CC BY
31
Микробиология и эпидемиология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 79-84
УДК 577
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНОЙ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОТКРЫТОЙ РАМКИ СЧИТЫВАНИЯ ГЕНА КАПСИДНОГО БЕЛКА VP7 РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А И ЕЕ АНАЛИЗ
© 2012 г. Т.А. Сашина 12, О.В. Морозова \ С.Г. Фомина \
Н.В. Епифанова 1, Н.А. Новикова 12
1 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной 2 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
tatyana.sashina@gmail.com
Поступила в редакцию 12.04.2012
Разработан метод амплификации перекрывающихся фрагментов 9-го гена ротавирусов группы А для определения полной нуклеотидной последовательности ОРС гена капсидного белка VP7. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена VP7 позволил отнести нижегородские изо-ляты ротавируса к сублинии G1-II-E.
Ключевые слова: ротавирусы, полимеразная цепная реакция, праймер, нуклеотидная последовательность, генотип G1P[8], белок VP7, сублиния.
Введение
Актуальность изучения особенностей эволюции ротавирусов обусловлена широкой распространенностью ротавирусной инфекции. По данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется более 180 млн. заболеваний ротавирусной диареей и около 600 тыс. из них - с летальным исходом. Ротавирусы (семейство Reoviridae, род Rotavirus) поражают население разных возрастных групп, преимущественно болеют дети в возрасте до 5 лет [1].
Белки VP7 и VP4, формирующие наружный капсид вириона и выступы на его поверхности, используют в бинарной классификации ротави-русов. На основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих эти белки, ро-тавирусы классифицируют по G- и P-генотипу. У человека и животных различают не менее 27 G (VP7) и 34 P (VP4) генотипов. Эпидемиологические исследования, проведенные в разных странах, показали, что генотип G1 является наиболее широко распространенным, чаще всего встречается комбинация с P[8] генотипом [1-4].
Генетический и антигенный дрейф вирусов считают важными механизмами, обусловленными специфическим иммунологическим давлением. Положительный отбор мутации в определенных эпитопах вируса постоянно генерирует его разнообразие. Анализ аминокислотной последовательности белка VP7 ротавирусов показал наличие в ее составе высоковариабель-
ных регионов (УШ-УЯ9) у различных сероти-пов. Четыре таких региона рассматриваются в качестве основных антигенных сайтов, а именно регион А (87-101 а.о.), В (143-152 а.о.), С (208-223 а.о.) и F (235-242 а.о.) [4, 5].
Цель настоящей работы - разработка метода амплификации перекрывающихся фрагментов 9-го гена ротавирусов группы А с использованием полимеразной цепной реакции для определения полной нуклеотидной последовательности ОРС (открытой рамки считывания) гена капсидного белка VP7 и анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка УР7.
Экспериментальная часть
Выделение РНК ротавирусов и постановку реакции обратной транскрипции проводили с использованием комплектов реагентов «РИБО-сорб» и «РЕВЕРТА» производства ФБУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению.
Наработку фрагментов кДНК гена VP7 проводили методом ПЦР в объеме 30 мкл в режиме: 94оС - 1 мин, (94оС - 10 с, 55оС - 10 с, 72оС - 10 с) х 42 цикла, 72оС - 1 мин в ампли-фикаторе «Терцик» фирмы «ДНК-Технология». Фрагменты очищали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с использованием трис-боратной буферной системы. Фрагменты кДНК выделяли из агарозного геля с использованием спин-колонок производства ООО «Цитокин», С.-Петербург.
В ходе работы секвенировали кДНК гена VP7 3-х нижегородских изолятов ротавирусов с 1-м, 3-м и 4-м электрофоретипами РНК, обнаруженных у детей с острым гастроэнтеритом.
Определение первичной структуры кДНК осуществляли по двум цепям с использованием специфических праймеров, набора для постановки реакции секвенирования DTCS Quick Start Kit и системы генетического анализа Beckman Coulter CEQ 8000, согласно рекомендациям производителя.
Компьютерный анализ. Выравнивание нук-леотидных последовательностей для теоретического анализа праймеров проводили с использованием программы MEGA 5.05 по алгоритму ClustalW. Для анализа вторичной структуры и определения температуры плавления праймеров использовали программу Oligo 4.0.
Филогенетический анализ штаммов осуществляли при помощи программы MEGA 5.05 по алгоритму Neighbor-joining, модель эволюции Kimura [6].
