РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ КАПСУЛЬНОЙ МАССЫ БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА МАТЕМАТИЧЕСКОГО ПЛАНИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

@ (D

УДК 615.014.64

RESEARCH ARTICLE 3. Medical sciences

Corresponding Author: Shilova Ekaterina - competitor, Perm state pharmaceutical Academy, Perm, Russian Federation.

E-mail: eketl981@mail.ru

© Shilova E.G., Mokin P.A., Nikolaeva A.M., Neschislyaev V.A., Krasilnikov A.N., - 2023

| Accepted: 30.06.2023

http://dx.doi.org/Z10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-6-12-17

РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ КАПСУЛЬНОИ МАССЫ БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА МАТЕМАТИЧЕСКОГО ПЛАНИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Шилова Е.Г., Мокин П.А, Николаева А.М., Несчисляев В.А., Красильникова А.Н.

ФГБОУВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация Аннотация. Представленная статья демонстрирует применение метода математического планирования эксперимента (МПЭ), в разработке состава лиофилизированной капсульной массы биофармацевтической композиции, обладающей антимикробным и пробиотическим действием. Были исследованы факторы технологического процесса, влияющие на качественные показатели капсульной массы биофармацевтической композиции: носители для иммобилизации, желудочно-резистентные формообразователи, антифрикционные вещества. В работе изучены бактериотропные свойства лиофилизированной капсульной массы биофармацевтический композиции, к которым относятся антимикробная активность, желудочная резистентность, пробиотическая активность, а также такие технологические свойства, какраспадаемость и остаточная влажность Важными для лиофилизированной капсульной массы биофармацевтической композиции являются антимикробная и пробиотическая активность, определяющие терапевтическую направленность композиции, а изучение таких показателей капсульной массы как желудочная резистентность и распадаемость являются критичными свойствами, поскольку композиция содержит в своем составе бактериофаг, лабильный к действию кислот. Кроме того, на стабильность фармацевтической субстанции в процессе хранения лиофилизированной капсульной массы оказывает остаточная влажность. Для обеспечения сохранности бактериотропных свойств биофармацевтической композиции основной целью являлось создание биополимерной защитной матрицы, где ключевыми задачами выступили подбор рецептуры и технология введения вспомогательных веществ. В заключении сделан вывод о наиболее приемлемом модельном составе и оптимальной технологии изготовления капсульной массы биофармацевтической композиции.

Ключевые слова: метод математического планирования эксперимента, биофармацевтическая композиция.

DEVELOPMENT OF THE COMPOSITION AND TECHNOLOGY OF THE CAPSULE MASS OF A BIOPHARMACEUTICAL COMPOSITION USING THE METHOD OF MATHEMATICAL PLANNING OF THE EXPERIMENT

Shilova E.G., Mokin P.A., Nikolaeva A.M., Neschislyaev V.A., Krasilnikova A.N.

Perm state pharmaceutical Academy, Perm, Russian Federation

Abstract. The presented article demonstrates the application of the method of mathematical design of the experiment (MPE) in the development of the composition of the lyophilized capsule mass of a biopharmaceutical composition with antimicrobial andprobiotic effects. The factors of the technological process that affect the quality indicators of the capsule mass of the biopharmaceutical composition were studied: carriers for immobilization, gastro-resistant formers, antifriction substances. The work studied the bacteriotropic properties of the lyophilized capsule mass of the biopharmaceutical composition, which include antimicrobial activity, gastric resistance, probiotic activity, as well as technological properties such as disintegration and residual moisture. Particularly important for the lyophilized

2023. Vol. 25. № 6

Issue Doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-6

E-ISSN 2686-6838

capsule mass of the biopharmaceutical composition are the indicators of antimicrobial and probiotic activity, since they determine the therapeutic orientation of the composition, and the study of such indicators of the capsule mass as gastric resistance and disintegration are among the most critical properties, since the composition contains a bacteriophage, labile to the action of acids and, accordingly, to ensure the preservation of the bacteriotropic properties of the biopharmaceutical composition, the central task was to create a protective shell, in this regard, the method of introducing excipients is a key factor. Residual moisture for lyophilized capsule mass has a major impact on the stability of the pharmaceutical substance during storage, in connection with this, this indicator was studied in this experiment. Achieving all acceptable values for creating a gastro-resistant composition is based on the correct selection of the formulation. Based on the data obtained, partial and generalized Harrington desirability functions were calculated. In conclusion, a conclusion was made about the most acceptable model composition and the optimal technology for manufacturing the capsule mass of the biopharmaceutical composition.

