CC BY
22
УДК 615.071:543.42.061:615.31:543.41
РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ ПРОИЗВОДНОЙ ХИНАЗОЛИНА
Волокитина Д.С., Лазарян Д.С., Волокитин С.В.
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет», г. Пятигорск, Российская Федерация
Аннотация. Изучена возможность применения спектрометрии в инфракрасной области, хроматографии в тонком слое сорбента и химических реакций для подтверждения подлинности биологически активной субстанции. Изучено хроматографическое поведение в тонком слое сорбента и методы детектирования. Подобраны оптимальные системы растворителей. С помощью ИК - спектрометрии получены данные, которые определяют функциональные группы веществ, входящих в субстанцию. Разработаны методики определения биологически активной субстанции с помощью реакций соле-, комплексообразования и окисления-восстановления. Ключевые слова: биологически активное соединение, хиназолин, тонкослойная хроматография, инфракрасный спектр.
В настоящее время большинство людей, регулярно страдают заболеваниями, связанными с нарушением мозгового кровообращения. Для лечения этих заболеваний на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Волгоградского государственного медицинского университета было синтезировано биологически активное соединение (БАС) - производное хиназо-лин-4(3Н) -она: 3-[2 -(2-Метилфениламино) -2-ок-соэтил]-хиназолин-4(3Н)-он (лабораторный шифр: УМЛ-10-13). Предварительные доклинические исследования показали перспективность его применения в медицинской практике, в качестве ноотропного и противогипоксического лекарственного средства [2,3].
Цель работы. Разработка методик идентификации БАС УМЛ-10-13 методами ИК-спектро-фотометрии, ТСХ и химическими реакциями.
Материалы и методы. В качестве объекта исследования нами использовались 5 проб БАС УМЛ-10-13. По внешнему виду представляющие аморфный порошок белого цвета с розоватым оттенком, со специфическим запахом, умеренно
растворим в диметилформамиде, мало растворим в диметилсульфоксиде, очень мало растворим в этаноле, практически нерастворим в воде, хлороформе, ацетоне, гексане, пропаноле и бута-ноле.
Идентификацию БАС мы проводили с помощью физико-химических методов: спектрометрии в инфракрасной области и хроматографией в тонком слое сорбента и химическими реакциями [1].
Спектры поглощения в ИК-области измеряли на инфракрасном спектрофотометре ФУРЬЕ -ФСМ 1201. Образцы для записи готовили методом прямого прессования с калия бромидом. Спектры измеряли в режиме пошагового сканирования в диапазоне 1600-600 см-1. Определение проводили в шестикратной повторности, каждой пробы.
Хроматографирование проводили на пластинах Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ, которые имеют высокую степень активности. Хроматографирование проводили восходящим методом при комнатной температуре (15-25оС). На линию старта хрома-тографичекой пластины наносили с помощью
—--—
микрошприца 1 мкл спиртовых растворов в концентрации 2,5 ммг/мл. Хроматографические камеры предварительно насыщались парами растворителей в течение 30 мин. Зоны адсорбции изучаемого вещества на пластинах Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ детектировали с помощью реактива Драгендорфа, УФ-светом и парами йода. Хроматографирование в каждой системе растворителей проводили в шести повторностях.
Помимо физико-химических методов нами использовались реакции соле-, комплексообра-зования и окислителения-восстановления, отражающие химические свойства БАС УМЛ-10-13. В качестве реактивов окисления-восстановления использовали: Манделина, Марки, Фреде, азотную кислоту концентрированную, а для соле-, комплексообразования: железа(Ш) хлорида раствор 3%, кобальта нитрата раствор 5% и серебра нитрата раствор 2% [1]. Для объективной оценки полученных результатов опыты проводились параллельно с испытуемым и контрольным растворами. Определение чувствительности реакций проводили визуально и выражали в мкг/мл вещества в пробе.
