Разработка способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и в гена каппа-казеина Текст научной статьи по специальности «Животноводство и молочное дело»

УДК 515.11.

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПРОВЕДЕНИЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОИ ПЦР ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И В ГЕНА

КАППА-КАЗЕИНА

*Тюлькин С.В. - к.с.-х.н., зав. отдела; **Муратова А.В. - руководитель отдела; ***Хатыпов И.И. - вед. Специалист; Ахметов Т.М. - д.б.н., доцент; Равилов Р.Х. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой; *Вафин Р.Р. - д.б.н., науч. консультант * Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория, г. Казань **ООО «АМС Медиа», г. Москва ***ООО УК «Просто молоко», г. Казань Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана

e-mail: [email protected]

Ключевые слова: АС-ПЦР, ДНК, аллель, генотип, ген каппа-казеина, CSN3. Key words: AS-PCR, DNA, allele, genotype, kappa-casein gene, CS^.

Основной задачей молочного скотоводства является получение высокопродуктивных животных, дающих молоко с большим содержанием белка и обладающее хорошими технологическими свойствами. Однако селекционная работа, построенная на традиционных подходах, имеет, небольшой селекционный эффект. В настоящее время, с развитием молекулярной генетики и биологии, становиться возможным идентификация огромного числа генов. Выявление предпочтительных с точки зрения селекции генотипов позволит дополнительно к традиционному отбору животных проводить селекцию непосредственно на уровне ДНК [2].

(С<ХЛ3) однозначно ассоциируется с признаками белковомолочности и технологическими свойствами молока у крупного рогатого скота [3, 1], исследования, касающиеся этого гена являются актуальными. Наши исследования заключались в разработке способа АС-ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена С8И3.

Материал и методика

исследований. Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-№2, осуществлялась сорбционным способом (коммерческий набор «ДНК-сорб В», производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

В связи с тем, что ген каппа-казеина

Генотипирование крупного рогатого скота по гену CSN3 проводили методом АС-ПЦР. ПЦР проводили на программируемом 4-канальном амплификаторе «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащий буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5); 1,5 мМ MgCl2; 25 мМ KCl; 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100); 0,25 мМ dNTP; 1,0 ед. Taq ДНК полимеразы; по 1,0 мкМ праймеров A-F-d: 5-GGGGGCTGTTCACACACAAAAACAGTAGAG-3/, A-R-d: 5-GGGGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTCCG-37, B-F-d: 5-

CCCCCGTGAGCCTACAAGTACACCTACGAT-3, B-R-d: 5-CCCCCGAT-

GTCTCCTTAGAGTATTTAGCCC-3, все реактивы производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и 1 мкл ДНК-пробы. Режим был следующий: х1: 94 0С - 4 мин; х1: 72 0С - 7 мин; хранение: 4 0С Детекцию результатов АС-ПЦР

<40: 94 0С - 30 сек, 11 0С - 30 сек;

осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией

амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (X =

310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Результаты собственных

исследований. К одним из подходов к оценке аллельного полиморфизма гена СБЫЗ крупного рогатого скота относится изобретение «Способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина» (Р.Р. Вафин и др., 2008), являющееся ближайшим аналогом предлагаемого способа.

Нами разработан способ проведения аллель-специфичной ПЦР для

генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена СБЫЗ, включающий подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Тад ДНК полимеразы, 4-х аллель-специфичных праймеров; проведение ПЦР; детекцию

амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза;

отличающийся от ближайшего аналога изобретения тем, что, используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров, имеющие дополнительные некомплементарные ни к одному из аллелей гена СБЫЗ «ш18ша1;сЬ-нуклеотиды» в позиции -2 от 3-терминальных нуклеотидов праймеров.

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения аллель-специфичной ПЦР для

генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена СБЫЗ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации генотипов ввиду корректной интерпретации генерируемых аллель-специфичных ПЦР-продуктов (рисунок 1), сопоставимых с расчётными данными (рисунок 2).

М 1 2 3 4 5 6

300 Ьр_____ _ _

200 ьр^^^^ЗЛЯНШ^:4 Ьр

_ 156 Ьр

100 Ьр

Рисунок 1 - Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена

СБЫЗ

Обозначения:

М) ДНК-маркеры 100 Ьр (СибЭнзим);

1-2) генотип АА гена СБЫЗ кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 242 Ьр); 3-4) генотип АВ гена СБЫЗ кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 242/156 Ьр); 5-6) генотип ВВ гена СБЫЗ кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 156 Ьр).

Query: SfeiSfc : Query SbjgJ

Query SbjgJ Query SbjgJ

Query SbjgJ Query SbjgJ Query SbjgJ Query SbjgJ

Query SbjgJ Query SbjgJ Query SbjgJ

Bos taurus kappa casein ¡CSN3) gene, CSN3-A allele (A/M: AY 3 В О 2 2 В) Bos taurus kappa casein ¡CSN3) gene, CSM3-B allele (A/M: AY380229) 130 21 ТАОтдеттдсст^

1 301 7 .............................T..............................

Место посадки праймЕра В —F —d

13081 ад^даттс^

_13077 .....с......................................................

13141 AACT^JC&GTC^

13137 ......G.......T.............................................

Место посадки праймера В—R—d

13201

13197 ............................................................

132 SI GATGGATi^^

13257 ............................................................

13321 СУГОСТТСУГГТЯТСет

13317 ............................................................

13381

1337 7 ............................................................

Место посадки праймеjoa A—F —d. 1 34 4 1 СТ TGAAT СТаТТАВТ ТТ ТАТТ ТТ ACT ТС Т GTTC^AC^aCACAAAjACAG TAAAG TACAGTG T

_13437 ..........................С........................A........

13501

13497 ............................................................