Keywords: mathematical experiment planning method, analysis of variance, Harrington's desirability function, biopharmaceutical composition.

Введение. Современные исследования, охватывающие последнее десятилетие, подтвердили факт, зависимости состояния желудочно-кишечного тракта от работы организма человека в целом. Важно отметить, что состояние иммунной системы макроорганизма зависит от микрофлоры кишечника [1]. Разработка комплексных препаратов, сочетающих антибактериальную и

пробиотическую активность, уровень которой будет достаточным для обеспечения эффективности лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, представляется весьма перспективным.

На сегодняшний день известна биофармацевтическая композиция в виде раствора в состав которой входит комплексный бактериофаг и экзометаболиты пробиотических бактерий с доказанным симбиотическим типом взаимодействия указанных компонентов. Установлено, что данная композиция оказывает достоверно высокий пробиотический эффект и обладает качественно новым сочетанным (специфическим и неспецифическим)

антимикробным действием.

В настоящее время безопасным, удобным и экономичным методом доставки лекарств, является пероральный путь введения. В случае содержания в составе жидкого перорального препарата лабильного к действию желудочного сока компонента, возникает необходимость разработки защитного состава, обеспечивающего адресную доставку лекарственного препарата. При разработке новых лекарственных форм часто изучаются закономерности, действующие в процессе изготовления для получения требуемого терапевтического эффекта, обеспечивающие оптимальные фармако-технологические

показатели качества.

Важнейшей задачей технологической подготовки фармацевтического производства является проектирование технологического

лиофилизированной биофармацевтической антимикробная и

процесса, решить которую позволяет использование моделей и моделирования.

Метод математического планирования эксперимента в технологии производства лекарственных препаратов является экспрессным и экономичным, что позволяет изучить влияние наиболее значимых параметров без фактических затрат, варьировать все факторы одновременно и получать количественные оценки основных эффектов взаимодействия, оценить влияние нескольких факторов на зависимую величину, а также значительно уменьшить ошибку эксперимента и количественно оценить влияние различных факторов на критерии оптимизации [2].

Важными для капсульной массы композиции являются пробиотическая активность, определяющие терапевтическую направленность композиции, а изучение таких показателей капсульной массы как желудочная резистентность и распадаемость являются критичными свойствами, поскольку композиция содержит в своем составе бактериофаг, лабильный к действию кислот. Кроме того, на стабильность фармацевтической субстанции в процессе хранения лиофилизированной капсульной массы оказывает остаточная влажность. Для обеспечения сохранности бактериотропных свойств биофармацевтической композиции основной целью являлось создание биополимерной защитной матрицы, где ключевыми задачами выступили подбор рецептуры и технология введения вспомогательных веществ.

Данная капсульная масса может быть использована для получения капсулированной формы и, тем самым, позволит расширить ассортимент «адресных» отечественных комплексных препаратов, направленных на профилактику и лечение заболеваний желудочно-кишечного тракта на Российском фармацевтическом рынке.

Цель работы - создание биополимерной желудочно-резистентной капсульной массы биофармацевтической композиции на основе экзометаболитов пробиотических культур и бактериофага с применением метода математического планирования эксперимента (методом четырехфакторного дисперсионного анализа).

