CC BY
101
3). Вскрытые ампулы моноклональных антител в хо- тельном хранении получаются неспецифические ре-
лодильнике хранятся не более месяца, при более дли- зультаты.
Литература
1. Дерюгина Е.И., Савельев Ю.И., НосыровА.Е., Лапенков М.И., Николаева Т.Л. Применение иммуноферментного анализа для определения АВН антигенов в следах слюны и спермы. Суд.-мед. экспертиза. 1992. №2 С.23-26.
2.Лапенков М.И., Николаева Т.Л., Аборина Е.А. Получение, определение специфичности и применение моноклональных анти- Ье антител. Суд.- мед. экспертиза. 2000. №4. С.25-29
3. Лапенков М.И. Анти-АВН-ЬБУ18 моноклональные антитела получение, определение эптоной специфичности и применение в судебной медицине. Автореф. дисс... докт. мед. наук. - М. - 2002.
© Ю.А. Хомов, Н.В. Кокшарова, М.Дайех, В.П. Гаранин, 2004 УДК 340.67.615.212.7.074
Ю.А. Хомов, Н.В. Кокшарова, М.Дайех, В.П. Гаранин ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИМОВАНА
Пермская государственная фармацевтическая академия (ректор - проф. Г.И. Олешко),
ГУЗОТ "Пермское областное бюро судебно-медицинской экспертизы" (начальник - В.И. Перминов)
Предложены методики определения имована на основе хроматографии в тонких слоях сорбента, ИК-, УФ-, ГХ/МС спектроскопии, ВЭЖХ/УФ, применимые в химико-токсикологическом анализе.
Ключевые слова: имован, химико-токсикологический анализ.
Y.A. Chomov, N.V. Kokscharova, M. Dayeh, V.P. Garanin CHEMICAL AND TOXICOLOGICAL ANALYSIS OF IMOVANE
Perm
Methods for measuring imovane are suggested: thin-layer chromatography,high-pressure l iquid chromatographyultrtaviolet spectrophotometry, gas chromatography with mass selective detector can be used for identification imovane in chemical toxicological anal isys.
Keywords: imovane, chemical and toxicological analysis.
Общеизвестно, что сон обеспечивает продолжение жизни и, что очень важно, ее качество. Проблема имеет не только медицинские, но и социальные аспекты, важность которых трудно переоценить. Бичом человечества является так называемая инсомния, которая определяется как состояние затрудненного начала сна и его поддержания [1,2].
Инсомния - одна из главных составляющих нарушений цикла "сон - бодрствование" и встречается по данным одних авторов [5] у 28 - 45% популяции, являясь для них клинической проблемой, требующей лечения. Другие авторы считают, что нарушения сна отмечаются почти у половины населения мира [1].
Инсомния многопричинна и всегда является синдромом, "маской" других заболеваний. Причиной могут быть неврозы, психические заболевания, органические заболевания мозга, интоксикации (в том числе психотропными препаратами и алкоголем) и др. [6].
В большинстве случаев фармакотерапия инсомний направлена на "усыпление" больного и носит синдромологический характер. Существует значительное количество снотворных препаратов разных групп. Появление нового класса препаратов, производных циклопирролона стало значительным шагом в лечении инсомний [5, 6]. Первым представителем этого нового класса является имо-ван, который обладает выраженным снотворным, седативным, противосудорожным действием [7]. Показан для применения при инсомнии и вторичных нарушениях сна, особенно при психических расстройствах. Имован широко используется в медицинской практике и в настоящее время постепенно (совместно с производными бензодиазе-пина) вытесняет барбитураты. Однако любое некорректное, а порой неоправданное назначение этих лекарств может создавать значительные проблемы для больных [2,17]. Так имован в связи с побочными явлениями (спутанность сознания, антероградная амнезия, галлюцинации, кошмар-
ные сновидения) может быть использован в немедицинских целях. Побочное действие проявляется особенно сильно при превышении дозы. При совместном применении с препаратами с угнетающим действием на ЦНС (другие снотворные, седативные, наркотические, этанол и этанолсодержащие препараты) происходит взаимное усиление действия [9,10,11], что является причиной интоксикаций различной степени тяжести.
В соответствии с решением Постоянного комитета по контролю наркотиков Минздрава Российской Федерации зопиклон (имован) внесен в список № 1 сильнодействующих веществ, протокол № 2/85-2002 от 28.10.2002 (письмо № 2510/622-03-32 от 24.01 2003 г.)
По данным зарубежных авторов имован неоднократно был причиной острых и смертельных отравлений [15, 16]. Случай отравления имованом был доложен на Всероссийском совещании судебно-медицинских экспертов судебно-химических отделений БСМЭ (Д.Э.Бодрина, Р.Р.Краснова, Э.Н.Николаева и др.; сентябрь 2002 г., г. Владимир). Таким образом имован имеет токсикологическое значение.
