CC BY
135
УДК 582.998 + 581.19
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ЭКСТРАКТА КАКАЛИИ КОПЬЕВИДНОЙ
© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева, Г.Г. Николаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ (Россия) E-mail: ioeb@bsc.buryatia.ru
Разработан способ получения средства, обладающего кардиопротекторным действием (сухого экстракта какалии копьевидной), заключающийся в том, что предварительно измельченное до размера частиц 0,5-1,0 мм сухое растительное сырье - листья какалии копьевидной - дважды экстрагируют при комнатной температуре 70% этанолом при соотношении сырье: экстрагент 1 : (16-18) в течение 16 и 10 ч, соответственно, с последующим объединением экстрактов, отгоном этанола; и далее дважды по 60 мин кипящей водой при соотношении сырье: экстрагент 1 : (15-20) с последующим объединением экстрактов, фильтрованием, объединением с водным остатком спиртового извлечения, упариванием и сушкой.
Введение
Одной из актуальных задач здравоохранения является профилактика и лечение заболеваний сердечнососудистой системы. Социальная значимость данной проблемы обусловлена разнообразием этиологических факторов, широким распространением заболеваний, сопровождающихся тяжелыми клиническими проявлениями и приводящих к частичной или полной потере трудоспособности широких слоев населения.
Несмотря на то, что арсенал современных кардиопротекторных средств достаточно широк, проблема изыскания новых средств из растительного сырья, оказывающих многостороннее воздействие на основные звенья патогенеза заболеваний, обладающих малой токсичностью, не проявляющих побочного действия, остается весьма актуальной.
В экспериментах на животных показано, что извлечения из листьев какалии копьевидной оказывают положительное влияние на сердечно-сосудистую систему [1]. Данная работа проведена с целью разработки способа получения средства, обладающего выраженной кардиопротекторной активностью, которая достигается за счет увеличения выхода действующих веществ.
Экспериментальная часть
Сырье. Листья какалии копьевидной Cacalia hastata L. собирали в июле 2000 г. в лесостепной зоне Мухоршибирского района (Бурятия). Собранный материал высушивали на воздухе, измельчали и обрабатывали согласно разработанной технологической схеме.
Общие экспериментальные условия. Извлечения из листьев какалии копьевидной получали методом водной и спиртовой перколяции при комнатной температуре и при нагревании. Для количественной оценки эффективности экстракции и контроля качества нами разработаны методики количественного определения суммы органических кислот (в пересчете на яблочную кислоту) и суммы каротиноидов (в пересчете на Р-каротин).
* Автор, с которым следует вести переписку.
Методика количественного определения суммы органических кислот. Пробу сырья измельчают до необходимого размера частиц (0,5-5,0 мм). Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую плоскодонную колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляют объем V мл (540 мл) воды очищенной или этанола (20-95%), нагревают содержимое колбы на водяной бане до температуры Т °С (20-100 °С) и поддерживают эту температуру в течение 1 мин (30-120 мин). После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл через бумажный фильтр, который промывают 10 мл выбранного экстрагента и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А). При исследовании влияния кратности экстракции проводят необходимое количество извлечений из той же навески сырья.
10 мл раствора А пропускают через ионообменную колонку, которую промывают 50 мл воды. Элюат и промывные воды переносят в стаканчик для потенциометрического титрования. Титрование проводят 0,1 н раствором №ОИ до значения pH 7,0. Титр раствора №ОИ устанавливают по гидрофталату калия [2]. Содержание суммы органических кислот (Х) в процентах в пересчете на яблочную кислоту и абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле:
х _ Ушон • К -V' • 0.0067 -100 -100 _ V" • т • (100 - Ж) ,
где VNaoн - объем 0,1 н №ОН, пошедшего на доведение pH исследуемого раствора до значения 7,0 (до скачка потенциала), мл; V - объем раствора А, мл (200 мл); V - объем пробы, пропущенной через
ионообменную колонку, мл (10 мл); К - поправка на титр 0,1 н №ОН; 0,0067 - кислотный коэффициент -
количество яблочной кислоты в г, соответствующее точно 1 мл 0,1 н №ОН; т - масса сырья, г; Ж - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Подготовка ионообменной колонки. Для приготовления ионообменной колонки используют катионит КУ-2. Товарную смолу измельчают в ступке и просеивают сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Просеянную смолу заливают насыщенным раствором №С1 и оставляют на 2 ч для набухания. Затем смолу промывают в следующей последовательности: водой, 1 н раствором соляной кислоты, водой, 1 н раствором гидроксида натрия, водой, 1 н раствором соляной кислоты и водой до отрицательной реакции на хлорид-ионы. После последней промывки смолу сушат на воздухе. Высушенную смолу заливают водой и переносят в колонку. Количество сухого катионита КУ-2, необходимое для приготовления одной колонки, составляет 15-20 г. Регенерацию колонки осуществляют после использования 75% обменной емкости (2025 определений).
