РАСШИРЕНИЕ СФЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТЕСТА ИНГИБИРОВАНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

medical & pharmaceutical

JOURNAL "PULSE"

2022. Vol.24. №4

SCIENTIFIC ARTICLE 3. Medical sciences

Corresponding Author: Hohryakova Maria Dmitrievna - third-year graduate student, Perm state pharmaceutical Academy, Perm

E-mail: skakodub1997@mail.ru

© Hohryakova M.D., Shilova E.G., Neschislyaev V.A., Fedorova T.V., Orlova E.V., Mokin P.A.- 2022

Received: 10.03.2022 | Accepted: 19.04.2022

Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-4-138-142

EXPANDING THE SCOPE OF THE BIOLUMINESCENCE INHIBITION TEST

Hohryakova M.D., Shilova E.G., Neschislyaev V.A., Fedorova T.V., Orlova E.V., Mokin P.A.

Perm state pharmaceutical Academy, Perm, Russian Federation

расширение сферы применения теста ингибирования биолюминесценции

Хохрякова М.Д., Шилова Е.Г., Несчисляев В.А., Федорова Т.В., Орлова Е.В., Мокин П.А.

ФГБОУВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация

Abstract. Rapid and economical tests based on the bioluminescence inhibition reaction of genetically engineered strains with an integrated luminescence gene have found practical application in various fields, including toxicology, ecology, and bacteriology. Their diagnostic potential suggests a wider use in determining the bacteriotropic properties of a wide range of substrates and preparations of various origins. In this work, we tested a testing method using the Escherichia coli lum+ indicator strain with an integrated lux-operon to determine the nonspecific antibacterial activity of bacteriophages and a preliminary assessment of the prebiotic properties of the plant substrate, an aqueous extract of oats. As a well-known model, a metabolite preparation was used - a cell-free ultrafiltrate of the culture liquid of lactobacilli of the Lactobacillus plantarum 8P-A3 strain with a pronounced inhibitory activity. It has been established that the reaction of the test culture makes it possible to determine the stimulating or inhibitory effect on bioluminescence, as well as its dose dependence. The change in the luminescence of the indicator strain under the influence of bacteriophages developed similarly, including the transition from luminescence quenching in the initial period of joint exposure to its stimulation later by 24 h. physiological state of the test strain in the first hours ofjoint exposure followed by luminescence stimulation. It seems rational to consider the indicator strain in the study of plant substrates as a model representative of the microbiota of the gastrointestinal tract of a macroorganism. Thus, the tested version of testing can be recommended for determining the bacteriotropic properties of the studied and similar objects.

Аннотация. Экспрессные и экономичные тесты на основе реакции ингибирования биолюминесценции генно-инженерных штаммов со встроенным геном свечения нашли практическое применение в различных сферах, включая токсикологию, экологию, бактериологию. Их диагностический потенциал предполагает более широкое использование при определении бактериотропных свойств широкого спектра субстратов и препаратов различного происхождения. В данной работе апробирована методика тестирования с применением индикаторного штамма Escherichia coli lum+ со встроенным lux-опероном для определения неспецифической антибактериальной активности бактериофагов и предварительной оценки пребиотических свойств растительного субстрата -водного извлечения овса посевного. В качестве известной модели использовали метаболитный препарат - бесклеточный ультрафильтрат культуральной жидкости лактобактерий штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3 c выраженной ингибирующей активностью. Установлено, что реакция тест-культуры позволяет определить стимулирующий или угнетающий эффект воздействия на биолюминесценцию, а также его дозозависимоть. Изменение свечения индикаторного штамма при воздействии бактериофагов развивалось аналогично, включая переход от гашения люминесценции в начальный период совместной экспозиции к ее стимуляции в последующем к 24 ч. Выявленная неспецифическая антибактериальная активность бактериофагов значительно уступает ингибирующему эффекту экзометаболитного комплекса лактобактерий, а препарат овса посевного не оказывает влияния на физиологическое состояние тест-штамма в первые часы совместной экспозиции с последующей стимуляцией свечения. Представляется рациональным индикаторный штамм при исследовании растительных субстратов рассматривать в качестве модельного представителя микробиоты желудочно-кишечного тракта макроорганизма. Таким образом, апробированный вариант тестирования может быть рекомендован для определения бактериотропных свойств исследованных и аналогичных объектов.

medical & pharmaceutical

JOURNAL "PULSE"

2022. Vol.24. №4

Key words: inhibition, bioluminescence, bacteriotropic activity, bacteriophages, plant substrates.

Ключевые слова: ингибирование, биолюминесценция, бактериотропная активность, бактериофаги, растительные субстраты.

