Эффекты воздействия СВЧ излучения на Escherichia coli lum+ Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2013 Серия: Физика Вып. 2 (24)

УДК 615.076.7+615.012.6+621.371

Эффекты воздействия СВЧ - излучения на Escherichia coli lum+

Д. Б. Кузнецовa, И. Л. Вольхинb, И. В. Лунеговb, Т. Ф. Одеговаa, В. А. Несчисляевa

a Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

b Пермский государственный национальный исследовательский университет 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

В работе исследуется воздействие СВЧ-излучения на Escherichia coli lum+, которое проявляется в виде ингибирования и/или стимуляции реакции микролюминесценции. Сравнительный анализ различных режимов воздействия (длины волны СВЧ-излучения и времени экспозиции) показал, что индикаторный штамм Escherichia coli lum+ имеет высокую чувствительность к внешнему электромагнитному излучению низкой интенсивности. Дана интерпретация результатов на основе современной фазовой теории.

Ключевые слова: СВЧ-излучение; биолюминесценция^сИепсЫа coli lum+

1. Введение

Конвергентный подход в современном естествознании не является исключением, а представляет собой естественный процесс освоения новых направлений науки. Одним из таких направлений является изучение различных видов физических воздействий на живые организмы.

Исследование влияния СВЧ-излучения миллиметрового диапазона на живые организмы началось с возникновения генераторов данной длины волны в середине ХХ в. Миллиметровый СВЧ-диапазон радиоволн лежит в интервале длин волн X = 1^10 мм. В настоящее время нет единого мнения о механизмах воздействия СВЧ-излучения на живую материю, как нет и единого методологического подхода в понимании данных явлений.

В работах [1-4], посвященных исследованиям низкоинтенсивного (нетеплового) воздействия СВЧ- и ИК-излучения на микроорганизмы, показано, что в основе молекулярного механизма воздействия на микроорганизмы лежит процесс активации многослойной адсорбции молекул воды на гидрофильной поверхности за счет смещения деформации электронной плотности молекул и изменения дипольного момента молекул. При запуске процесса многослойной адсорбции происходит вытеснение ионов Н+ за пределы адсорбированных слоев в область с повышенной концентрацией Н+, в результате чего возникает градиент концентра-

ции протонов (Ддн+), являющийся одним из трех конвертируемых форм энергии [6].

В работе исследованы эффекты воздействия СВЧ-излучения низкой интенсивности на реакцию ингибирования и/или стимуляции люминесценции индикаторного штамма Escherichia coli lum+.

2. Методика проведения исследований

2.1. Подготовка проб

Подготовка проб включала стадии: регидрата-ции и приготовления рабочего разведения лиофи-лизированного индикаторного штамма люминесцентных бактерий (проба) E. coli lum+ с помощью очищенной воды, имеющей рН 7.0±0.2, охлажденной до температуры (6±2)°С. Затем разведенную индикаторную культуру выдерживали не менее 30 мин при температуре (22±2)°С.

2.2. Экспериментальные установки

В качестве объектов исследования использовались пробы, облучаемые СВЧ-излучением миллиметрового диапазона с X = 8.14, 4.9 и 5.6 мм.

Схема экспериментальной установки для облучения проб на длине волны X = 8.14 мм показана на рис. 1. Источником СВЧ-излучения служил генератор Г4-156 на диоде Ганна 1, обеспечивающий генерацию плоскополяризованного излучения с X = 8,14 мм мощностью порядка 20 мВт в режиме