Нуклеотидные последовательности. В работе были использованы нуклеотидные последовательности гена VP7 ротавирусов человека, представленные в базе данных GenBank под номерами: K02033, D16323, U26366, U26376, U26367, HQ738579, GU377206, HQ650124, GU377156, JF460839, EF495124, HM773895, DQ904525, GU377138, EF079064, EF079066, DQ377598, DQ377596, JN232049, AB081799,
DQ377579, Z80278, S83903, Z80303, DQ377578, JF490869, Щ392051, GU392990, AF480295, DQ377575.
Результаты и их обсуждение
Разработка метода амплификации фрагментов гена VP7 на основе ПЦР. Важным элементом, определяющим эффективность поли-меразной цепной реакции, являются олигонук-леотидные праймеры. Подбор и оценка компле-ментарности праймеров, консервативности соответствующих им участков, размера фланкируемого фрагмента проводились на основе выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP7 ротавирусов группы А, представленных в базе данных GenBank.
На первом этапе работы был проведен анализ праймеров 9Fbeg и 9Rend, разработанных И.Н. Бессараб с соавторами в 1990 году для амплификации фрагмента 9-го сегмента генома ротавирусов, фланкирующих участок размером 888 п.н. (ОРС гена VP7) [7]. Выравнивание данных праймеров с нуклеотидными последовательностями генома ротавирусов G1-G4 генотипов показало необходимость модификации обратного праймера, в который была введена вырожденность по основанию в позиции 925 (табл. 1).
На следующем этапе работы были подобраны праймеры, позволяющие разбить последовательность гена VP7 на два перекрывающихся фрагмента, длина которых позволила проводить
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности гена VP7 ротавирусов генотипов G1-G4 в местах посадки праймеров 9Fbeg и 9Rend
Штамм G-генотип Последовательность 5'-3' н.о. 49-68 Последовательность 5'-3' н.о. 936-917
Wa G1 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAGTGGTGGCAAGT
K2 G1 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
Ban-59 Bangladesh G1 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAGATGGTGGCAAGT
Isr-56 Israel G1 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
Brz-5 Brazil G1 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAGATGGTGGCAAGT
Nov07-1831 2007 Russia G1 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
08OT10 2008 Japan G1 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAGATGGTGGCAAGT
DS-1 1976 USA G2 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
Nov08-2929 2008 Russia G2 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
F01498 2009 Belgium G3 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAGAAATGGTGGCAAGT
Rus-37 2001-2003 Russia G3 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAGAAATGGTGGCAAGT
DC4320 1988 USA G4 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
J-4624 2001-2003 Japan G4 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
Nov04-H360 2004 Russia G4 ATGTATGGTATTGAATATAC TGGAAAAAATGGTGGCAAGT
9Fbeg - ATGTATGGTATTGAATATAC -
9Rend к - - TGGAAAARATGGTGGCAAGT
*к - последовательность олигонуклеотида, обратно комплементарная праймеру.
секвенирование с использованием системы генетического анализа Beckman Coulter CEQ 8000. Для поиска региона посадки праймеров было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей гена VP7 ротавирусов G1-G4 генотипов (табл. 2). Поскольку в последовательности выбранных участков показаны замены нуклеотидов, были разработаны праймеры 9Fmid и 9Rmid, вырожденные по двум и одному нуклеотидам соответственно.
Подобранные пары праймеров 9Fend-9Rmid и 9Fmid-9Rend фланкировали перекрывающиеся участки длиной 572 и 398 п.н. (рис. 1).
С помощью программы Oligo 4.0 была ориентировочно подсчитана температура плавления праймеров и проведен анализ их вторичной структуры. Параметры температуры отжига были скорректированы эмпирически в диапазоне
45-55°С с шагом 2°С в ходе постановки пробных ПЦР с использованием клинических проб, содержащих РНК ротавируса. Наработка фрагментов нужной длины шла при любой температуре отжига в указанном диапазоне (рис. 2). В окончательном варианте программа имела вид: 94оС - 1 мин (94оС - 10 с, 50оС - 10 с, 72оС - 10 с) х 42 цикла, 72оС - 1 мин.
С использованием оптимизированных и разработанных праймеров была проведена амплификация фрагментов гена VP7 3-х нижегородских изолятов. Фрагменты кДНК были секвени-рованы по двум цепям.
Филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей. Группой японских исследователей предложена схема класси-
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности гена VP7 ротавирусов генотипов G1-G4 в местах посадки праймеров 9Fmid и 9Rmid
Штамм G-генотип Последовательность 5'-3' н.о. 539-556 Последовательность 5'-3' н.о. 620-602
Wa G1 GGTTATGTAACCCAATGG GGATATCGATGGGATCATC
K2 G1 GGTTATGCAACCCAATGG GGATATCGATGGGATCATC
Ban-59 Bangladesh G1 GGTTATGCAATCCAATGG GGATATCAATGGGATCATC
Isr-56 Israel G1 GGTTATGCAACCCAATGG GGATATCGATGGGATCATC
Brz-5 Brazil G1 GGTTATGTAACCCAATGG GGATATCGATGGGATCATC
Nov07-1831 2007 Russia G1 GGTTATGTAATCCAATGG GGATATCAATGGGATCATC
08OT10 2008 Japan G1 GGTTATGTAATCCAATGG GGATATCAATGGGATCATC
DS-1 1976 USA G2 GGCTGTGCAATCCTATGG GGATATCGATGGGAACAGC
Nov08-2929 2008 Russia G2 GGCTGTGCAATCCTATGG GGATATCAATGGGAACAGC
F01498 2009 Belgium G3 GGTTATGTAATCCTATGG GGATTTCAATGGGATCATC
Rus-37 2001-2003 Russia G3 GGTTATGTAATCCTATGG GGATTTCAATGGGATCTTC
DC4320 1988 USA G4 GGTTATGTAATCCAATGG GGATATCAATGGGATCATC
J-4624 2001-2003 Japan G4 GGTTATGCAATCCAATGG GGATATCAATGGGATCATC
Nov04-H360 2004 Russia G4 GGTTATGCAATCCAATGG GGATATCAATGGGATCATC
9Fmid - GGTTATGYAATCCWATGG -
9Rmid к - - GGATATCRATGGGATCATC
572 п.н
9Fbeg 9Rmid 917 936
49 68 i602 620 9Fmid 9Rend
398 п.н
Рис. 1. Схема посадки праймеров на последовательность гена VP7 ротавирусов
Рис. 2. Электрофореграмма фрагментов к ДНК гена УГ7 ротавирусов: 1-3 - пробы, содержащие кДНК генома ротавирусов, I и II - фрагменты длиной 572 и 398 н.п., М - маркер размерности ДНК PUC/MSP с шагом 100 п.н.
71
74
ЭЗ
52
52
71
69
■ NNov 3718 G1-3 1987 —
■ NNov 1407 G14 1984 — Fin-111-1 Finland
i— Fin-408 Finland 1— PAF166/94 Italy 1994 — ■ NNov 9385 G1-4 1997-98-GER125-08 Germany 2008 VU06 USA 2006 BEL2006 Belgium 2006 R144 Brazil 1999
1,1%
1.8%
1,8%
|~CaU007 Japan
PA10/95 Italy 1995 7014/JP Japan 2005-06 7265/JP Japan 2005-06 PA2/04 Italy 2004 PA5/03 Italy 2003 Mvd9607 Uruguay 1996-1999 97 i—PA67/93 Italy 1993
,-Egypt-7 Egypt -
-jd ,— PA8/01 Italy -
^P— Mvd9810 Uruguay -
-Fin-110 Finland -
i— 88H249 Japan -
1— Ban-59 Bangladesh -
-Wa USA 1974 -
-AU19 Japan -
84'
} II D
> IIC
> II В
> IIA
VIII
IX
V
VI
VII
IV
93 г
|
55 1-
53 56
85 |
64 1-
64'- 59 1-
45
47
951-
> >
■ 7014/JP Japan 2005-06
■ 7265/JP Japan 2005-06
■ PA2/04 Italy 2004
■ PA5/03 Italy 2003 I NNov 3718 G1-3 1987 —
• R144 Brazil 1999 II D -AU007 Japan II D
■ PA10/95 Italy 1995 II D ■Fin-111-1 Finland II E
I NNov 1407 G1-1 1984 —
■ Fin-408 Finland II E
■ PAF 166/94 Italy 1994 II E I NNov 9385 G1-4 1997-98
• VU06 USA 2006 II E
■ BEL2006 Belgium 2006II E
■ GER125-08 Germany 2008 II E
■ Mvd9607 Uruguay 1996-1999
■ PA67/93 Italy 1993
•Wa USA 1974 -
II В
2,4%
1,7%
VllE
2,4%
D, E
>
Рис. 3. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклео-тидной последовательности гена VP7 (а) и аминокислотной последовательности белка VP7 (б). Справа от деревьев указаны различия нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. А, В, С, D, Е - сублинии линии 01-II, выделенные при анализе нук-леотидной последовательности гена VP7
а
б
фикации ротавирусов Gl-генотипа, включающая 11 линий (I-XI) и 17 сублиний, с помощью которой могут быть классифицированы ротави-русы по всему миру. Каждая линия формирует отдельный кластер, критерием для их выделения служит различие нуклеотидных последовательностей гена VP7 5% и выше. Сходство нуклеотидных последовательностей гена VP7 в каждой сублинии составляет 98-100% [5]. На филогенетическом дереве, построенном на основе нуклеотидных последовательностей гена VP7, выявленные в Нижнем Новгороде штаммы группировались с представителями сублинии Gl-II-Е (рис. 3а). Различие нуклеотидных последовательностей не превысило 2% и составило (1.1-1.8)%, что позволило отнести их к данной сублинии.