В связи с необходимостью разработки методик химико-токсикологического анализа имована нами проведено комплексное аналитическое изучение его с использованием традиционных реакций осаждения, окрашивания в сочетании с современными физико-химическими методами (ВЭТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ИК-, УФ-спектроскопии).
По химической структуре имован является 6-(5-Хлор-2-пиридинил)-6,7-дигидро-7-оксо-5Н-пирроло [3,4в]пи-разин-5-иловый эфир 4-метил-1-пиперазинкарбоновой кислоты. Синонимы: Зопиклон, 2ор1с1опе, 2тоуапе. Выпускается в виде таблеток. Каждая таблетка имована, покрытая пленочной оболочкой, содержит по 7,5 мг зопик-лона. В блистере 5 или 20 таблеток [8]. Страна изготовитель - Франция. Зарегистрированы в России также таб-
летки, выпускаемые Испанией, Турцией, Латвией [3]. Отпускается по рецепту врача.
Экспериментальная часть
Было изучено отношение имована (стандартный раствор с концентрацией 1 мг/мл в хлороформе, этаноле, ацетоне) к общеалкалоидным осадительным реактивам, ком-
Таблица№1 Величины И имована в системах НФ-варианта на пластинках силуфол (данные из 5 определений)
плексным роданидам и иодидам металлов. С 12 из 23 исследованных реактивов имован дает аморфные осадки. Наиболее чувствительными являются реакции с реактивами Драгендорфа, Бушарда (предел обнаружения 0,56 мкг вещества в пробе) и реактивом Зонненшейна (5мкг). Осадков с кристаллическим строением не было получено ни с одним из примененных реактивов. Изучалась возможность применения для обнаружения имована реакций окрашивания. Исследовано отношение к 11 реактивам (включая кислоты концентрированные азотную, серную, реактивы Марки, Фреде, Манделина, Эрдмана и др.). Характерное окрашивание наблюдалось только с раствором п-
Таблица№2 Величины Римована в системах ОФ-варианта на пластинках плазмахром
диметиламинобензальдегида в кислоте серной концентрированной - от розовато-оранжевого до малиново-фиолетового (предел обнаружения -15 мкг вещества в пробе) и раствором ванилина в кислоте серной концентрированной при нагревании - фиолетовое окрашивание (10 мкг)
[4].
Исследована возможность доказательства имована методом хроматографии в тонком слое сорбента на пласти-нахВЭТСХ (силикагель КСК, фиксированный натрия силикатом), Мегск, Сорбфил, Силуфол. Первоначально в нормально-фазном (НФ) варианте в индивидуальных растворителях (был взят элюотропный ряд по Шталю, характеризующий изменение адсорбируемости вещества с изменением полярности растворителя), затем в различных 9
системах растворителей, в том числе скрининговых, применяемых в химико-токсикологических анализах лекарственных веществ.
Индивидуальные растворители использовали без насыщения камеры. Системы растворителей готовили энергичным встряхиванием компонентов в склянке с притертой пробкой. Время насыщения камеры 25 минут. Метчиком служил стандартный раствор имована с концентрацией 1 мг/мл в хлороформе.
Для детектирования зон локализации имована на хроматограммах использовали визуальное наблюдение в УФ-свете при 254 нм и обработку реактивом Драгендорфа (по Молдаверу). В УФ-свете (имован имеет собственное свечение) наблюдали зеленовато-желтые пятна. Чувствительность обнаружения 0,5 мкг. На силуфоле с флюоресцирующей добавкой чувствительность возрастала и составляла 0,01 мкг. При обработке реактивом Драгендорфа - коричневато-оранжевые пятна в местах расположения имована. Чувствительность обнаружения 0,5 мкг. При опрыс-
Таблица№3 Максимумы и минимумы абсорбции имована
в различных растворителях
Растворитель X тах/тіп, нм
Вода 305/248
0,1 М раствор кислоты хлористоводородной 305/246
0,1 М раствор натрия гидроксида 278/235
95% этанол 307/247
Хлороформ 308/270
Бензол 309/272
кивании 0,6% спиртовым раствором п-диметиламинобен-зальдегида в кислоте уксусной 4:1 обнаруживались желтые пятна. Чувствительность обнаружения 15 мкг.
Установлено, что в НФ варианте в исследованных 11 индивидуальных растворителях имован не обладает достаточной хроматографической подвижностью, оставаясь в основном вблизи стартовой линии (самые высокие значения Ш£в ацетоне 0,17, этаноле 0,31, метаноле 0,38, пиридине 0,42).
