-98 °С 60% спиртом этиловым при соотношении сырье: экстрагент 1 : (18-22) в течение 90 мин, с последующим объединением экстрактов, отгоном спирта этилового; и далее дважды по 60 мин при температуре 96-98 °С при соотношении сырье: экстрагент 1 : (18-22) с последующим объединением экстрактов, фильтрованием, объединением с водным остатком спиртового извлечения, упариванием и сушкой.
Сокращения: БАС - биологически активное соединение, Tar - винная кислота, Cit - лимонная кислота, Mal - яблочная кислота, Mln - малоновая кислота, Suc - янтарная кислота, Glc - глюкоза, Frc - фруктоза, Xyl - ксилоза, Rha -рамноза, Raf - раффиноза, Ste - стахиоза, GalUA - галактуроновая кислота, Bln - байкалин.
Введение
Подорожник большой (Plantago major L.) сем. Plantaginaceae - лекарственное растение, широко используемое в медицинской практике. Химический состав листьев подорожника большого разнообразен: полисахариды [1-3], органические кислоты [4], фенолокислоты и их производные [5, 6], флавоноиды [7, 8], иридоиды [9, 10], витамины [11], липиды [12], микроэлементы [13]. Биологическая активность данного вида растительного сырья обусловлена комплексом БАС, среди которых особо выделяют водорастворимые полисахариды [14, 15] и флавоноиды [16, 17].
Нами разработан способ получения экстракта подорожника большого сухого, входящего в состав комплексного препарата Плантэкс, обладающего антиоксидантной активностью.
Экспериментальная часть
Сырье. Листья подорожника большого Plantago major L. приобретены через аптечную сеть (ОАО «Красногорсклексредства»). Сырье измельчали и обрабатывали согласно разработанной технологической схеме.
Общие экспериментальные условия. Извлечения из листьев подорожника большого получали методом водной и спиртовой перколяции при нагревании. Для количественной оценки эффективности экстракции и контроля качества нами разработаны методики количественного определения суммарного содержания полисахаридов (в пересчете на галактуроновую кислоту) и флавоноидов (в пересчете на байкалин).
Методика количественного определения суммарного содержания полисахаридов. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1,0 мм. Около 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в коническую плоскодонную колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляли 60 мл воды очищенной, нагревали содержимое колбы на кипящей
* Автор, с которым следует вести переписку.
водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 200 мл через бумажный фильтр, который промывали 10 мл воды очищенной. Извлечение повторяли в тех же условиях еще раз и доводили объем объединенного фильтрата до метки водой очищенной (раствор А).
2 мл раствора А переносили в центрифужную пробирку, приливали 4 мл 95% спирта этилового, перемешивали и нагревали на водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения содержимое пробирки центрифугировали в течение 10 мин со скоростью вращения 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок суспендировали с 5 мл 95% этанола и повторно центрифугировали в тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, осадок продували в пробирке горячим воздухом до удаления следов этанола. К осадку приливали 4 мл реактива, нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Содержимое пробирки после охлаждения переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл 95% спиртом этиловым и доводили до метки тем же растворителем (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине волны 424 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 4 мл реактива, выдержанные в тех же условиях, что и опытная смесь.
Содержание полисахаридов (Х, %) в пересчете на галактуроновую кислоту и абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле
^ D • kV • 0.91 100
X '■
m ■ E 100 - Ж
где Б - оптическая плотность исследуемого раствора; к - коэффициент разбавления (2500); 0.91 - коэффициент гидролиза; Е - коэффициент пересчета на Оа1ПЛ (214); т - масса навески сырья, г; Ж - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Реактив готовили следующим образом: 100 мг антрона (МРТУ 6-09-1214-64), предварительно перекри-сталлизованного из бензола, помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводили до метки кислотой серной концентрированной (ГОСТ 4204-77, р ~ 1,83). Срок годности раствора 5 ч.
Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1,0 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в коническую плоскодонную колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляли 60 мл 60% спирта этилового, нагревали содержимое колбы на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 200 мл через бумажный фильтр, который промывали 10 мл 60% спирта этилового. Извлечение повторяли в тех же условиях еще раз и доводили объем объединенного фильтрата до метки 60% спиртом этиловым (раствор А). 2 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки 60% спиртом этиловым (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине волны 281 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 60% спирт этиловый. Параллельно определяли оптическую плотность раствора стандартного образца байкалина при длине волны 281 нм.