Результаты и обсуждение. Метод спектрометрии в ИК области широко используется для идентификации субстанций, так как совокупность всех полос поглощения ИК-спектра вещества характеризует его индивидуальность.
В результате проведенных исследований нами были идентифицированы полосы поглощения вторичной амидной группы при 1680 - 1630 см-1, пиримидиновой группы при 1580 - 1520 см-в области 757 см полосы поглощения относящиеся к конденсированным ароматическим
Результаты определения хроматогр{
группам 2-аминохиназолина, в области 1324см-
к азотсодержащим группам у бензольного кольца, а также группа слабых полос в области 1100-1200 см-1, которые являются следствием деформационных колебаний С-Н связей.
Метод хроматографии в тонком слое сорбента в настоящее время широко применяется для определения подлинности органических соединений в фармацевтическом анализе. Данный метод обладает высокой чувствительностью, специфичностью, простотой в выполнении.
С целью выбора оптимальной подвижной фазы нами предварительно проводилось хрома-тографирование субстанции и двух предполагаемых примесей (1. Незамещенный хиназолин-4(3Н)-она; 2. 2-хлороацетамид) в индивидуальных растворителях различной диэлектрической проницаемостью.
После хроматографирования зоны адсорбции исследуемой субстанции детектировали с помощью УФ-света и с помощью цветореагентов - реактива Драгендорфа и паров йода.
В результате детектирования зон адсорбции получены следующие результаты:
- реактивом Драгендорфа - пятна оранжевого цвета;
- УФ-светом при 254 нм, наблюдаются четкие пятна сине-фиолетового цвета;
- парами йода четкого проявления пятен не наблюдали.
Результаты определения хроматографиче-ской подвижности субстанции в индивидуальных растворителях с различной диэлектрической проницаемостью приведены в таблице 1.
Таблица 1
!еской подвижности изучаемой БАС
Растворитель Диэлектрическая проницаемость [4] Rf
Уксусная кислота 6,15 0
Бутанол 17,1 0
Пиридин 12,3 0
Муравьиная кислота 58,5 0
Толуол 2,3 0,18±0,02
Вода 81 0
Пропанол 22,8 0
Изопропанол 18,3 0
Ацетонитрил 37,5 0
Бензол 2,3 0,15±0,01
Циклогексан 2,0 0,95±0,01
Этилацетат 6,1 0,59±0,01
—--—
Четырехлористый углерод 2,2 0,23±0,01
Гексан 1,89 0,11±0,02
Метанол 31,2 0
Хлороформ 5,2 0,70±0,01
Эфир 1,4 0,28±0,01
Раствор аммиака 25% 31,6 0
Диэтиламин 3,8 0,78±0,01
Как видно из таблицы 1, в апротонных растворителях БАС УМЛ-10-13, значение Rf исследуемой субстанции находится в пределах от 0,11 до 0,95, а в протеолитических растворителях проявляют нулевую подвижность.
В связи с тем, что зона адсорбции изучаемой субстанции находится в оптимальной области, значение Rf (0,59±0,01) в этилацетате, для разделения ее от предполагаемых примесей (0,37±0,02 и 0,85±0,02), нами в качестве подвижной фазы выбран данный растворитель. В качестве проявителя выбран УФ-свет.
Результаты хромогенных |
Кроме физико-химических методов нами были разработаны химические реакции для подтверждения подлинности исследуемой субстанции. Установлено, что окрашенные продукты окисления-восстановления образуются при взаимодействии исследуемой БАС со специальными реактивами на алкалоиды: Манделина, Марки, Фреде, азотной кислотой концентрированной.