При исследовании в комбинированных системах растворителей хроматографическая подвижность имована проявляется в интервале Ш£от 0,13 до 0,56 (см. таблицу 1), при оптимальном значении 0,50 в общей универсальной скрининговой системе толуол - ацетон - этанол - 25% раствор аммиака 45:45:7,5:2,5; которая избрана нами в качестве базовой для анализа имована в биологических жидкостях.
В обращенно-фазном (ОФ) варианте использовали пластинки Сорбтон-2 (с привитой фазой С-2) и плазмахром (с привитой фазой С-3). В качестве элюентов использовались водно-спиртовые смеси без насыщения камеры парами растворителей. Длина пробега растворителя 8 см. Детектирование имована проводили теми же способами, что и в нормально-фазном варианте. В общей системе растворителей этанол - вода - 25% раствор аммиака 6:5,5:0,5 имована 0,55. При подтверждающем исследовании в частных системах (для отдельных групп соединений), отличающихся соотношением полярных компонентов, величина имована колеблется от 0,28 до 0,77 (см. табл. 2).
Четкие пятна и аналогичные значения Ш" наблюдались в обоих вариантах на каждом сорбенте как в зонах стандартного раствора, так и в зонах хроматографирования имована, выделенного из мочи в условиях модельного эксперимента [13].
№ п/п Система КГ
Общие
1 Метанол-25% р-р аммиака 100:1,5 0,40
2 Этанол-25% р-р аммиака 100:1,5 0,49
3 Хлороформ-25% р-р аммиака 25:15 0,35
4 Толуол-ацетон-этанол-25% р-р аммиака 45:45:7,5:2,5 0,50
5 Диоксан-хлороформ-ацетон-25% р-р аммиака 47,5:45:5:2,5 0,42
Частные
6 Хлороформ-метанол-этилацетат 85:10:5 0,13
7 Этилацетат-метанол-25% р-р аммиака 17:2:1 0,32
8 Хлороформ-метанол-этилацетат 60:4:2 0,48
9 Хлороформ-н-бутанол -25% р-р аммиака 70:40:5 0,56
№ п/п Система КГ
Общие
1 Этанол-вода-25% р-р аммиака 6:5,5:0,5 0,55
2 Этанол-25% р-р аммиака 100:1,5 0,62
Частные
3 Этанол-вода 1:1 (для произв. 1,4-бензодиазепина) 0,28
4 Этанол-вода-25% р-р аммиака 6:4:6 (для опиа- 0,68
тов)
5 Этанол-вода-25% р-р аммиака 8:4:0,5 (для произв. фенотиазина) 0,77
ВЭЖХ анализ проводили на отечественном приборе последнего поколения "Милихром А-02", характеризующемся 100% автоматизацией процесса, имеющем градиентную систему элюирования иУФ-спектрофотометрический детектор.
Аналитическая колонка 3x75 мм заполнена обращенно-фаз-ным сорбентом Силасорб 100-5С18 с зернением 5 мкм. В качестве подвижной фазы была выбрана смесь ацетонитрил (марки для ВЭЖХ) - вода очищенная 65:35, рН 3-4 (создается добавлением концентрированной кислоты фосфорной, контролируется по универсальному индикатору). Скорость потока элюента - 50 мкл/мин. Постоянная времени детекции 0,34 сек. Объем вводимой пробы на анализ 5 мкл. Детектирование проводили при длине волны 304 нм, соответствующей максимуму поглощения раствора имована в элюенте. Время удерживания имована в данных условиях 4,17±0,062 мин.
Предел обнаружения имована методом ВЭЖХ с фотометрической детекцией составляет 8,8 нг/мл.
Далее были изучены спектральные характеристики имована с применением методов УФ-, ИК-, ГХ/МС спектроскопии.
УФ-спектры 0,0016% стандартного раствора снимали на Specord-40-М в 1 см кюветах в интервале длин волн 220400 нм. Анализ электронных спектров в различных полярных и аполярных растворителях показал, что имован имеет УФ-спектры, характеризующиеся одной полосой поглощения с одним максимумом и одним минимумом. Данные приведены в таблице 3.
ИК-спектр, снятый на Specordв виде суспензии имована в вазелиновом масле в кювете с окнами из калия бромида в интервале от 400 до 4000 см-1 имел максимумы абсорбции при следующих частотах: 710,750,845,980,1090,1140,1240,1290,
1380,1440,1580,1710 см-1 (вспектренаиболеевыражены 12 полос поглощения в средней инфракрасной области с наличием валентных и деформационных колебаний).
ГХ/МС исследование проведено на хроматографе НР 5890 сер. 11, МСД НР 5972, колонка капиллярная НР-5МS, внутренний диаметр 0,25 мм, длина 20 м, газ-носитель - ге-
Литература
1. Вейн А.М. О сне / А.М.Вейн // Современная психиатрия. - 1998. - №3. - С.4-6.