© Кузнецов Д. Б., Вольхин И. Л., Лунегов И. В. и др., 2013

71

СВЧ-излучение

Spit t

H

4 5

38 см

1 f

2.5 сМ 6.2 см

07 мм

7.0 см <-►

Рис. 1. Схема установки для облучения проб на X = 8.14 мм

непрерывной генерации. СВЧ-сигнал с генератора 1 через развязывающий ферритовый вентиль 2, аттенюатор 3, согласующий Е-Н трансформатор 4, поступал на рупорную СВЧ-антенну 5 с раскры-вом прямоугольной формы 72 х 34 мм. Линза 6 формировала пучок СВЧ-излучения и направляла его на полимерную (полиэтиленовую) пробирку круглого сечения с пробой, установленную на пенопластовой подставке 7, прозрачной для СВЧ-излучения. Диэлектрическая линза 6 формировала плоскопараллельный пучок СВЧ-излучения (волна Н10). Вектор напряженности электрического поля Е был ориентирован вертикально. Сечение СВЧ-пучка на уровне половинной мощности и пробирка с пробой представлены в левой части рис. 1. Суммарные потери энергии, включающие в себя потери в антенно-волноводном тракте, рассеяние за пределы сечения на уровне половинной мощности и отражение от поверхности полимерной пробирки, составляли порядка 30% генерируемой мощности, таким образом, поток мощности СВЧ-излучения, воздействовавший на исследуемую пробу, составлял порядка 0.4 мВт/см2. Расстояние от раскрыва антенны до центра пробирки составляло 38 см, что с учетом применения СВЧ-линзы обеспечивало работу в дальней волновой зоне антенны.

На рис. 2 изображена схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с X =5.6 мм и 4.9 мм. В качестве генератора 1 был использован аппарат "МИЛТА-КВЧ" НПО "Космического приборостроения" (Россия) с выходной мощностью 10 мВт в режиме непрерывной генерации. СВЧ-излучение (волна Н11) распространялось по волноводу круглого сечения 2 и в виде расходящейся волны облучало пробирку с пробой 3. Расстояние между раскрывом волновода и пробиркой было выбрано порядка 1 см, что, с одной стороны, обеспечивало работу в дальней зоне Я > 2ё2 / X, где ё -диаметр раскрыва волновода, для X =5.6 мм ё = 4.5 мм и Я = 7.2 мм; для X = 4.9 мм ё = 4.0 мм и Я = 6.5 мм, с другой стороны, пробирка находилась внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности, которое, по нашим расчетам, составляло порядка 1 см. Вектор напряженности электрического поля Е был ориентирован горизонтально. Внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности волна Н11 по структуре близка к волне Н10.

СВЧ-излучение

Л см

Рис. 2. Схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с X = 5,6мм и 4,9 мм

2.3. Измерение биолюминесценции

Определение биолюминесценции под воздействием СВЧ-излучения в отношении энтеробакте-рий проводили с помощью экспресс-теста ингиби-рования биолюминесценции индикаторного штамма Escherichia coli lum+ [5]. Уровень гашения (стимуляции) свечения индикаторной культуры определяли с помощью люминометра "Биотокс-6" ООО "НЕРА-С" (Россия) через фиксированные промежутки времени после облучения: 10 мин, 1, 2, 3, 4, 5 и 24 ч. Эффект воздействия излучения выражали в виде цифрового показателя ИАА = (x1 -x2) / xj, где Xj и х2 - интенсивности свечения индикаторного штамма без и после облучения соответственно [5].

3. Результаты работы и их обсуждение

3.1. Полученные результаты

При проведении биолюминесцентного теста было выявлено несколько вариантов развития реакции ингибирования и стимулирования свечения индикаторного штамма E. coli lum+ после воздействия на него ЭМИ (рис. 3 и 4). Установлено, что СВЧ-излучение сразу повышает люминесценцию сенсора, особенно на I = 4.9 мм более 80% (рис. 3). При уменьшении времени экспозиции до 20 мин при облучении на I = 8.14 мм уровень биолюминесценции значительно увеличился через 5 ч.

1

2

3

Эффекты воздействия СВЧ-излучения.