Материалы и методы. Субстанция: биофармацевтическая композиция на основе метабиотика и бактериофагов; вспомогательные вещества: носители для иммобилизации: микрокристаллическая целлюлоза Microcel® MC 102 (Qiangdao, Китай), крахмал картофельный, хч (Merck KGaA, Германия); желудочно-резистентные формообразователи: натрия альгинат 500 (PanreacApplichem, (Ph. Eur.), метилцеллюлоза, средн. MN ~41,000 (ООО "Сигма-фарма", Россия); антифрикционные вещества: тальк тонкоизмельченный порошок чда фарм. (Merck KGaA, Германия), магний стеарат чда фарм. (Honeywell, США), каолин тяжелый, порошок фарм. (Honeywell, США); кальция карбонат осажденный, p.A. (neoFroxx, Германия)-обеспечивает биопротекторный эффект при сушке бактериофагов [3, 4].

Каждая серия исследований реализована в 3 повторениях, что позволило снизить ошибку эксперимента и установить взаимодействие между уровнями факторов. В случаях, когда экспериментальное значение критерия Фишера больше табличного, делали выводы о значимости изучаемого фактора [5]. Все группы вспомогательных веществ (кроме кальция карбоната осажденного) были разделены на уровни факторов, которые исследовали методом четырехфакторного эксперимента на основе греко-латинского квадрата [2,5]. Критериями оптимизации выступали следующие показатели биофармацевтической композиции в виде лиофилизированной капсульной массы (у): y1 -Антимикробную активность определяли по методу Аппельмана в отношении бактерий, гомологичных бактериофагам в соответствии с ОФС.1.7.1.0002.15 «Бактериофаги», значения выражали в процентах от исходного значения; y2 - Желудочную резистентность определяли согласно ОФС.1.4.2.0014.15 «Растворение для твердых дозированных лекарственных форм». Исследование проводили в два этапа. В качестве

жидкой среды на первом этапе использовали 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты, выдерживали 1 ч. На втором этапе кислоту заменили на мясо-пептонный бульон и далее желудочную резистентность определяли титрацией по методу Аппельмана в отношении бактерий, гомологичных бактериофагам в соответствии с 0ФС.1.7.1.0002.15

«Бактериофаги», результат выражали в процентах от исходного значения; y3 - Пробиотическую активность оценивали в отношении модельных представителей нормофлоры макроорганизма, включая штаммы Bifidobacterium bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3, в эксперименте Стимулирование метаболической активности бактериальных культур. Для определения влияния исследуемых препаратов на рост клеток в питательную среду (0,5% стерильный раствор глюкозы) в объеме 24 мл вносили 3 мл исследуемого образца и такой же объем жидкой культуры лакто- или бифидобактерий, предварительно

подготовленной путем регидратации препарата «Лактобактерин сухой» или «Бифидумбактерин сухой» (Россия) в 5 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида.. Полученную взвесь выдерживали в термостате при температуре 37±1°С в течение 48 ч. В качестве контроля вместо препарата использовали физиологический раствор в аналогичном объеме. Стимулирование метаболической активности бактериальных культур оценивали по изменению показателя оптической плотности (D) на спектрофотометре UV-2700 Shimadzu 50061-12 (Япония) в кювете с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм. Уровень стимуляции бактериальных культур выражали в процентах от исходного значения; y4 - Потерю в массе при высушивании определяли согласно ОФС.1.2.1.0010.15.

Сублимационное высушивание

капсулируемой массы проводили в сублимационной установке LZ 45-27 (Чехия) при вакууме от 4,0 до 13,3 Па в течение 20 часов, замораживание проводили в низкотемпературной камере «Rewco» (США) при температуре минус 35±5 °С. Повышение температуры продукта происходило не более, чем на 5°С в час.

Чтобы упростить обработку результатов исследовании по использованию МПЭ использовали программирование

вычислительной процедуры в режиме Microsoft Excel.

Таблица 1

Факторы и их уровни, которые изучали в процессе оптимизации технологии лиофилизированной капсульной массы биофармацевтической композиции.