13561 T GAGT ТТДЙАТЬТДТ TTTAAT T GTATAC CAGT ST TGTTOCÜCTTTM- TTTTGGTMLGAAT

13557

AG AAT GAAAG GAAACAAT GT T TC ACT CAT AG CAT TT TAT С TCAG G CAT CACT TOC GAAAG

13080 1307 6

13140 13136 13200 13196

13260 13256 13320 13316 13380 13376 13440 13436

13500 13496 13560 13556 13 620 1361 6

13680 1367 6

посадки прайкера A—R—d. Ç,T_1 e ly 13681 GC TGXATAAGGT T-AGGC Д.СС CAAA 13714 Sbjct 13677 A...................... 13710

Перечевь длетмутаииднщ праикеров:

A-F-dxS'-GGtSGGCTGiTTCaCACACAAAAACAGTAGAG-S'lSÜ H. )

A-R-dx5/-GGGGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTCCG-3'' (30 H. ) ( 3^ —CGAAAGGC TGTATAAGGTTAGGCACCCC CC— 5' )

B— F —d : 5 ' — CCCCCGTGAGCCTACAAGTACACCTACGAT— 3^(30 H.) _

B-R-dx5/-CCCCCGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGCCC-31' (30 H. } (3'-GGTCTAAATACTCTAAGGAGACATCGGG GG-Ö^ }

Интерпретация ПЦР—продуктов: 24 2 Ър = генотип АА гена QSN3 156 Ър = генотип ВВ гена QSN3 24 2/156 Ьр = генотип AB гена CSN3

Рисунок 2 - Участки посадки праймеров, используемых для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена СБЫЗ предложенным способом проведения аллель-

специфичной ПЦР

Вывод. Разработанный способ приемлемым и эффективным способом

проведения аллель-специфичной ПЦР с генотипирования гена каппа-казеина.

протоколом 2-х стадийной ПЦР является

ЛИТЕРАТУРА: 1. Ахметов, Т.М. Молочная продуктивность коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина / Т.М. Ахметов, С.В. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Ученые записки КГАВМ. - Том. 207. - Казань, 2011.- С. 51-57. 2. Зиннатова, Ф.Ф. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина (С8№) у коров холмогорской породы татарстанского типа / Ф.Ф. Зиннатова, А.М. Алимов, Ф.Ф. Зинатов // Учёные записки Казанской ГАВМ. - 2010. - Т. 204. - С. 93-98. 3. Калашникова, Л.А. Влияние полиморфизма генов молочных белков и гормонов на молочную продуктивность коров чёрно-пёстрой породы / Л.А. Калашникова, Я. А. Хабибрахманова, А.Ш. Тинаев // Доклады РАСХН. - 2009. - № 3. - С. 49-52. 4. Патент РФ на изобретение № 2337141 Способ проведение аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина / Р.Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, Р.Р. Вафин. - Приоритет изобретения 25.09.2006. - Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 27.10.2008. - Бюл. № 30.

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПРОВЕДЕНИЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И В ГЕНА

КАППА-КАЗЕИНА

Тюлькин С.В., Муратова А.В., Хатыпов И.И., Ахметов Т.М., Равилов Р.Х., Вафин Р.Р.

Резюме

Целью данной работы являлась разработка способа генотипирования крупного рогатого скота по гену CSN3 на основе аллель-специфичной ПЦР. Полученные результаты АС-ПЦР гена CSN3 крупного рогатого скота с разработанными праймерами являются удовлетворительными в плане точности идентификации генотипов.

AN INVENTION OF CATTLE GENOTYPING MEANS BY KAPPA-CASEIN GENE OF ALLELE-

SPECIFIC PCR FOR ALLELES A AND B

Tyulkin S.V., Muratova A.V., Khatipov I.I., Ahmetov T.M., Ravilov R.H., Vafin R.R.

Summary

The aim of this work was an invention of cattle genotyping means by CSN3 gene on the basis of allele-specific PCR. The derived results of AS-PCR by cattle CSN3 gene with invented primers are satisfactory by exact identification of genotypes.

УДК 636.085.16:636.2

ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНАЯ СПОСОБНОСТЬ КОРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КОРМОВЫХ ДОБАВОК «САПРОМИКС»

Файзрахманов Р.Н. - к.с.-х.н., доцент; *Шакиров Ш.К. - д.с.-х.н., профессор;

Файзрахманов Р.Н. - аспирант. Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана, * Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, г. Казань

тел.: (843)273-97-15

Ключевые слова: кормовая добавка, коровы, воспроизводство, молодняк. Key words: the feed additive, cow, reproduction, young animals.

Одним из основных путей снижения себестоимости продукции скотоводства наряду с совершенствованием

существующих пород, внедрением ресурсосберегающих технологий и комплексной механизации основных процессов является внедрение в кормление крупного рогатого скота современных кормовых добавок [2,3].

Перспективность использования биологически активных веществ

определяется тем, что данные добавки улучшают усвояемость кормов, повышают воспроизводительные качества и сохранность молодняка[1,4].

Цель исследований заключалась в изучении влияния кормовых добавок «Сапромикс» на показатели

воспроизводства коров.

Материал и методы исследований.

Материалами исследований стали белково-витаминно-минеральный концентрат

«Сапромикс» (БВМК) и амидо-витаминно-минеральный концентрат «Сапромикс» (АВМК), изготовленные на основе минерала сапропель месторождения оз. Белое Тукаевского района Республики Татарстан; коровы холмогорской породы.

Для решения поставленной цели нами, был проведен научно-хозяйственный опыт на базе ООО «Дусым» Атнинского района Республики Татарстан. По принципу аналогов были отобраны 3 группы коров по 10 голов в каждой с учетом породности, возраста, живой массы, уровня молочной продуктивности и физиологического