CC BY
35Разработка системы олигонуклеотидных праймеров для исследований в области молекулярной экологии азотофиксирующих микроорганизмов.
^Марусина А.И., *Булыгина Е.С., * Кузнецов Б.Б. (borisk@biengi.ac.ru), Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф.
Институт микробиологии РАН, *«Центр Биоинженерия» РАН, ^Московский Физико-технический Институт.
ВВЕДЕНИЕ
Современные тенденции развития микробиологии включают, наряду с совершенствованием традиционных методов, активное использование молекулярно-биологических подходов для изучения микробиологических процессов и микробного разнообразия. В настоящее время внимание исследователей все чаще привлекают так называемые "функциональные гены", анализ которых позволяет оценить разнообразие микроорганизмов, выполняющих определенную функцию в экосистеме. Среди таких генов особое место принадлежит нитрогеназному комплексу, ответственному за трансформацию молекулярного азота в минеральные и органические вещества, доступные для микроорганизмов и растений.
Ферментный комплекс нитрогеназы состоит из двух субъединиц: FeMo-белка, кодируемого генами и т]К, и Fe-белка, который кодируется геном пг^И [ 1 ]. Ген пг^И является одним из наиболее консервативных функциональных генов, что позволило применить молекулярно-биологические подходы, основанные на анализе последовательностей т]И гена к исследованиям по биоразнобразию как изолятов азотфиксирующих бактерий, так и целостных микробных природных сообществ [2,3].
Для определения нуклеотидных последовательностей гена пг^И ранее уже были предложены олигонуклеотидные праймеры, позволяющие
амплифицировать участки этих генов, достаточные для идентификации микроорганизмов. Однако большинство существующих в настоящее время олигонуклеотидных праймеров сконструированы для амплификации генов т//Н отдельных таксономических групп прокариот или даже для отдельных микроорганизма, в частности, цианобактерий [4, 5, 6, 7].
Целью настоящей работы явилось конструирование максимально универсальной системы праймеров, позволяющей амплифицировать участки генов т/Н для таксономически как можно более широкого спектра прокариот.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы Микроорганизмы, использованные в данной работе, и источники их получения представлены в Таблице 1.
Организм Штамм Источник
Azotobacter chroococcum 126 МГУ, каф. микробиологии
Azotobacter vinelandii 59 - " -
Sinorhizobium. meliloti 201 - " -
Rhizobium trifolii 199 - " -
Xanthobacter autotrophicus 7с ББМ2 432
Beijerinckia indica subsp. indica KS 1-7 АТСС 21423
Nostoc sp. PCC 7120 АТСС 27893
Methanosarcina lacustera ИНМИ РАН
Escherihia coli DH5U Центр "Биоинженерия" РАН
Bacillus thuringiensis 696 -- " --
Таблица 1: Бактериальные штаммы, использованные в работе. Примечание: DSMZ- Deutsche-Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany; ATCC - American Type Culture Collection, Manassas, USA.
Выбор праймеров. Был проведен поиск нуклеотидных последовательностей генов nifH прокариот различных таксономических групп в международном банке данных GenBank. Процедуры элаймента последовательностей проводили через сеть Интернет с помощью программы Basic Genebee Clustal W1.75 (http://www.genebee.msu.su/clustal)
Выделение ДНК. Выделение ДНК проводили согласно протоколу Miniprep (Promega, USA) c небольшими модификациями. Полученные препараты ДНК имели концентрацию 5-7 мкг/мл. РНК в препаратах присутствует в следовых количествах (по электрофоретическим данным, менее 1%).
Амплификация и очистка ПЦР-фрагментов nifH гена. Амплификацию проводили с использованием сконструированных нами пар праймеров (F1-R6, F2-R6) на приборе Cetus 480 (Perkin Elmers, Швеция). С применением термостабильной полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Москва) согласно рекомендациям фирмы-производителя полимеразы. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94оС 3 мин, 50оС - 3 мин и 72оС - 3мин;. последующие 5 циклов - 94оС - 30 сек, 50оС - 2 мин и 72оС - 30 сек; последние 30 циклов - 94оС - 30 сек, 40оС - 30 сек и 72оС - 30 сек и окончательная полимеризация при 72оС - 7 мин. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1 % геле агарозы. Визуализацию полос осуществляли в УФ после окрашивания гелей бромистым этидием и фотографировали результат на трансиллюминаторе «БиоКом» (Москва). Выделение и очистку фрагментов из легкоплавкой агарозы проводили с использованием набора "Wizard PCR Preps" фирмы «Promega» согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование ПЦР фрагментов. Секвенирование проводили по методу Сэнгера [14] «Silver Sequencing» фирмы Promega (США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Электрофорез проводили на приборах Macrophore, Pharmacia (Швеция) и SQ3 Sequencer, Hoefer (США), при толщине полиакриламидного геля 0,19 мм. Для секвенирования применяли сконструированные нами праймеры. Депонирование нуклеотидных последовательностей. Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов генов nifH были депонированы в базе данных GenBank под номерами AF302904, AF302905.