Факторы

Уровни факторов

Примечание

А - носитель для иммобилизации а1 - отсутствует а2 - микрокристаллическая целлюлоза аз - крахмал картофельный а4 - крахмал картофельный + микрокристаллическая целлюлоза (1:1) Содержание в составе лиофилизированной капсульной массы до 10 %

В - желудочно-резистентный формообразовате ль в1 - отсутствует в2 - метилцеллюлозацеллюлоза вз - натрия альгинат в4 -натрия альгинат + метилцеллюлоза (1: 1) Содержание в составе лиофилизированной капсульной массы до 10 %

С - антифрикционно е вещество с1 - отсутствует с2 -тальк сз - магния стеарат с4 - каолин Содержание в составе лиофилизированной капсульной массы до 1%

Кальция карбонат осажденный добавляли в каждый состав для обеспечения биопротекторного эффекта при сушке [2, 4] Содержание в составе лиофилизированной капсульной массы до 60%

D - способ введения компонентов ё1 - сначала смешивают сухие вспомогательные вещества, затем вводят в биофармацевтическую композицию; - отдельно каждое вспомогательное вещество смешивают с частью биофармацевтической композиции, перемешивают, затем объединяют части; ё3 - одновременно все вспомогательные вещества вводят в биофармацевтическую композицию при постоянном перемешивании; ё4 - последовательно вводят вспомогательные вещества в препарат, перемешивая после каждого добавления Гомогенизируют до однородной массы

Table 1

Factors and their levels that were studied in the process of optimizing the technology of lyophilized capsule mass

Factors Factor levels Note

А - carrier for immobilization ai - absent a2 - microcrystalline cellulose a3 - potato starch a4 - potato starch + microcrystalline cellulose (1: 1) The content in the composition of the lyophilized capsule mass is up to 10%

В - gastro-resistant coating вl - absent B2 - methylcellulose cellulose вз - sodium alginate B4 - sodium alginate + methylcellulose (1:1) The content in the composition of the lyophilized capsule mass is up to 10%

С - antifriction agent d - absent C2 -talc C3 - magnesium stearate C4 - kaolin The content in the composition of the lyophilized capsule mass is up to 10%

Precipitated calcium carbonate was added to each formulation to provide a bioprotective effect upon drying. [3, 4] The content in the composition of the lyophilized capsule mass is up to 10%

D - method of introducing components di - - first, dry excipients are mixed, then they are introduced into the biopharmaceutical composition; d2 - separately, each excipient is mixed with a part of the biopharmaceutical composition, mixed, then the parts are combined; d3 - simultaneously all excipients are introduced into the biopharmaceutical composition with constant stirring; d4 - sequentially introduce excipients into the preparation, mixing after each addition Homogenize until smooth

Результаты и их обсуждение. Согласно плану эксперимента получено 16 модельных составов лиофилизированной капсульной массы биофармацевтической композиции путем введения в состав биофармацевтической композиции в виде раствора вспомогательных веществ: иммобилизирующий носитель,

желудочно-резистентный формообразователь, кальция карбонат осажденный.

Лиофилизированную капсульную массу опудривали антифрикционным веществом.

При изучении влияния вспомогательных веществ на биотехнологические свойства капсульной массы биофармацевтической

композиции с помощью дисперсионного анализа, расчетного значения критерия Фишера и множественного сравнения показало, что иммобилизирующим носителем является микрокристаллическая целлюлоза. Значимыми для желудочной резистентности

лиофилизированной капсульной массы биофармацевтической композиции выступили факторы А, В и D ^расч^табл). Множественное сравнение показало, что желудочную резистентность компонентов лиофилизированной капсульной массы композиции обеспечивают наличие микрокристаллической целлюлозы, натрия альгината, смешанного в равной пропорции с метилцеллюлозой и кальция карбоната при следующим порядке введения компонентов: отдельно каждое вспомогательное вещество смешивают с частью

биофармацевтической композиции, тщательно перемешивают, затем объединяют части и снова перемешивают до гомогенного состояния с последующим высушиванием до остаточной влажности не более 4%. В связи с этим общий ранжированный ряд преимуществ факторов для оптимальной литической активности после выдерживания в течение 1 часа в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной имеет вид: А = В = D > С. Ранжированный ряд преимуществ для максимальной пробиотической активности полученной капсульной массы обеспечивается при следующем распределении факторов: А > В > D > С, что указывает на значимость всех 4 факторов. Зависимость всех откликов от приведенных факторов по биофармацевтическим и технологическим параметрам представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатель Уровень факторы Приоритеты уровней факторы Цифровой показатель Ранжированный ряд преимуществ факторов