Суммарное содержание флавоноидов (Х, %) в пересчете на байкалин и абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле
^ Б ■ т ■ кг 100
Х =-----ст-------------Ю0,
Б ■ т ■ кг 100 - Ж
где Б - оптическая плотность исследуемого раствора; Бст - оптическая плотность раствора стандартного образца байкалина; к- коэффициент разбавления исследуемого раствора (2500); куст - коэффициент разбавления раствора стандартного образца байкалина (2500); т - масса навески сырья, г; тст - масса навески байкалина, г; Ж - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление стандартного раствора байкалина. Около 15 мг байкалина (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяли в 2 мл ДМСО и доводили до метки 60% спиртом эти-
ловым (раствор А). 2 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки 60% спиртом этиловым.
Расчет суммарного содержания флавоноидов можно вести также с использованием величины удельного коэффициента погашения байкалина (610) либо с применением градуировочного графика. Различие полученных значений, рассчитанных тремя способами, не превышало 4-5%.
Масса навески при анализе готового продукта равна 0.5 г, шрота - 10 г, осадка балластных веществ - 0,5 г.
Относительные ошибки использованных методик не превышают 3,0 и 3,5% (соответственно для полисахаридов и флавоноидов).
Качественный анализ проводили с применением подходов, описанных нами ранее [18]; количественный анализ - с применением следующих методик: органические кислоты [19], дубильные вещества [20], углеводы [21], фенолокислоты [22, 23], кислота аскорбиновая [18], кальций [24], аминокислоты [25].
Метрологический анализ результатов проводили согласно рекомендациям Государственной фармакопеи и др. [26-28]. Результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1. Метрологические характеристики разработанных методик (сырье ОАО «Красногорсклексредства» Серия 010104)
n x,% S2 S x P , % t ( P,f) ±Ax,% E,%
Полисахариды
9 1,44 2,23-10-3 1,6710-2 95 2,36 0,04 2,78
Флавоноиды
9 2,22 7,94-10-3 2,97^10'2 95 2,36 0,07 3,21
Обсуждение результатов
Результаты исследования оптимальных технологических параметров экстракции сырья представлены в таблицах 2 и 3.
При исследовании динамики выхода действующих веществ в целевом и сопутствующих продуктах в течение технологического процесса нами решено исключить стадию сепарирования во избежание потерь БАВ (табл. 4).
Предлагаемый способ получения не требует сложной схемы очистки, позволяет извлечь максимальное количество действующих веществ, благодаря применению двух экстрагентов. Полученный продукт обладает постоянным составом и выраженной антиоксидантной активностью.
Таблица 2. Выбор оптимальных условий экстракции полисахаридов из листьев P. major
Исследуемый параметр Суммарное содержание полисахаридов в пересчете на GalUA, % Исследуемый параметр Суммарное содержание полисахаридов в пересчете на GalUA, %
Экстрагент Время экстракции, мин
Вода очищенная 4,87 30 3,08
Спирт этиловый 20% 4,09 45 3,79
Спирт этиловый 40% 3,21 60 4,20
Спирт этиловый 60% 1,09 75 4,21
Спирт этиловый 80% 0,87 90 4,20
Спирт этиловый 95% 0,12 105 4,22
Соотношение сырье: экстрагент Кратность экстракции
1 : 10 3,21 1 4,33
1 : 15 3,87 2 0,49
1 : 20 4,68 3 0,16
1 : 25 4,70 4 0,12
1 : 30 4,71 5 -
Таблица 3. Выбор оптимальных условий экстракции флавоноидов из листьев P. major
Исследуемый параметр
Суммарное содержание флавоноидов в пересчете на Bln, %
Суммарное содержание флавоноидов в пересчете на Bln, %
Экстрагент
Время экстракции, мин
Вода очищенная Спирт этиловый 20% Спирт этиловый 40% Спирт этиловый 60% Спирт этиловый 80% Спирт этиловый 95% 1,63 1,94 2,48 2,86 2,74 2,43 30 45 60 75 90 105 120 1,78 2,07 2.52 2.52 2.53 2.54 2,53
Соотношение сырье: экстрагент Кратность экстракции
1 : 10 1,52 1 1,74
1 : 15 1,89 2 0,14
1 : 20 2,72 3 0,04
1 : 25 2,76 4 0,01
1 : 30 2,77 5 -
Таблица 4. Содержание БАС в целевом и сопутствующих продуктах
Продукт Содержание БАС, % / % от суммарного содержания
Флавоноиды Полисахариды Органические кислоты Дубильные вещества
Сырье Экстракт сухой Балласт Шрот 3,00±0,01 / 100 6,08±0,63 / 81 8,96±0,61 / 18 0,17±0,01 / 1 2,07±0,08 / 100 4,55±0,18 / 88 2,35±0,09 / 7 0,21±0,02 / 5 10,16±0,89 / 100 18,57±1,20 / 73 15,44±0,68 / 9 1,53±0,07 / 18 4,05±0,16 / 100 8,58±0,78 / 85 8,74±0,84 / 13 0,19±0,01 / 2
Общая схема получения экстракта подорожника большого сухого включает следующие стадии.