Результаты и обсуждение
После тщательного анализа выравненных последовательностей генов nifH, имеющихся в современных банках данных, в них были выбраны наиболее консервативные участки, соответствующие позициям 19-56, 115-131 и 457-494 гена nifH Azotobacter vinelandii, позволившие создать систему праймеров (два прямых - F1 (3'-tayggiaarggiggiatyggiaartc-5') и F2(3'- tgygaycciaaigciga-5') и один обратный - R6(3'-gccatcatytcicciga -5'), для амплификации участков гена тЩ длиной приблизительно в 470 пар оснований для праймеров F1-R6 и 370 пар оснований для праймеров F2-R6.
Первоначальная проверка выбранной системы праймеров была проведена на препаратах ДНК, выделенных из микроорганизмов, для которых было показано наличие функции азотфиксации (рисунки 1 , 2).
В качестве негативного контроля при этом использовали препараты ДНК E.coli и B.thuringiensis. Как видно из приведенных фотографий, фрагменты генов nifH выявлены у всех включенных в эксперимент азотофиксаторов, причем интенсивность полос варьирует при использовании различных пар праймеров (F1-R6 и F2-R6), что делает эти пары праймеров взаимодополняющими.
Для подтверждения того, что полученные амплификаты действительно являются фрагментами генов nifH, было проведено прямое секвенирование ПЦР-фрагментов для Nostoc (Anabaena) sp.PCC7120 и Sinorhizobium меШоШ, последовательности генов nifH которых представлены в GenBank под номерами M55229.1 и AF012326.1, соответственно. Обнаружена более чем 95% гомология между секвенированными нами и депонированными последовательностями. Таким образом, было подтверждено, что полученные ПЦР-фрагменты соответствуют генам nifH.
С помощью разработанной системы праймеров были определены ранее неизвестные частичные нуклеотидные последовательности генов nifH для бактерий Beijerinckia indica ATCC 9093 и Xanthobacter autotrophicus DSMZ. Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов генов nifH были депонированы в базе данных GenBank под номерами AF302904, AF302905, соотвестственно. Таким образом, предложенная система праймеров способна выявлять фрагменты генов nifH у широкого круга микроорганизмов,
что позволит более полно изучать микробные сообщества различных экосистем, включающих как эубактерий, так и архей без культивирования в лабораторных условиях.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 00-4-48801а). Авторы выражают благодарность Колотиловой Н.Н., Аркадьевой З.А.(МГУ, Биофак) , Дедыш С.Н., Симаньковой М.В. (ИНМИ РАН), Рябченко
H.Ф. (Центр «Биоинженерия» РАН) за любезно предоставленные культуры микроорганизмов.
Литература
I. Young J.P.W. 1992. Phylogenetic classification of nitrogen-fixing organisms. In: Stacey G., Burris R.H., Evans H.G. (eds)Biological nitrogen fixation. Chapman and Hall, New York, N.Y. P. 43-86.
2. Ben-Porath J., Zehr J.P. 1994. Detection and charcterization of cyanobacterial nifH genes. Appl Environ. Microbiol.60: 880-887.
3. Okhuma M., Noda S., Usami R., Horikoshi K., Kudo T. 1996. Diversity of nitrogeeen fixation genesin the symbiotic intestinal microflora of the termite Reticulitermis speratus. Appl. Environ. Microbio. 62: 2747-2752.
4. Kirshtein J.D., Paerl H.W., Zehr J. 1991. Amplification, cloning and sequencing of a nifH segment from aquatic microorganisms and natural communities. Apl. Environ. Microbiol. 54:2645-2650
5. Zehr J., McReynolds L. 1989. Use of degenerate oligonucleotide primers for amplification of the nifH gene from the marine cyanobacterium Trihodesmium thiebautii. Appl. Environ. Microbiol. 61:2427-2532.
6. Ohkuma M., Noda S., Kudo T. 1999. Phylogenetic diversity of nitrogen fixation genes in the symbiotic microbial community in the gut of diverse termites. Appl. Environ. Microbiol. V?? p. 4926-4934
7. Widmer F., Shaffer B.T., Porteous L.A., Seidler R.J. 1999. Analysis of nifH gene pool complexity in soil and litter at a Douglas fir forest site in the Oregon Cascade Mountain Range. Appl. Environ. V. p.374-380.
Эгаектрфный-зч^рнал-«ИССЛЕДОВАНО В -РОССИИ»............1158...................-1тНр :/Ытшта1ч>е и 1ага.ш/аЙ1ск5Й000Ю83 .рЩ
ИйЗЧй-дор ожек...................1 ■ -2--3 -4 - 5-6 -7■ -8--9-■ 1 11■ 12-13-14%
Рисунок1. ■ ПЦР-на■ препаратах ДНКразли чных■ азот фиксирующих■ бактерий-применением■ ^^
1 -маркер молекулярной-массы ДНК■ дшМЫГ; I ООЬр 2-■ $шШтЫи№:шШь' ' ШшШм
ШЙйй-, ■ ^■ИШШШ' ■ 1 1--Е§£}шэШ;-$8&, 12-
' 13-контрольная-ПЦР-е-отсутствие-матрицы?■ 14-маркер-молекулярной-массы-
ДНК- О^шШЫ-1 ооьр (Е$тяйШ$), ■ И
и
ИйЛй-дор ожек.........1 ■■ -2—3-4- -5 ■б - -8- ■■9■ 10-11 ■ 12-13-14
Рисунок-2. ■ ПЦР-на ■ препаратах ДНКразли чных- азот фиксирующих ■ бактерий ■ с ■ применением Р2-К6^
ДНК- 1 ооьр (£$жт.Ш)> ■ А