Антимикробная активность, отрицательная степень десятичного разведения A а2 > а4> аз= ai iQ-6,00±0,00 A=B=D > C

B Ьз > b2= b4> bi

C С4=С2 = С3 > Ci

D di>d2> d3= d4

Антимикробная активность после воздействия в 0,1М HCl, отрицательная степень десятичного разведения A a2=a4> a3=ai 1Q-4,17±0,69 A=B=D > C

B Ьз > b4 > b2> bi

C C4=C2 = C3 > Ci

D di> d2> d3= d4

Пробиотическая активность, оптическая плотность A a2> a4> a3 = ai 0,36 ± 0,01 A> B> D> C

B bi > b2 > b3 > b4

C Ci > C2 > C3 > C4

D di > d2 > d3 > d4

Потеря в массе при высушивании, % A a4 > a3 > a2> ai 1,3 ± 0,02 C =D > A =B

B b4> Ьз=Ь2 > bi

C C2= C3= C4 > Ci

D d2 > di > d3= d4

Table 2 Dependence of indicators of lyophilized capsule mass of biopharmaceutical composition

Index Level factors Priority levels factors Digital indicator Ranked number of benefits factors

Antimicrobial activity, negative decimal dilution A а2 > а4> а3= а! iQ-6,00±0,00 A=B=D > C

B b3 > b2= b4> bi

C C4=C2 = C3 > Ci

D di>d2> d3= d4

Antimicrobial activity after exposure to 0,1 M HCl, negative decimal dilution A а2=а4> aз=al 1Q-4,17±0,69 A=B=D > C

B b3 > b4 > b2> bi

C C4=C2 = C3 > Ci

D di> d2> d3= d4

Probiotic activity, optical density A a2> a4> a3 = ai 0,36 ± 0,01 A> B> D> C

B bi > b2 > b3 > b4

C Ci > C2 > C3 > C4

D di > d2 > d3 > d4

Weight loss on drying, % A a4 > a3 > a2> ai 1,3 ± 0,02 C =D > A =B

B b4> Ьз=Ь2 > bi

C C2= C3= C4 > Ci

D d2 > di > d3= d4

Действующее вещество:

Лиофилизированная

биофармацевтическая

композиция

Вспомогательные вещества:

метилцеллюлоза

натрия альгинат + микрокристаллическая целлюлоза (1:1)

кальция карбонат Магния стеарат

0,066 г

0,02г (8%)

0,02 г (8%) (0,01 г+0,01 г)

0,148 г (59,2%) 0,006 г (0,8%)

Получение капсульной массы включает в себя операции добавления компонентов защитной среды в биофармацевтическую композицию, гомогенизацию, замораживание, лиофильное высушивание, измельчение массы

для капсулирования, опудривателем.

смешивание

Выводы. Таким образом, методом математического планирования эксперимента и комплексом технологических и

биофармацевтических исследований подобран оптимальный качественный и количественный желудочно-резистентный состав, разработана рациональная технология получения

лиофилизированной капсульной массы биофармацевтический композиции, обладающей антимикробным и пробиотическим действием. Разработанная капсульная масса может быть использована для получения капсулированной формы и позволит расширить ассортимент «адресных» отечественных комплексных препаратов, направленных на профилактику и лечение заболеваний желудочно-кишечного тракта.

REFERENCES

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

[1]. Antipov M. O., Mindlina A. Ya. Diseases of the digestive organs of infectious and non-infectious nature. epidemiological relationship. // Epidemiology and vaccine prevention. - 2019; No. 1, - S. 55 - 66.

