CC BY
30ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2013 Серия: Физика Вып. 3 (25)
УДК 615.076.7; 615.012.6; 621.371
Методика исследования влияния ИК- и СВЧ-излучения на микроорганизмы
Д. Б. Кузнецов51, И. Л. Вольхинь, И. В. Лунеговь, Т. Ф. Одеговаа
а Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России 614990, Пермь, ул. Полевая, 2
ь Пермский государственный национальный исследовательский университет 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Приведена методика исследования влияния ИК- и СВЧ-излучения низкой интенсивности на микроорганизмы. Разработан алгоритм проведения исследований, направленных на изучение влияния стимулирования или ингибирования роста микроорганизмов путем облучения биомассы ИК- или СВЧ-излучением. Проведены пробные исследования и получены предварительные результаты.
Ключевые слова: электромагнитное излучение; живые объекты; алгоритм изучения
1. Введение
В своих работах академик Н.Д. Девятков неоднократно отмечал перспективность использования СВЧ-излучения низкой интенсивности для биотехнологических процессов при производстве лекарственных препаратов [1,2].
Теоретические разработки, основанные на исследованиях последних лет дают интерпретацию механизмов воздействия электромагнитного излучения низкой интенсивности на живые организмы [1-8]. Основным звеном в механизме воздействия электромагнитного излучения является запуск процесса многослойной адсорбции на границе раздела фаз гидрофильных поверхностей и молекул воды [9, 10]. Ввиду того, что гидрофильными поверхностями выступают молекулы ДНК, РНК, белков, фосфолипидных головок мембран, суммарная площадь поверхностей в одной клетке огромна. Именно большая площадь контакта фаз является основной причиной сильного влияния электромагнитного излучения низкой интенсивности на живые организмы. Процесс многослойной адсорбции молекул воды сопровождается вытеснением протонов из адсорбированных слоев, что в свою очередь приводит к повышению градиента Д|1,1. который в живом организме является одной из конвертируемых форм энергии [7, 8, 11].
Стимуляция биосинтетической активности наиболее актуальна при культивировании микроорганизмов на бедных питательных средах. Например, если при культивировании маточной культуры на богатой нутриентами питательной
среде нет необходимости повышать обмен веществ микробных клеток, то при пересеве маточной культуры на жидкую питательную среду весьма перспективно проводить операции по стимуляции ростовых характеристик биомассы. Подобные операции позволят проводить технологический процесс культивирования с более низкой себестоимостью. Например, при облучении биомассы электромагнитным излучением СВЧ-диапазона ее прирост составляет 30%, следовательно, технологическое оборудование (ферментеры/биореакторы) имеют большую производительность на указанную величину при их одинаковом объеме. При решении проблемы путем использования более богатых питательных сред, происходит увеличение переменных издержек, при этом конечная стоимость продукции для потребителя увеличивается. Тогда как использование излучателей увеличивает стоимость основных средств и амортизации, т.е. постоянные издержки, что не приведет к значительному повышению себестоимости продукции. Это актуально, когда стоимость питательных сред велика и занимает существенный процент в себестоимости лекарственных препаратов.
Если необходимо повысить выход биомассы (концентрацию клеток), то вместо приобретения дополнительных ферментеров/биореакторов, использования дополнительных производственных площадей и привлечения дополнительного персонала, требуется провести поиск оптимальных условий воздействия электромагнитным излучением и смонтировать генераторы-излучатели с требуемыми характеристиками.
© Кузнецов Д. Б., Вольхин И. Л., Лунегов И. В., Одегова Т.Ф., 2013
83
Обычно при организации производства технологические процессы и оборудование подбираются с учетом требований для производства конкретного биотехнологического лекарственного препарата. В этом случае гибкость биофармацев-тических предприятий довольно низкая, при этом необходимо использовать генераторы с фиксированной рабочей частотой. Применение перестраиваемых по частоте высокочастотных генераторов большой мощности затруднено в связи с их высокой стоимостью. Перспективно использование одновременно ИК- и СВЧ-излучения, т.к. СВЧ-излучение влияет на вращательную энергию молекул, а ИК-излучение на колебательную и вращательную энергии молекул [12]. Комбинированное использование излучений разных диапазонов позволит повысить селективность воздействия.