Введение. Спектр биологической активности большого количества препаратов различного происхождения включает, в том числе, и их бактериотропные свойства ингибирующего или стимулирующего характера по отношению к микробиоте человека. Эффект такого воздействия можно определить с помощью различных тестов, включающих прямое или опосредованное влияние исследуемого препарата на индикаторные культуры [3]. Тест ингибирования биолюминесценции генномодифицированного штамма Escherichia coli, обладающего способностью свечения, относится к доступным и объективным способам контроля токсичности различных веществ, а также антагонистической активности пробиотиков [1,2]. Вызывает интерес изучение пригодности данного теста для определения влияния субстратов растительного происхождения, а также неспецифических компонентов препаратов бактериофагов на физиологическое состояние штамма-индикатора для комплексной оценки их бактериотропных свойств. В настоящей работе представлены результаты апробации теста для определения неспецифической антибактериальной активности бактериофагов, а также для выявления пребиотического потенциала растительных субстратов.

Цель настоящего исследования - демонстрация потенциала теста ингибирования

биолюминесценции для выявления

бактериотропной активности объектов (препаратов) различного происхождения.

Материалы и методы. Для изучения бактериотропных свойств субстратов различного происхождения использовали метод, основанный на хемилюминесцентной реакции индикаторного штамма, полученного генно-инженерным путем (Echerichia coli lum+ со встроенным lux-опероном). Данная реакция связана с общим метаболизмом бактериальной клетки, в результате которого происходит окисление восстановленного рибофлавин фосфата (FMN-H2) и длинноцепочечного жирного альдегида и испускание сине-зеленого света (490-495 нм). Интенсивность свечения характеризует общий физиологический статус микроорганизма и его изменение под влиянием различных факторов.

В работе использовали: бактериофаги (стафилококковый, протейный, клебсиеллезный); метабиотик, представляющий собой ультрафильтрат культуральной жидкости лактобактерий штамма Lactobacilus plantarum 8P^3, содержащий комплекс

экзометаболитов, растительный субстрат (водное извлечение овса посевного). При исследовании образцов метабиотика и водного излечения овса посевного дополнительно готовили разведения (1:10, 1:100) с целью изучения дозозависимого эффекта ингибирования/ стимуляции свечения индикаторного штамма. Метабиотики в данном исследовании использовали в качестве препарата сравнения с известным воздействием на индикаторный штамм.

К 0,5 мл исследуемого образца (цельного или разведенного) добавляли 0,5 мл культуры тест-штамма E. coli lum+ и выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч. В качестве контроля использовали 0,5 мл стерильного раствора натрия хлорида и 0,5 мл бактериальной культуры тест-штамма. Регистрировали уровень свечения с помощью люминометра «Биотокс-6М».

Воздействие на интенсивность биолюминесценции культуры выражали количественно в виде индекса антибактериальной активности (ИАА),

рассчитываемого по формуле: ИАА = (Io-I)/(Io ) х 100,

где Io и I - интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы.

Результаты и обсуждение. Результаты теста ингибирования биолюминесценции представлены в виде графиков, демонстрирующих изменение уровня свечения штамма E. coli lum+ при экспозиции с исследуемыми образцами в течение 24 ч.

Метаболиты лактобактерий (цельный образец ультрафильтрата) оказывают выраженный ингибирующий эффект, подавляя свечения E. coli lum+ в течение 24 ч на уровне 99,8-99,9% (рис.1). Образец в разведении 1:10 также обладает ингибирующей способностью, но выраженной вдвое меньше в течение 6 ч экспозиции, чем у цельного препарата. Разведение образца в 100 раз практически не снижает свечение тест-штамма, а к 24 ч экспозиции даже стимулирует. Представленные данные позволяют оценить качественные и количественные параметры эффекта

бактериотропного действия метаболитов лактобактерий.

medical & pharmaceutical

JOURNAL "PULSE"

2022. Vol.24. №4

100,00 50,CC 0,00

-50.00

-100.00 -150.00 -200,00

5 мин 3C .мин 1 ч

24 ч

-цельный -б 1С раз -б ICD раз

PnCYHOK 1 -

действие метаболитов лактобактерий.

100,00 —,

50,00

0,00

H -50,00

i—I

-100,00

-150,00

-200,00

Solid

ю nmes.

1<Wr¡m<4

Figure 1 - Bacteriotiopic effect of metabolite 5 of lactobacilli.

Образцы водного извлечения овса посевного (цельный, разведенный в 10 и 100 раз) подавляют свечение на уровне 5-7 % на протяжении 2 ч экспозиции (рис.2). К 24 ч наблюдается увеличение свечения индикаторного штамма при воздействии всех образцов. Полученные данные позволяют сделать предварительный вывод о том, что овес посевной может обладать пребиотическими свойствами.

—■—цельны л

— ■■— - в 10 раз

— А - в 100 раз

Рисунок 2 - ¡^ЖХЖШШЯЖ действие водного извлечения овса посевного.

Solid

ebmet lö üm«

100

íimeí

Figure 2 - Bacteriotiopic effect of aqueous extract of oats.

medical & pharmaceutical

JOURNAL "PULSE"

2022. Vol.24. №4

При исследовании неспецифического бактериотропного действия бактериофагов (рис.3) было установлено, что образцы всех препаратов оказывали аналогичный эффект, который характеризовался в течение первой половины экспозиции ингибированием свечения тест-штамма не более чем на 50%. К концу экспозиции индикаторный штамм адаптировался к воздействию испытуемых образцов и его исходный уровень свечения восстанавливался и даже незначительно стимулировался.