В реакциях соле-, комплексообразования субстанция образует творожистые осадки: же-леза(Ш) хлорида раствор 3%, кобальта нитрата раствор 5% и серебра нитрата раствор. Полученные результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
сций на исследуемую БАС
Реактив Предел обнаружения Аналитический эффект
Реакции со специальными реактивами на алкалоиды
Реактив Манделина (раствор ванадата аммония и серная кислота концентрированная) 0,5 мкг малиновое окрашивание
Реактив Марки [1] (раствор фармальдегида в серной кислоте концентрированной) 2,0 мкг розовое окрашивание
Азотная кислота концентрированной 10 мкг желтое окрашивание
Реактив Фреде [1] (аммония молибдата раствор в серной кислоте концентрированной) 5 мкг розовое окрашивание
Реакции соле-, коплексообразования
Кобальта нитрата раствор 5% 5,0 мкг творожистый осадок розового цвета
Железа(Ш) хлорида раствор 3% 8,0 мкг творожистый осадок желтого цвета
Серебра нитрата раствор 2% 2 мкг творожистый осадок белого цвета
Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что для идентификации БАС УМЛ-10-13 могут быть предложены наиболее чувствительные реакции с реактивом Манделина (0,5 мкг) и раствором серебра нитратом 2% (2 мкг).
Выводы
1. Изучена хроматографическая подвижность БАС УМЛ-10-13 в тонком слое сорбента. Подобраны оптимальные условия: подвижная фаза - этилацетат, проявитель - УФ-свет позволяющие разделить и идентифицировать БАС УМЛ-10-13.
—--—
2. Проведен анализ ИК-спектров исследуемой субстанции, который позволил идентифицировать полосы поглощения, соответствующие определенным функциональным группам. Данный метод может быть предложен для подтверждения подлинности БАС УМЛ-10-13.
3. Проведен поиск химических реакций на изучаемую субстанцию с применением соле-, комплексообразования и окислительно-восстановительных реакций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная Фармакопея Российской Федерации. Изд. XIII. Т. 1. М., 2015. URL: http://feml.scsml.rssi.ru/feml.
2. Ноотропная активность амидов хиназолинового ряда / И.Н. Тюренков, А.А. Озеров, Е.Н. Шматова и др. // Хим-фармац. журнал.-2015.-Т.49, № 2.- С. 18-20.
3. Производные хиназолина, обладающие ноо-тропной и антигипоксической активностью: пат. 2507198 Рос. Федерация. № 2012138665/04; заявл. 10.09.2012; опубл. 20.02.2014. Бюл. № 5. - 12 с.
4. Справочник химика : в 6 т. Т. 3. - 2. изд. -Москва ; Ленинград: Химия, 1964. - 1008 с.
TO PROVIDE A METHOD OF DETERMINING THE AUTHENTICITY OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES QUINAZOLINE DERIVATIVES
Volokitina D.S., Lazaryan D.S., Volokitin S. V.
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University, Pyatigorsk, Russian Federation
Annotation. The possibility of application of IK - a spectophotometery, a chromatography in a lamina of sorbent and chemical reactions for confirmation of authenticity of the biologically fissile substance is studied. The chromatographic behavior in a lamina of sorbent and detecting methods is studied. Optimum systems of solvents are picked up. By means of an IK-spectroscopy, data, which define the functional groups of the substances entering substance, are obtained. Techniques of definition of the biologically fissile substance with the help sole-, a complexing and oxidation-reduction reactions are developed.
Key words: biologically active compound, quinazoline, thin-layer chromatography, infrared spectrum.
REFERENCES
1. Gosudarstvennaja Farmakopeja Rossijskoj Feder-acii. Izd. XIII. Vol. 1. Moscow, 2015. Available at: http://feml.scsml.rssi.ru/feml.
2. Nootropic Activity of Some Quinazoline Amides / I.N. Tyurenkov, A.A. Ozerov E.N. Shmatova and others
// Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2015-T. 49. № 2. pp. 88-90.
3. Quinazoline derivatives, possessing nootropic and antihypoxic activity: patent 2507198 Russian federation. № 2012138665/04; date of filing: 10.09.2012; date of publication: 20.02.2014 Bull. 5.- 12 pp.
4. Directory of Chemical: 6 vols. 3 - 2. ed. - Moscow; Leningrad: Chemistry, 1964. - 1008 p.