73

о

100

0,1 1 10 Г. час —•— 4 9 мм ......■..... 5 .6 мм

Рис. 3. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. (время экспозиции 60 мин)

При уменьшении времени экспозиции до 20 мин при облучении на X = 8.14 мм уровень биолюминесценции значительно увеличился через 5 час. В опыте с СВЧ-излучением на X = 4.9 мм уро-

20

-40

1 10 tчас

—1—20 мин ......■..... 60 мин

Рис. 4. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+ (время экспозиции 20 и 60 мин)

вень свечения в течение первых трех часов монотонно снижался до ИАА = -33, а затем оставался постоянным. На X =5.6 мм в течение первых двух часов наблюдалось незначительное снижение ИАА, которое затем монотонно повышалось до ИАА = -55 спустя 24 ч после экспозиции (рис. 3). При воздействии СВЧ-излучением наблюдалась стимуляция свечения. Показано, что после 24 ч выдержки облученные на X = 4.9 и 5.6 мм пробы сохраняли стимуляцию свечения (рис. 3). Облучение на X = 8.14 мм с временем экспозиции 60 мин, наоборот, приводило к спаду интенсивности свечения до уровня контрольного образца (рис. 4).

3.2. Обсуждение полученных результатов

Анализ динамики биолюминесценции тест-штамма после облучения СВЧ-излучением позволяет сделать вывод о его значительном адаптационном потенциале и о специфичности развития реакции стимуляции, обусловленной следующими факторами: длиной волны и временем экспозиции.

Сопоставляя полученные результаты, следует отметить наибольшую чувствительность тест-штамма к СВЧ-излучению на X = 4.9 и 5.6 мм с 60-ти минутной экспозицией.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что воздействие СВЧ-излучения на био-люминисценцию связано с избирательным поглощением ЭМИ. Низкоэнергетические внешние воздействия существенно влияют на биохимические процессы, включая весь энергетический обмен микроорганизмов в целом. При этом происходят молекулярные структурные перестройки, связанные с перераспределением электронной плотности молекул-акцепторов, сопровождающиеся каскадными реакциями с накоплением ионов Н+ в "кислотных резервуарах" путем вытеснения из адсорбированных слоев молекул воды на гидрофильных поверхностях. На рис. 5 показано, как под воздействием квантов СВЧ-излучения Ьм1 на а-спирали белковых молекул происходит усиленная адсорбция молекул воды (выноска в увеличенном масштабе). В результате образуются многослойные надмолекулярные комплексы с нативной люциферазой (ЖЕ), при этом происходит диссоциация части молекул воды, сопровождающаяся вытеснением протонов (1) с образованием градиента их концентрации Д^н+. Энергия СВЧ-излучения переходит в энергию диполь-дипольного взаимодействия и накапливается в адсорбированных слоях воды и в градиенте Ддн+. Вытесненные протоны восстанавливают FMN (структурная формула приведена в правом верхнем углу рис. 5) до FMNH2 (2). При этом выделяющаяся избыточная энергия уносится квантами светового излучения к\2 (3).

Химизм реакции бактериальной люминесценции выражается уравнениями:

(-КН—СИ-ОС—)п*тНОН + хНОН + ~ (—КН—СН—ОС—)п*тНОН~(ОН)х+ хН+, (1) БЫК + 2Н+ ~ FMNH2 , (2)

РМЫН2 + ЖЕ ^ НБЕ—РМЫН2 , (3) ЖЕ—РМЫН2 + О2 ^ НБЕ—РМЫН* + О2- + Н+ (4) ЖЕ—РМЫН* + РМЫН2 + О2 ^

+ БМК + О2- + Н+ , (5)

Х1+О2 ^ Х2 + БМК + О2- + Н++ Ун>2, (6) 2О2- + 2Н+^ Н2О2 + О2, (7) где Х1 и Х2 - 1-й и 2-й интермедиаты.

Предложенный механизм объясняет длительное сохранение эффекта воздействия СВЧ-излучения на реакцию люминесценции. Однако данное предположение требует дополнительной проверки.