- К/ебсие,1/езн=.м бактериофаг

-Стафилококковый бактериофаг

- Протейный бактериофаг

Рисунок 3 -

действие бактериофагов.

Klebsiella bacteriophage Staphylococcal bacteriophage

Proteu: bacteriophage

Пгиге 3 - ВааепсЛгорк: ейес! оГ ЬайепорЬааеа. Заключение. Тесты, основанные на реакции ингибирования микробиолюминесценции, нашли применение в экологическом контроле, но их потенциал позволяет рассматривать их и в качестве перспективных для более широкой сферы использования. Штаммы-индикаторы, представляющие собой основу указанных тест-систем, являются адекватной моделью для изучения бактериотропных свойств различных препаратов.

REFERENCES

библиографическим список

[1]. Pshenichnov R.A., Maslenikova I.L., Nikitina N.M. Microbioluminescence (optimization of sensors and expansion of the scope of the reaction). Perm: Perm State Technical University, 2005. 76 p.

[2]. Neschislyaev V.A., Pshenichnov R.A., Archakova E.G., Chistokhina L.P., Fadeeva I.V. Method for determining the antagonistic activity of probiotics // Patent of the Russian Federation No. 2187801. Patentee Perm Research and Production Association "Biomed". 2002. Bull. No. 23.

[3]. Neschislyaev V.A., Belova I.V., Archakova E.G., Muzhikova A.V., Valeeva E.M. On the issue of testing the antagonistic activity of polycomponent probiotics // Biopreparations. Prevention, diagnosis, treatment. 2010. №3(39). C 47. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=20390990 (accessed 04.04.2022).

[1]. Пшеничнов Р.А., Масленикова И.Л., Никитина Н.М. Микробиолюминесценция (оптимизация сенсоров и расширение сферы использования реакции). Пермь: Пермский государственный технический университет, 2005. 76 с.

[2]. Несчисляев В.А., Пшеничнов Р.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Способ определения антагонистической активности пробиотиков // Патент РФ № 2187801. Патентообладатель Пермское научно-производственное объединение "Биомед" . 2002. Бюл. № 23.

[3]. Несчисляев В.А., Белова И.В., Арчакова Е.Г., Мужикова А.В., Валеева Е.М. К вопросу тестирования антагонистической активности поликомпонентных пробиотиков // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2010. №3(39). С 47. URL: https://ww.eHbrary.ru/item.asp?id=20390990 (дата обращения 04.04.2022).

medical & pharmaceutical

JOURNAL "PULSE"

2022. Vol.24. №4

Author Contributions. Hohryakova M.D., Neschislyaev V.A. - concept and design of a research; review of literature, writing of the text; Fedorova T. V., Shilova E. G. - collecting and processing of materials; Mokin P.A - statistical data processing; Orlova E. V. - concept and design of a research.

Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest. Hohryakova M.D. - SPIN ID:7078-4091; ORCID: 0000-0002-3826-3485 Shilova E.G. - ORCID: 0000-0002-0001-6649

Neschislyaev V.A. - SPIN ID: 2469-6644; ORCID ID: 0000-0002-8163-0674 Fedorova T.V. - SPIN ID: 8700-3757; ORCID: 0000-0002-8760-2210 Orlova E.V. - SPIN ID:8093-5260

Mokin P.A. - SPIN ID:9083-2415; ORCID: 0000-0001-9801-2883

Вклад авторов. Хохрякова М.Д., Несчисляев В.А. - обзор литературы, написание текста; Федорова Т.В., Шилова Е.Г. - сбор и обработка материалов; Мокин П.А. - статистическая обработка данных; Орлова Е.В. - концепция и дизайн исследования,

Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Хохрякова М.Д. - SPIN ID:7078-4091; ORCID: 0000-0002-3826-3485

Шилова Е.Г. - ORCID: 0000-0002-0001-6649

Несчисляев В.А. - SPIN ID:2469-6644; ORCID:0000-0002-8163-0674

Федорова Т.В. - SPIN ID: 8700-3757; ORCID: 0000-0002-8760-2210

Орлова Е.В. - SPIN ID:8093-5260

Мокин П.А. - SPIN ID:9083-2415; ORCID: 0000-0001-9801-2883

For citation: Hohryakova M.D., Shilova E.G., Neschislyaev V.A., Fedorova T.V., Orlova E.V., Mokin P.A. EXPANDING THE SCOPE OF THE BIOLUMINESCENCE INHIBITION TEST // Medical & pharmaceutical journal «Pulse». - 2022. - Vol.24. №4. - pp. 138-142. Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-4-138-142.

Для цитирования: Хохрякова М.Д., Шилова Е.Г., Несчисляев В.А., Федорова Т.В., Орлова Е.В., Мокин П.А. РАСШИРЕНИЕ СФЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТЕСТА ИНГИБИРОВАНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". - 2022. - Т.24. №4. - С. 138-142. Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-4-138-142.