Методика количественного определения суммы каротиноидов. Пробоподготовка аналогична способу, описанному в методике определения суммы органических кислот.
20 мл раствора А помещают в делительную воронку и приливают 20 мл гексана, энергично перемешивают в течение 1 мин, оставляют до полного расслаивания и сливают органическую фазу в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют дважды. Извлечения объединяют и доводят объем раствора в мерной колбе до метки гексаном (раствор Б). Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют гексан. Содержание суммы каротиноидов (Х) в мг% в пересчете на Р-каротин и абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле:
Б • V • V''-100-100
X-----------;-----------,
2770-V • т • 100 • Ж)
где Б - оптическая плотность исследуемого раствора; V - объем раствора А, мл (200 мл); V - объем аликвоты, взятой на экстракцию с гексаном, мл (20 мл); V - объем раствора Б, мл (100 мл); т - масса сырья, г; Ж - потеря
в массе при высушивании, %; 2770 - удельный показатель поглощения Е^%М Р-каротина при длине волны
450 нм в гексане.
Относительные ошибки использованных методик не превышают 1 и 3% (соответственно для органических кислот и каротиноидов).
Метрологический анализ результатов проводили согласно рекомендациям Государственной Фармакопеи и др. [2-4]
Обсуждение результатов
Для установления оптимальных технологических параметров было изучено влияние основных факторов: состава и природы экстрагента, соотношения сырье : экстрагент, температурного режима, степени измельчения сырья, продолжительности и кратности экстракций на процессы экстрагирования растительного материала.
Одним из основных факторов, определяющих полноту экстракции, является тип и концентрация экстрагента, который действует как активный компонент системы, оказывая существенное влияние на качество, полноту и скорость экстракции биологически активных веществ из растительного материала. В качестве экстрагентов были использованы горячая вода и этанол следующих концентраций: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% (табл. 1).
Установлено, что при экстракции этанолом в концентрации выше 70% выход каротиноидов заметно не увеличивается; горячая вода экстрагирует максимальное количество органических кислот. Исходя из полученных результатов, для экстракции каротиноидов выбран 70% этанол, а для экстракции органических кислот - вода.
Измельчение твердого продукта с целью ускорения процесса диффузионного извлечения биологически активных веществ (БАВ) является одной из важных стадий подготовки сырья, которая обеспечивает полноту выхода экстрактивных веществ. Для изучения влияния степени измельчения растительного материала на выход суммы органических кислот и суммы каротиноидов сырье подвергалось измельчению до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мм. Установлено, что оптимальной степенью измельчения для данного вида сырья является размер частиц 0,5-1,0 мм (табл. 2).
Проведено изучение зависимости выхода БАВ от соотношения сырья и экстрагента, в результате чего были подобраны оптимальные соотношения для экстракции этанолом 1 : (16-18) и для экстракции водой 1 : (15-20) (табл. 3).