2. Вейн А.М. Принципы современной фармакотерапии инсомнии / А.М.Вейн, Я.И.Левин //Ж. неврологии и психиатрии. - 1998. - №5. - С.39-42.
3. Государственный реестр лекарственных средств. М. :МЗ РФ, 2000. - 4.2. - С. 426.
4. Дайех М. К анализу имована / М.Дайех, Е.И.Пантелеева, Н.В.Кокшарова // Молодежная наука Прикамья - 2002. Тез. докл. обл. науч. конф. молодых ученых, студентов и аспирантов, Россия, Пермь, 2002. - Пермь, 2002. - С. 157.
5. Левин Я.И. Инсомния и принципы ее лечения /Я.И.Левин //Современная психиатрия.- 1998. - №3. - С.6-10.
6. ЛевинЯ.И. Проблема инсомнии в общемедицинской практике / Я.И.Левин, А.М.Вейн//Российский медицинский ж.- 1996. - №3. - С.16-19.
7. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д.Машковский. В 2 т. Т.1.-14-е изд.-М.: Новая Волна, 2000. -С. 32-33.
8. НД 42-1610-98. Таблетки имована 0,0075 г.
9. Николаева В.Б. Лекарственные препараты зарубежных фирм в России /В.Б.Николаева. М. :Астрафармсервис, 1993. - 295 с.
10.Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. - 2001. -8-е изд. - С. 336, 349, 800.
11.Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. М.:АстраФармСервис, 1999. -С. - Б 244.
12.Хомов Ю.А. Аналитическое изучение имована /Ю.А.Хомов, Н.В.Кокшарова, В.П.Гаранин, М.Дайех // 4еловек и лекарство: IXРос. нац. конгр. Москва, 2002. - М.: 2002. - С. 716-717.
13.Хомов Ю.А. Варианты ВЭТСХ в анализе имована /Ю.А.Хомов, Н.В.Кокшарова, М.Дайех//Науки о человеке. Матер. III конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 2002. - С. 240.
14.Хомов Ю.А. Спектральные характеристики имована / Ю.А.Хомов, Н.В.Кокшарова, М.Дайех, В.П.Гаранин // Науки о человеке. Матер. IVмеждународного конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 2003. - С. 198.
15. Analysis ofZopiclon (Imovane) in postmortem specimens by GC-MS and HPLC with diode-array detection / J. Van Bocxlaer, E.Meyer, K. Clauwaert, W.Lambert, M.Piette, A.DeLeenheer// J. Anal. Toxicol.-1996.-Vol20.-№1.-P. 52-54.
16.Boniface P.J. Two Cases of Fatal Zopiclone Overdose / P.J.Boniface, G.G.Russell // J. Anal. Toxicol.-1996.-Vol.20.-№2.-P.131-133.
17. Steinberg R. Агонисты бензодиазепиновых рецепторов золпидем и зопиклон: толерантность и потенциал к привыканию / R.Steinberg // Новые лекарственные препараты - 2002. - Вып. 4. - С. 25-40.
лий, скорость 1,0 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса 250° и 280°С, температура колонки градиент 70° (2 мин.) - 270°, скорость программирования 20° в минуту. Ввод пробы ручной, без деления потока газа-носителя. Объем введенной пробы 1 мкл в хлористом метилене при концентрации в растворе 100 мкг/мл. МСД работает в режиме электронного удара при 70 эВ. Получена хроматограмма (время удерживания имована 17,43 мин.) и проведена регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования от 40 до 500 аем. Характеристические ионы имо-вана при выделении фрагментограммы с временем удерживания 17,43 минуты - 143,245, 99, 112,217 m/z (данные приведены в порядке уменьшения интенсивности). При сравнении с масс-спектрами библиотек "NIST 98" и "WILEY 275K" (производство фирмы "Хьюлетт-Паккард") совпадение времени удерживания и масс-спектра с библиотечным составляло 95% [ 12,14].
Пригодность разработанных методик для химикотоксикологического анализа имована проверена в условиях модельного эксперимента при исследовании мочи. Для анализа использовали пробы мочи после добавления стандартных растворов имована и инкубации. При направленном анализе 20 мл мочи дважды экстрагировали хлористым метиленом по 10 мл после подщелачивания 25 % раствором аммония гидроксида до рН 10 и насыщения кристаллическим аммония сульфатом, на электровстряхива-теле по 10 минут. Слой органического растворителя отделяли, фильтровали через стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом, концентрировали в струе холодного воздуха до 10 мл, делили на аликвоты. Сухие остатки после удаления экстрагента растворяли в избранном растворителе и исследовали соответствующим методом.
Заключение.
Предложены условия выделения и обнаружения имо-вана из мочи методами хроматографии в тонком слое сорбента в НФ и ОФ-вариантах, ВЭЖХ, ИК-, УФ- и ГХ/МС-спек-троскопии.