Трудность заключается в том, что для каждого конкретного вида микроорганизмов, требуется индивидуально подбирать не только оптимальный состав питательной среды, но и режим облучения, т.е. длину волны, степень когерентности излучения и время экспозиции. Эго увеличивает стоимость и время проведения НИОКР при разработке новых биотехнологических лекарственных препаратов. Другой проблемой является то, что в настоящее время на территории Российской Федерации не существует научно-исследовательской базы с надлежащими условиями (СЬР), где бы велись по-
добные разработки.
В настоящее время проведено тестирование отдельных элементов предложенного метода, которое показало преимущества комплексного подхода к решению поставленных задач с объединением усилий специалистов в области фармации, физики и научно-исследовательской группы ученых Пермского НПО «Биомед».
2. Алгоритм исследования
Решением проблемы может стать проведение междисциплинарных исследований, направленных на изучение влияния стимулирования или ингибирования роста микроорганизмов путем облучения биомассы ИК- или СВЧ-излучением в процессе ферментации. Авторами статьи проведены предварительные исследования влияния ИК- и СВЧ-излучения на изменение энергетического обмена клеток бактерий [3], роста культуры микроорганизмов [5] и питательные среды [4].
Приобретенный опыт позволил разработать алгоритм проведения исследований с целью определения параметров стимуляции живой системы под воздействием ИК- и СВЧ-излучения малой интенсивности. Разработанный алгоритм приведен на рис. 1. На этапе (1) специализированная лаборатория производит подготовку проб, которыми являются культуры микроорганизмов. Затем (2) прово-
Рис. 1. Алгоритм создания технологической разработки
дится анализ спектров поглощения электромагнитного излучения ИК- и СВЧ-диапазонов для определения резонансных линий или областей поглощения. На этапе (3) биологические объекты облучаются когерентным или некогерентным электромагнитным излучением, соответствующим по частотам областям поглощения. Затем (4) изучается реакция биологических объектов на облучение методами люминесцентного анализа, турбидимет-рии бактериальной суспензии, атомно-силовой и/или электронной микроскопии, возможны и другие методы. Далее (5) полученные результаты анализируются и, в зависимости от задачи (стимулирование или ингибирование роста), подбираются условия облучения: частота, степень когерентности, поток мощности и время экспозиции. На основании полученных данных (6) проводятся пилотные испытания, по результатам которых принимается решение о внедрении разработки в промышленность (7).
Проведена апробация предложенного алгоритма. Для подготовки проб использована научно-исследовательская база Пермского НПО «Био-мед».
Анализ спектров поглощения СВЧ-излучения в диапазоне частот 35-К>7 ГГц предполагается проводить с использованием векторного анализатора цепей Agilent PNA-X диапазона от 10 МГц до 67 ГГц. Схема установки показана на рис. 2. Прозрачная для СВЧ-излучения плоскопараллельная
СВЧ-излучение СВЧ-
П ^ 22 ^ 33
<Э1 о
Векторный анализатор цепей
Рис. 2. Схема исследования спектров поглощения СВ Ч-излучения
кювета с исследуемой культурой клеток (2) помещается между излучающей антенной (1) и приемной антенной (3). Анализ спектров спектров поглощения ИК-излучения производится с помощью ИК-спектрометров, например Ыюо1е1 ¡N10.
Анализ полученных спектрограмм позволяет выявить полосы поглощения, на которых будут исследованы стимулирующие или ингибирующие эффекты живой системы. В настоящий время установка (рис. 2) находится в стадии разработки. Облучение культур Escherichia coli 1ит+ и Bifidobacterium bifidum-l проводилось на установках, приведенных на рис. 3, 4 и 5.