Филогенетический анализ на основе аминокислотных последовательностей. На основе полученных нуклеотидных последовательностей, а также последовательностей, размещенных в базе данных GenBank, были выведены аминокислотные последовательности, которые подвергались сравнительному анализу с использованием программы MEGA 5.05.
Кластеризация нижегородских изолятов на основе аминокислотных последовательностей белка VP7 не совпадает с сублиниями, выделенными на основе нуклеотидных последовательностей. На рис. 36 видно, что только нижегородский изолят ротавируса с 4-м электрофо-ретипом группировался с представителями сублинии G1-II-E, изолят с 3-м электрофоретипом оказался близким с представителями G1-II-D, а изолят с 1 -м электрофоретипом составил отдельную группу со штаммом, выделенным в Финляндии. Различие аминокислотных последовательностей белка VP7 ротавирусов, выявленных в Нижнем Новгороде, составило (1.7-2.4)%. Таким образом, в пределах одной сублинии G1 различия в аминокислотной последовательности белка VP7 могут достигать 2.4%.
Заключение
Анализ установленной с использованием разработанного метода нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок наружного капсида VP7, показал, что ротавирусы генотипа G1P[8], циркулирующие на территории Нижнего Новгорода, являются представителями сублинии G1-II-E. Показан уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей, не превышающий 2%, в то время как различие аминокислотных последовательностей может достигать 2.4%, что затрудняет однозначное отнесение их к данной сублинии и расширяет наши представления о вариабельности аминокислотной последовательности белка VP7 рота-вирусов генотипа G1P[8].
Список литературы
1. Hyser J.M., Estes M.K. Rotavirus vaccines and pathogenesis: 2008 // Curr. Opin. Gastroenterol. 2009. V. 25. P. 36-43.
2. Gray J., Vesikari T., Van Damme P. et al. Rotavirus // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2008. V. 46. P. 24-31.
3. http://rotac.regatools.be/classificationinfo.html (дата обращения: 03.04.2012)
4. Arista S., Giammanco G.M., De Grazia S. et al. Heterogeneity and temporal dynamics of evolution of G1 human rotaviruses in a settled population // J. Virol. 2006. V. 80. P. 10724-10733.
5. Phan T.G., Khamrin P., Quang T.D. et al. Detection and genetic characterization of group A rotavirus strains circulating among children with acute gastroenteritis in Japan // J. Virol. 2007. V. 81. P. 4645-4653.
6. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum Parsimony methods // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. P. 2731-2739.
7. Бессараб И.Н., Новикова Н.А., Бородин А.М. Использование полимеразной цепной реакции для анализа ротавирусов. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего основной нейтрализующий антиген VP7 ротавируса человека нового G-серотипа // Биоорганическая химия. 1990. Т. 16. № 12. С. 1689-1692.
DETERMINATION OF COMPLETE NUCLEOTIDE SEQUENCE OF THE OPEN READING FRAME OF CAPSID PROTEIN VP7 ENCODING GENE OF GROUP A ROTAVIRUSES AND ITS ANALYSIS
T.A. Sashina, O.V. Morozova, S. G. Fomina, N.V. Epifanova, N.A Novikova
A method for amplification of overlapping fragments of the 9th gene of group A rotaviruses has been developed to determine the complete nucleotide sequence of ORF of capsid protein VP7 encoding gene. Phylogenetic analysis of VP7 gene nucleotide sequence allowed to attribute rotavirus isolates from Nizhni Novgorod to the sublineage G1-II-E.
Keywords: rotaviruses, polymerase chain reaction, primer, nucleotide sequence, genotype G1P[8], protein VP7, sublineage.