Измельченный растительный материал (листья подорожника большого) экстрагируют 60% спиртом этиловым в соотношении сырье: экстрагент 1 : (18-22) с учетом коэффициента водопоглощения при температуре 96-98 °С и постоянном помешивании. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют дважды. Время экстракции при 1-м и 2-м контактах фаз - по 90 мин. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/5 первоначального объема. Шрот после спиртовой экстракции дополнительно экстрагируют водой при температуре 96-98 °С и соотношении сырье: экстрагент 1 : (18-22) с учетом коэффициента водопоглощения и постоянном помешивании. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют дважды. Время экстракции при 1-м и 2-м контактах фаз - по 60 мин. Водные извлечения объединяют со спиртовыми и концентрируют до 1/10 первоначального объема. Полученный продукт высушивают в вакуум-сушильном аппарате и измельчают на мельнице пропеллерного типа.
Выход готового продукта составляет 45-48%. Предложенный способ позволяет получить субстанцию в виде рассыпчатого аморфного негигроскопичного порошка коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и своеобразным запахом. Потеря в массе при высушивании не должна превышать 10%. Суммарное содержание полисахаридов в сухом препарате в пересчете на галактуроновую кислоту должно быть не менее 4%, флавоноидов в сухом препарате в пересчете на байкалин должно быть не менее 6,0%.
Химические составы сырья и полученного препарата представлены в таблице 5.
По результатам проведенных исследований разработана нормативная документация: Проект Фармакопейной статьи предприятия «Экстракт подорожника большого сухого» и Лабораторный регламент на производство экстракта подорожника большого сухого.
Таблица 5. Качественное и количественное содержание БАС в сырье и препарате
Группа БАС Компоненты (шрифтом выделены доминирующие компоненты) Содержание в сырье, % Содержание в препарате, %
Органические кислоты Tar, Cit, Mal, Mln, Suc Суммарное содержание 10,16±0,89 18,57±1,20
Свободные 3,59±0,40 6,52±0,87
Связанные 6,57±0,57 12,05±0,97
Углеводы Суммарное содержание 8,75±0,67 14,26±0,59
Свободные (Glc, Frc, Xyl, Rha, Raf, Ste, GalUA) 4,56±0,56 8,84±0,41
Полисахариды 2,07±0,08 4,55±0,18
Фенолокислоты Кофейная, хлорогеновая, 1,37±0,14 2,24±0,12
Флавоноиды неохлорогеновая кислоты Лютеолин, цинарозид, 3,00±0,01 6,48±0,63
байкалин, байкалеин
Дубильные вещества 4,05±0,16 8,58±0,78
Кислота аскорбиновая 21,81±0,82 мг% 32,42±0,97 мг%
Кальций 6,37±0,47 10,23±0,56
Аминокислоты 0,89±0,17 1,27±0,18
Кумарины Скополетин, эскулетин - -
Антраценпроизводные, иридоиды, алкалоиды, сердечные гликозиды не обнаружены
Выводы
Разработан способ получения средства - экстракта подорожника большого сухого, входящего в состав комплексного препарата Плантэкс, обладающего антиоксидантным действием, заключающийся в том, что предварительно измельченное до размера частиц 0,5-1,0 мм сухое растительное сырье - листья подорожника большого - дважды экстрагируют при температуре 96-98 °С 60% спиртом этиловым при соотношении сырье: экстрагент 1 : (18-22) в течение 90 мин, с последующим объединением экстрактов, отгоном спирта этилового; и далее дважды по 60 мин при температуре 96-98 °С при соотношении сырье : экстрагент 1 : (18-22) с последующим объединением экстрактов, фильтрованием, объединением с водным остатком спиртового извлечения, упариванием и сушкой.
Список литературы
1. Горин А.Г. Химическое исследование полисахаридов листьев Plantago major L. 1. Анализ моносахаридного состава полисахаридного комплекса // Химия природных соединений. 1965. №5. С. 297-302.
2. Горин А.Г. Химическое исследование полисахаридов листьев Plantago major L. 2. Пектовая кислота // Химия природных соединений. 1965. №6. С. 369-372.
3. Samuelsen A.B., Paulsen B.S., Wold J.K., Otsuka H., Yamada H., Espevik T. Isolation and Partition Characterization of Biologically Active Polysaccharides from Plantago major L. // Phytoterapy Research. 1995. Vol. 9. P. 211-218.
4. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Михайлова Т.М., Samuelsen A.B. Органические кислоты лекарственных растений. 1. Plantago major L. // Химия природных соединений. 2005. №4. С. 354-355.
5. Максютина Н.П. Оксикоричные кислоты Plantago major и P. lanceolata // Химия природных соединений. 1971. №6. С. 824-825.
6. Pailer V.M., Haschke-Hofmeister E. Inhaltstoffe aus Plantago major // Planta Medica. 1969. Vol. 17. P. 139-145.
7. Максютина Н.П. Производные байкалеина и скутеляреина в листьях Plantago major // Химия природных соединений. 1971. №3. С. 374-375.
8. Harborne J.B., Williams C.A. 6-Hydroxyluteolin and Scutelarein as Phyletic Markers in Higher Plants // Phytochemistry. 1971. Vol. 10. P. 367-378.
9. Andrzejewska - Golec E., Swiatek L. Chemotaxonomic Studies on the Genus Plantago. I. Analysis of Iridoid Fraction // Herba Polonica. 1984. Vol. 30. P. 9-16.
10. Murai M., Tanaka Y., Nishibe S. Iridoids from Plantago major // Natural Medicine. 1996. Vol. 50. P. 306.
11. Zennie T.M., Ogzewalla C.D. Ascorbic Acid and Vitamin A Content of Edible Wild Plants of Ohio and Kentucky // Economical Botany. 1977. Vol. 31. P. 76-79.
12. Bakker M.I., Baas W.J., Sijm D.T.H.M., Kolloffel C. Leaf Wax of Lactuca sativa and Plantago major // Phytochemistry. 1998. Vol. 47. P. 1489-1493.
13. Попов А. И. Фронтальный элементный анализ листьев подорожника большого // Химико-фармацевтический журнал. 1993. №11. С. 50-51.
14. Samuelsen A. B., Paulsen B.S., Wold J.K., Otsuka H., Kiyohara H., Yamada H., Knutsen S.H. Characterization of a Biologically Active Pectin from Plantago major L. // Carbohydrates Polymers. 1996. Vol. 30. P. 37-44.
15. Samuelsen A.B., Paulsen B.S., Wold J.K., Knutsen S.H., Yamada H. Characterization of a Biologically Active Arabi-nogalactan from the Leaves of Plantago major L. // Carbohydrates Polymers. 1998. Vol. 35. P. 145-153.
16. Chiang L.-C., Ng L.T., Chiang W., Chang M.-Y., Lin C.-C. Immunomodulatory Activities of Flavonoids, Monoterpenoids, Triterpenoids, Irdoid Glycosides and Phenolic Compounds of Plantago Species // Planta Medica. 2003. Vol. 69. P. 600-604.
17. Chiang L.C., Chiang W., Chang M.Y., Ng L.T., Lin C.C. Antiviral Activity of Plantago major Extracts and Related Compounds in vitro // Antiviral Research. 2002. Vol. 55. P. 53-62.
18. Оленников Д.Н., Потанина О.Г., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г. Фармакогностическая характеристика листьев какалии копьевидной (Cacalia hastata L.) // Химия растительного сырья. 2004. №3. С. 43-52.
19. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Маркарян А.А. Методика количественного определения суммарного содержания органических кислот в растительном сырье // Растительные ресурсы. 2004. Вып. 3. С. 112-116.
20. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринкевича, Л.Н. Сафронича. М., 1983. 221 с.
21. Оленников Д.Н., Михайлова Т.М., Танхаева Л.М. Новые подходы к стандартизации листьев подорожника большого // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Мат. II Всерос. конф. Барнаул, 2005. Книга 2. С. 456-458.
22. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Авдеева Е.В., Болтабекова З.В., Вандышев В.В. Качественный и количественный анализ сырья и настойки Melissa officinalis L. // Растительные ресурсы. 1999. Т. 35. С. 116-121.
23. Крупникова Т.А., Драник Л.И., Давыдова В.Н. Количественное определение оксикоричных кислот в листьях кукурузы // Растительные ресурсы. 1971. Т. 7. С. 449-453.
24. Основы аналитической химии: Практическое руководство / Под ред. Ю.А. Золотова. М., 2001. 463 с.
25. Пахомов В.П., Максимова Т.В., Никулина И.Н., Цыганков В.В., Хромова Л.В. Стандартизация рогов и пантов северного оленя. I. Количественное определение нингидринактивных веществ в порошке рогов северного оленя // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №4. С. 53-54.
26. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1990. Вып. 2. С. 66.
27. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №2. С. 118-129.
28. Смагунова А.Н. Способы оценки правильности результатов анализа // Журнал аналитической химии. 1997. Т. 52. №10. С. 1022-1029.
Поступило в редакцию 22 декабря 2005 г.