На рис. 3 представлена схема экспериментальной установки для СВЧ-облучения проб. Источником излучения служил генератор Г4-156 на диоде Ганна (1), обеспечивающий генерацию плоскопо-ляризованного излучения мощностью порядка 20 мВт в режиме непрерывной генерации. СВЧ-сигнал с выхода генератора через развязывающий ферритовый вентиль (2), аттенюатор (3), согласующий Е-Н трансформатор (4) поступал на рупорную СВЧ-антенну (5) с раскрывом прямоугольной формы 72x34 мм. Линза (6) формировала пучок СВЧ-излучения (волна Ню) и направляла его на полимерную (полиэтиленовую) пробирку круглого сечения с пробой, установленную на пенопластовой подставке (7), прозрачной для данного излучения. Вектор напряженности электрического поля Е был ориентирован вертикально. Сечение СВЧ-пучка на уровне половинной мощности и пробирка с пробой представлены в левой части рис. 2. Суммарные потери энергии: потери в антенно-
волноводном тракте, рассеяние за пределами сечения на уровне половинной мощности и отражение от поверхности полимерной пробирки составляли порядка 30% генерируемой мощности, таким образом поток мощности СВЧ-излучения, воздействовавший на исследуемую пробу, составлял порядка 0.4 мВт/см2. Расстояние от раскрыва антенны до центра пробирки составляло 38 см, что с учетом применения СВЧ-линзы обеспечивало работу в дальней волновой зоне антенны.
На рис. 4, а изображена схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с /.=5.6 мм и 4.9 мм. В качестве генератора (1) был использован аппарат «МИЛТА-КВЧ» НПО «Космического приборостроения» (Россия) с выходной мощностью 10 мВт. СВЧ-излучение (волна Нц) распространялось по волноводу круглого сечения (2) и в виде расходящейся волны облучало пробирку с пробой (3). Расстояние между раскрывом волновода и пробиркой было выбрано порядка 1 см, что с одной
* / / Е N \ \ і V
/ 1 ч 1 \ J 2.5 см і 6.2 см г
✓ 1 Г
чн
о7 мм
7.0 см
Ч р
Рис. 3. Схема установки для облучения проб наЛ = 8.14 мм
Рис. 4. Схема установки для облучения проб: а - СВЧ-излучением с X б - ИК-излучением с X = 850+890 нм
- 5.6мм и 4.9 мм:
стороны обеспечивало работу в дальней зоне Я » 2с12//.. где с! - диаметр раскрыва волновода, для X = 5.6 мм с1 = 4.5 мм и К = 12 мм; для X = 4.9 мм с! = 4.0 мм и К = 6.5 мм, с другой стороны пробирка находилась внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности, которое по нашим расчетам составляло порядка 1 см. Вектор напряженности электрического поля Е был ориентирован горизонтально. Внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности волна Нц по структуре близка к волне Ню.
В качестве источника излучения ИК-диапазона использовался аппарат «МИЛТА-Ф-8-01» НПО «Космического приборостроения», включающий в себя ИК-лазер и ИК-светодиоды, работающие в диапазоне X = 850^-890 нм. Импульсная мощность
Схема экспериментальной установки для исследования влияния электромагнитных излучений низкой интенсивности в опытах с промышленным штаммом Bifidobacterium bifidum-1 приведена на рис. 5. Для облучения электромагнитным излучением с X = 8.14 мм бактериальной суспензии штамма В. bifidum экспериментальная установка была аналогична установке, описанной выше (рис. 3), исключением является замена полимерных пробирок с пробой, стеклянными емкостями объемом 250 мл с плоскопараллельными стенками.
Изучение реакции биологических объектов на облучение было выполнено методами микролю-минесцентного анализа [3] и турбидиметрии [5].
Анализ данных экспериментов (4), полученных в ходе предварительной проверки предложенного
излучения лазера составляла 21 Вт, а непрерывная мощность излучения светодиодов (4 шт.) - 100 мВт. На рис. 4,6 представлена схема установки для облучения проб ИК-излучением, состоявшая из камеры (1) с размещенными в ней ИК-лазером (2) и светодиодами (3). Пробирка с пробой размешалась внутри камеры (1) так, что дно прилегало к излучающей поверхности лазера и крепилась сверху на отражающей алюминиевой опоре (5). В качестве объектов исследования выступали клетки Escherichia coli 1ит+ и культура промышленного штамма Bifidobacterium bifidum-1.
Для исследований использовались лиофилизи-рованные биомассы, которые регидротировали путем разведения изотоническим раствором.
алгоритма, позволил выявить закономерности влияния электромагнитного излучения низкой интенсивности на живые микроорганизмы и подтвердить правомерность использования современной фазовой теории [13, 14] при интерпретации экспериментальных данных.
3. Заключение
Выработан алгоритм проведения исследований, направленных на изучение влияния стимулирования или ингибирования роста микроорганизмов путем облучения биомассы ИК- или СВЧ-излучением. Проведены пробные исследования и получены предварительные результаты, которые показали перспективность использования ИК- и
СВЧ-излучения низкой интенсивности в фармацевтической биотехнологии.