Рис. 5. Механизм воздействия ЭМИ на биолюминесценцию

Помимо этого, описание явлений с помощью современной фазовой теории [7] позволяет показать, почему при введении альдегида вне зависимости от длины цепи происходит стимуляция свечения. Альдегиды в водных растворах способны к гидратации как частичной (с меньшей поляризацией связи), так и полной (с большей поляризацией связи), что, в свою очередь, приводит соответственно к возникновению гидратных оболочек, которые вытесняют из себя Н+. Вытесненные Н+ образуют градиент Ддн+, который является источником энергии, в частности, для реакции люминесценции. Данное объяснение без усложнения гипотетическими биотрансфармационными механизмами показывает, что при введении в клетку альдегиды способны повышать уровень люминесценции, при этом не разрушаясь, и вызывать стягивание на себя молекул воды.

4. Заключение

Полученные результаты согласуются с результатами других авторов и свидетельствуют о целесообразности использования СВЧ-излучений миллиметрового диапазона низкой интенсивности при проведении технологических процессов на биофармацевтическом производстве.

Миллиметровые (I = 4.9; 5.6 и 8.14 мм) низкоинтенсивные излучения оказывают выраженный стимулирующий эффект на люминесценцию сенсора индикаторного штамма Escherichia coli lum . Влияние излучения на тест-штамм носит пролонгированный характер.

Для уточнения предложенного механизма объяснения селективного влияния СВЧ-излучения низкой интенсивности на живые организмы требуется проведение дополнительных исследований.

Список литературы

1. Кузнецов Д.Б. Молекулярные механизмы воздействия инфракрасного излучения на микроорганизмы // Фундаментальные исследования. 2013. № 4 (ч. 2). С. 414-418.

2. Кузнецов Д.Б. Исследование воздействия низкоинтенсивного СВЧ электромагнитного поля на микролюминесценцию и оптическую плотность питательной среды MRS-1 // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 2; URL http://www.science-education.ru /108-9008 (дата обращения: 21.05.2013).

3. Кузнецов Д.Б. Перспективы применения электромагнитных излучений крайне высокой частоты малой мощности в фармации // Фундаментальные исследования. 2012. № 10 (ч. 2). С. 400-404.

4. Кузнецов Д.Б. Физико-химические механизмы воздействия крайне-высокочастотного излучения на микроорганизмы // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 1; URL: http://www.science-education.ru/107-8226 (дата обращения: 28.01.2013).

5. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. Патент на изобретение № 2187801 от 20.08.2002 г. / Несчисляев В.А., Пше-ничнов Р.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. (Россия) № 2000118391/14. Заявл. 10.07.00. Опубл. 20.08.02. Бюл. № 23.

6. Романовский Ю.М., Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии живой клетки. Протонная АТФ-синтаза - вращающийся молекулярный мотор // УФН. 2010. Т. 180. № 9. С. 931-956.

7. Ling, G.N. A New Theoretical Foundation for the Po-larized-Oriented Multilayer Theory of Cell Water and for Inanimate Systems Demonstrating Long-range Dynamic Structuring of Water Molecules // Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. 2003. Vol. 35. № 1. Р. 91130.

The effects of microwave radiation on Escherichia coli lum+

D. B. Kuznetsova, I. L. Volkhinb, I. L. Lunegovb, T. F. Odegovaa, V. A. Neschislyaeva

a Perm State Pharmaceutical academy, Polevaya St. 2, 614990, Perm b Perm State University, Bukirev St. 15, 614990, Perm

This research devoted to investigation of microwave radiation effects on Escherichia coli lum+. The effect is to inhibiting and / or stimulating of micro luminescence reaction. Comparative analysis of different irradiation conditions: microwave radiation wavelength and exposure time showed that the indicator strain of Escherichia coli lum+ has high sensitivity to low intensity external electromagnetic radiation. The results interpretation based on the modern phase theory.

Keywords: microwave, bio-luminescence, Escherichia coli lum+