[2]. Chowdary K.P.R. Optimization of Pharmaceutical Product Formulation by Factorial Designs: Case Studies / K.P.R. Chowdary, K.R. Shankar // Journal of Pharmaceutical Research. - 2016. - T. 5. - No. 4. - S. 105-109

[3]. Kriss A.E., Didenko S.I. // Bulletin of experimental biology and medicine. - 1944. V. XVIII No. 4-5. pp. 25-28.

[4]. Chernov N.V. // Bacterial and viral preparations: Proceedings of the Ufa NIIVS them. I.I. Mechnikov. Ufa: Bashkir book publishing house. - 1968. No. 9. S. 218 - 221.

[5]. Belikov V.G., Ponomarev V.D., Kokovkin-Shcherbak N.I. Application of mathematical planning and processing of experimental results in pharmacy. - M.: Medicine, 1973. - 232 p.

[1]. Антипов М. О., Миндлина А. Я. Болезни органов пищеварения инфекционной и неинфекционной природы. Эпидемиологическая взаимосвязь. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2019; № 1, - С. 55 - 66.

[2]. Chowdary K.P.R. Optimization of Pharmaceutical Product Formulation by Factorial Designs: Case Studies / K.P.R. Chowdary, K.R. Shankar // Journal of Pharmaceutical Research. - 2016. - Т. 5. - №. 4. - С. 105-109

[3]. Крисс А.Е., Диденко С.И. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1944. Т. XVIII № 4-5. С. 25-28.

[4]. Чернов Н.В. // Бактерийные и вирусные препараты: труды Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова. Уфа: Башкирское книжное издательство. - 1968. № 9. С. 218 - 221.

[5]. Беликов В.Г., Пономарев В.Д., Коковкин-Щербак Н.И. Применение математического планирования и обработка результатов эксперимента в фармации. - М.: Медицина, 1973. - 232 с.

Author Contributions. Shilova E. G. - the concept and design of the study, writing the text of the article; Mokin P.A. - conducting the experimental stage of the study, Nikolaeva A.M., Neschislyaev V.A., Krasilnikova A.N. - literature review and writing the text of the article.

Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.

Shilova E.G. - ORCID: 0000-0002-0001-6649

Mokin P.A. - SPIN ID: 9083-2415; ORCID ID: 0000-0001-9801-2883

Nikolaeva A.M. - ORCID: 0000-0002-3160-518X

Neschislyaev V.A. - ORCID: 0000-0002-8163-0674.

Krasilnikova A.N. - SPIN ID: 3437-6550; ORCID: 0000-0003-3507-5005_

For citation: Shilova E.G., Mokin P.A., Nikolaeva A.M., Neschislyaev V.A., Krasilnikova A.N., DEVELOPMENT OF THE COMPOSITION AND TECHNOLOGY OF THE CAPSULE MASS OF A BIOPHARMACEUTICAL COMPOSITION USING THE METHOD OF MATHEMATICAL PLANNING OF THE EXPERIMENT. // Medical & pharmaceutical journal "Pulse". -2023;25(6): 12-17. http://dx.doi.org//10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-6-12-17.

Вклад авторов. Шилова Е.Г. - концепция и дизайн исследования, написание текста статьи; Мокин П.А. - проведение экспериментального этапа исследования, Николаева А.М., Несчисляев В.А., Красильникова А.Н. - обзор литературы и написанье текста статьи.

Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Шилова Е.Г. - SPIN ID: 2155-4079; ORCID: 0000-0002-0001-6649.

Мокин П.А. - SPIN ID: 9083-2415; ORCID: 0000-0001-9801-2883

Николаева А.М. - ORCID: 0000-0002-3160-518X.

Несчисляев В.А. - ORCID: 0000-0002-8163-0674.

Красильникова А.Н. - SPIN ID: 3437-6550; ORCID: 0000-0003-3507-5005._

Для цитирования: Шилова Е.Г., Мокин П.А, Николаева А.М., Несчисляев В.А., Красильникова А.Н. РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ КАПСУЛЬНОЙ МАССЫ БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА МАТЕМАТИЧЕСКОГО ПЛАНИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". 2023;25(6):12-17. http://dx.doi.org//10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-6-12-17.

с