Таблица 1. Выход суммы органических кислот и суммы каротиноидов в зависимости от типа экстрагента
Экстрагент Выход суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту (экстракция водой), % (±0,02-0,05) Выход суммы каротиноидов в пересчете на Р-каротин (экстракция этанолом), мг% (±0,15-0,31)
Вода очищенная 6,51 14,32
Этанол 20% 6,03 29,49
30% 5,93 38,21
40% 5,26 50,б3
50% 5,10 б9,б5
б0% 4,71 88,21
70% 4,21 9б,59
80% 3,33 97,21
90% 3,05 97,78
95% 2,06 97,90
Таблица 2. Выход суммы органических кислот и суммы каротиноидов в зависимости от степени измельчения сырья
Степень измельчения сырья, мм Выход суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту (экстракция водой), % (±0,02-0,05) Выход суммы каротиноидов в пересчете на Р-каротин (экстракция этанолом), мг% (±0,15-0,31)
0,5 5,73 35,25
1,0 5,62 34,11
2,0 4,39 30,89
3,0 4,38 24,32
5,0 3,07 10,09
Таблица 3. Выход суммы органических кислот и суммы каротиноидов в зависимости от соотношения сырье: экстрагент
Соотношение сырье : экстрагент Выход суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту (экстракция водой), % (±0,02-0,05) Выход суммы каротиноидов в пересчете на Р-каротин (экстракция этанолом), мг% (±0,15-0,31)
1 : 5 Не смачивается 21,14
1 : б 4,37 44,59
1 : 7 4,94 50,01
1 : 8 5,13 51,43
1 : 9 6,33 б4,4б
1 10 6,32 70,90
1 12 7,55 70,94
1 15 7,92 7б,58
1 1б 7,95 80,32
1 18 7,94 82,13
1 20 7,95 85,б4
1 25 7,86 8б,21
1 30 7,80 8б,03
1 40 7,81 84,32
Для интенсификации процессов перехода биологически активных веществ из растительного сырья необходимо учитывать фактор температуры. С повышением температуры экстракции растворимость компонентов увеличивается. На основании данных анализа установлено, что оптимальным экстрагентом для извлечения органических кислот является кипящая вода, в то время как для экстракции этанолом выбрана комнатная температура, во избежание образования артефактов и разрушения термолабильных каротиноидов (табл. 4).
Для определения продолжительности и кратности числа экстракций изучена зависимость времени достижения равновесной концентрации в системе сырье: экстрагент для спиртовой (А) и водной (Б) экстракции.
А. Проводили экстракцию измельченного сырья 70% этанолом в соотношении 1 : 16 при комнатной температуре и периодическом перемешивании. Через заданные промежутки времени (1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 ч) извлечение фильтровали (1 контакт фаз), концентрировали до водного остатка и определяли сумму каротиноидов в пересчете на Р-каротин. Аналогичным образом проводили две последующие экстракции отжатого сырья, добавляя каждый раз 70% этанол в объеме, равном слитому (2 и 3 контакты фаз).
Б. Проводили экстракцию измельченного сырья кипящей водой в соотношении 1 : 15 на водяной бане с обратным холодильником при 100 °С и постоянном помешивании. Через заданные промежутки времени (30, 45, 60, 75, 90, 120 мин) извлечение фильтровали (1 контакт фаз) и определяли сумму органических кислот в пересчете на яблочную кислоту. Аналогичным образом проводили две последующие экстракции отжатого сырья, прибавляя каждый раз воду в объеме, равном слитому (2 и 3 контакты фаз).
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что равновесное состояние наступает при первом контакте фаз через 16 ч и втором контакте фаз через 10 ч в случае спиртовой экстракции (табл. 5); при первом и втором контакте фаз через 60 мин в случае водной экстракции (табл. 6).
Таблица 4. Выход суммы органических кислот в зависимости от температуры экстракции
Температура экстракции, °С Выход суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту, % (±0,02-0,05)
20 3,14
30 3,8б
40 4,22
50 5,94
б0 б,13
70 б,55
80 7,03
90 8,8б
100 9,33
Таблица б. Выход суммы каротиноидов при спиртовой экстракции в зависимости от времени и кратности экстракции
Время экстракции, ч
Выход суммы каротиноидов в пересчете на Р-каротин, мг% (±0,15-0,31)
Контакт фаз
1-й Z 2-й Z 3-й Z
1 23,15 23,15 24,38 47,53 14,25 б7,78
2 3б,15 3б,15 34,2б 70,41 22,7б 93,17
4 44,31 44,31 51,31 95,б2 23,20 118,82
б б1,83 б1,83 58,бб 120,49 25,33 145,82
8 73,48 73,48 б0,29 133,77 25,00 158,77
10 88,23 88,23 б9,б3 157,8б 18,51 17б,37
12 97,33 97,33 б0,53 157,8б 14,б0 172,4б
14 110,10 110,10 47,79 157,89 14,б2 172,51
1б 12б,33 12б,33 31,58 157,91 14,33 172,24
18 12б,5б 12б,5б 27,28 153,84 10,12 1б3,9б
20 128,02 128,02 25,б3 153,б3 10,13 1б3,7б
24 128,00 128,00 25,13 153,13 9,23 1б2,3б
Таблица 7. Выход суммы органических кислот при водной экстракции в зависимости от времени и кратности экстракции
Время экстракции, мин
Выход суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту, % (±0,02-0,05)
Контакт фаз
1-й S 2-й S 3-й Z
30 3,59 3,59 2,12 5,71 0,5б б,27
45 4,21 4,21 4,03 8,24 0,93 9,17
б0 б,б5 б,б5 4,83 11,48 0,55 12,03
75 б,б8 б,б8 4,8б 11,54 0,43 11,97
90 б,70 б,70 4,84 11,54 0,21 11,75
120 б,71 б,71 4,0б 10,77 0,11 10,88
В случае спиртовой и водной экстракций в течение первого контакта фаз экстрагируется около до 75 и 60% суммы каротиноидов и органических кислот (соответственно), второго - до 25 и 35%, третьего - до 5%, т.е. до 95% каротиноидов и органических кислот извлекается в течение первых двух контактов фаз, поэтому в целях экономии применение третьего контакта фаз следует считать нецелесообразным для обоих экстрагентов.