Разработанный алгоритм предполагает проведение полного цикла лабораторных и пилотных испытаний, с последующим внедрением разработанных технологий в биофармацевтическое производство.
При выполнении работы использовано оборудование кафедры радиоэлектроники и защиты информации ПГНИУ, приобретенное в рамках программы развития Пермского государственного национального исследовательского университета.
Список литературы
1. Девятков Н. Д. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона волн на биологические объекты // Успехи физических наук. 1973. Т. 110, №. 7. С. 453-454.
2. Девятков Н. Д., Голант М. Б., Бецкий О. В. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности. М.: Радио и связь, 1991. 168 с.
3. Кузнецов Д. Б., Вольхин И. Л., Лунегов И. В, Одегова Т. Ф., Несчисляев В. А. Эффекты воздействия СВЧ-излучения на Escherichia coli lum+ // Вестник Пермского Университета. Серия: Физика. 2013. Вып. 2 (24). С. 71-75.
4. Кузнецов Д. Б. Исследование воздействия низкоинтенсивного СВЧ электромагнитного поля на микролюминесценцию и оптическую плотность питательной среды MRS-1 // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 2; URL: www.science-education.ru/108-9008 (дата обращения: 08.10.2013).
5. Кузнецов Д. Б., Вольхин И. Л., Лунегов И. В. Влияние СВЧ-излучения низкой интенсивности на рост штамма bifiobacterium bifidum при глубинном культивировании // Материалы краевой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Физика для
Пермского края». Вып. 6. 2013. С. 137-142.
6. Кузнецов Д. Б., Одегова Т. Ф. Каталитические технологии в биоиндустрии на основе физических механизмов воздействия. Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. 2012. № 9. С. 236-239.
7. Кузнецов Д. Б. Молекулярные механизмы воздействия инфракрасного излучения на микроорганизмы. // Фундаментальные исследования. 2013. № 4 (часть 2). С. 414-418.
8. Кузнецов Д. Б. Перспективы применения элек-
тромагнитных излучений крайне высокой частоты малой мощности в фармации // Фундаментальные исследования. 2012. №. 10
(часть 2). С. 400-404.
9. Chai В., Yоо Н., Pollack G. Н. Effect of radiant energy on near-surface water // Journal of Physical Chemistry B. 2009. Vol. 113, N. 42. P. 13953-13958.
10. Zheng J. М., Chin W. C., Khijniak E., Khijniak E. Jr, Pollack G. H. Surfaces and interfacial water: evidence that hydrophilic surfaces have long-range impact // Advanced in Colloid and Interface Science 2006. Vol. 127, N. 1. P. 19-27.
11 .Кузнецов Д. Б. Физико-химические механизмы воздействия крайне-высокочастотного излучения на микроорганизмы // Современные проблемы науки и образования. 2013. N 1; URL: http ://www. science-education, ru/107-8226 (дата обращения: 28.01.2013).
12. Дашевский В. Г. Конформационный анализ макромолекул. М.: Наука, 1987. 284 с.
13. Ling G. N. A New Theoretical Foundation for the Polarized-Oriented Multilayer Theory of Cell Water and for Inanimate Systems Demonstrating Long-range Dynamic Structuring of Water Molecules // Physiology Chemistry and Physics and Medical NMR. 2003. Vol. 35, N. 2. P. 91-130.
14. Ling G. N. A Physical Theory of the Living State: the Association-Induction Hypothesis // Blaisdell Publ. Co., Waltham, Mass. 1962. 680 p.
Method study the effect of infrared and microwave radiation on microorganisms
D. B. Kuznetsova, I. L. Volkhinb, I. V. Lunegovb, T. F. Odegovaa
a Perm State Pharmaceutical academy, Polevaya St. 2, 614990, Perm b Perm State University, Bukirev St. 15, 614990, Perm
Method of low intensity electromagnetic radiation influence on microorganisms was developed. The interdisciplinary research algorithm of stimulating or inhibiting effect on microorganisms growth by infrared or microwave radiation exposing the biomass was proposed. Pilot studies were done and preliminary results were obtained.
Keywords: electromagnetic radiation; live objects; research algorithm