Предлагаемый способ позволяет получить препарат постоянного состава с выраженной кардиопротекторной активностью, что обусловливается значительным содержанием действующих веществ.
Общая схема получения сухого экстракта какалии копьевидной включает следующие стадии. Измельченный растительный материал (листья какалии копьевидной) экстрагируют 70% этанолом в соотношении сырье: экстрагент 1 : (16-18) с учетом коэффициента водопоглощения при комнатной температуре и постоянном помешивании. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют дважды. Время экстракции при 1 контакте фаз - 16 ч, 2 контакте фаз - 10 ч. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/4 первоначального объема. Шрот после спиртовой экстракции дополнительно экстрагируют водой при 100 °С в соотношении сырье : экстрагент 1 : (15-20) с учетом коэффициента водопоглощения и постоянном помешивании. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют дважды. Время экстракции при 1 и 2 контактах фаз - 60 мин. Водные извлечения объединяют со спиртовыми и концентрируют до 1/3 первоначального объема. Полученный продукт очищают сепарированием, высушивают в вакуум-сушильном аппарате и измельчают на мельнице пропеллерного типа.
Выход готового продукта составляет 40,3%. Предложенный способ позволяет получить субстанцию в виде рассыпчатого аморфного негигроскопичного порошка коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и своеобразным запахом. Потеря в массе при высушивании составляет 2,14%.
По результатам проведенных исследований разработана нормативная документация (Фармакопейная статья предприятия «Сухой экстракт какалии копьевидной») и получено положительное решение на способ получения средства, обладающего кардиопротекторным действием [5].
Выводы
Разработан способ получения сухого экстракта какалии копьевидной, позволяющий извлечь максимальное количество действующих веществ. В качестве оптимальных параметров выбраны: степень измельчения сырья 0,5-1,0 мм, двукратная спиртовая экстракция при комнатной температуре 70% этанолом при соотношении сырье : экстрагент 1 : (16-18) в течение 16 и 10 ч, и двукратная водная экстракция по 60 мин кипящей водой при соотношении сырье : экстрагент 1 : (15-20) с последующим объединением экстрактов, фильтрованием, объединением с водным остатком спиртового извлечения, упариванием и сушкой.
Список литературы
1. Заявка на патент России №2003114548/14 (015239): Способ получения средства, обладающего
кардиопротекторной активностью / Д.Н. Оленников, С.М. Николаев, А.В. Цыренжапов, Г.Г. Николаева и др. Заявл. 15.05.2003.
2. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1990. Вып. 2. С. 66.
3. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа //
Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №2. С. 118-129.
4. Смагунова А.Н. Способы оценки правильности результатов анализа // Журнал аналитической химии. 1997. Т. 52. №10. С. 1022-1029.
5. Заявка на патент России№ 2003114548/14 (015239). Способ получения средства, обладающего
кардиопротекторной активностью / Д.Н. Оленников, С.М. Николаев, А.В. Цыренжапов, Г.Г. Николаева и др. Заявл. 15.05.2003).
Поступило в редакцию 8 февраля 2004 г. После переработки 27 июня 2004 г.
